一種適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于流式細(xì)胞術(shù)檢測領(lǐng)域，提供一種適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品的制備方法。該方法包括：裂解步驟：將菊花組織樣品進(jìn)行裂解處理、過濾處理、離心處理，得到待染色的細(xì)胞核；染色步驟：對所述待染色的細(xì)胞核進(jìn)行染色處理，得到染色的細(xì)胞核。本發(fā)明針對菊花流式細(xì)胞術(shù)分析采用了適當(dāng)?shù)募?xì)胞裂解緩沖液，能夠有效地去除菊花完整的細(xì)胞核中殘留的胞質(zhì)碎片，保持細(xì)胞核在懸浮液中的穩(wěn)定并阻止凝集；并保護(hù)DNA不被降解；并提供適合的環(huán)境用來進(jìn)行專一的核DNA化學(xué)染色，有效地降低胞質(zhì)成分對染色的負(fù)面影響；本發(fā)明中，樣品制備流程的優(yōu)化有效的減少了上機(jī)測試中雜峰的出現(xiàn)，提高了檢測結(jié)果的精確性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
【專利說明】一種適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于流式細(xì)胞術(shù)檢測領(lǐng)域，特別涉及一種適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品的 制備方法，該方法通過針對菊花配制合適的細(xì)胞裂解緩沖液等反應(yīng)液，得到合適的用于流 式細(xì)胞術(shù)分析的菊花樣品。

【背景技術(shù)】
[0002] 菊花（chrysanthemum morifolium)是菊科（compositae)菊屬（chrysanthemum) 植物，原產(chǎn)我國，是中國傳統(tǒng)十大名花和世界四大切花之一，也是北京市的市花。我國是栽 培菊花的起源中心和菊屬種質(zhì)資源的分布中心（李辛雷，2004)，野生資源和栽培品種十分 豐富，其瓣型花型變異繁多。在一千六百多年的栽培和應(yīng)用歷史過程中形成了大量色彩豐 富且姿態(tài)各異的品種，不僅可用于觀賞，而且廣泛用于食用、藥用和茶用。確定一些具有重 要研究價值和經(jīng)濟(jì)性狀的菊花物種的基因組大小，無論對將來的菊花全基因組測序還是其 起源進(jìn)化研究以及雜交育種工作等方面均能提供有價值的參考。菊花細(xì)胞染色體倍性的了 解對于品種的鑒定、雜交組合的選配、雜交后代材料的提前篩選、親緣關(guān)系的鑒定等均具有 十分重要的意義。
[0003] 流式細(xì)胞術(shù)從1980開始作為一項重要的技術(shù)應(yīng)用到植物研究中，其主要用途在 于用來估計核DNA含量，確定植物染色體倍性和細(xì)胞周期分析（Galbraith，2004 ;Shapiro， 2004 ;Bennett and Leitch，2005)。流式細(xì)胞術(shù)與其他傳統(tǒng)的方法相比具有快速、方便和精 確的特點（Dolez V el and Bartos, 2005)。流式細(xì)胞術(shù)的普及主要得益于相對簡單的樣品 準(zhǔn)備方法，簡要的方法主要包括三步：（1)將植物組織樣品在適合的緩沖液中切碎，釋放細(xì) 胞核。（2)用熒光染料對細(xì)胞核進(jìn)行染色，定量的與DNA結(jié)合，因此基因組越大，DNA染色也 越多。（3)染色的細(xì)胞核上機(jī)檢測。通過與已知基因組大小的植物物種比較熒光染色量的 多少，得出被測樣品的基因組大小。
[0004] 樣品制備中最重要的環(huán)節(jié)是將植物組織在細(xì)胞核裂解液中均勻的粉碎 (Galbraith et al.，1983)。細(xì)胞裂解緩沖液應(yīng)該能夠去除完整的細(xì)胞核中殘留的胞質(zhì) 碎片，保持細(xì)胞核在懸浮液中的穩(wěn)定并阻止凝集。細(xì)胞裂解緩沖液還應(yīng)該保護(hù)DNA不被 降解，并提供適合的環(huán)境用來進(jìn)行專一的核DNA化學(xué)染色，盡可能降低胞質(zhì)成分對染色 的負(fù)面影響。L 〇Ureir〇(2006a)等系統(tǒng)的比較了四種常用的不同化學(xué)組分的核游離緩沖 液：Galbraith (Galbraith et al.，1983) LBOl (Dolez "el et al.，1989) Otto (Mlrich andM lrich，1991 ;Dolez v el and Go -- hde，1995) Tris，MgC12 (Pfosser et al.，1995)。由 于植物組織在結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成上的多樣性，很難有一種單一的緩沖液很好地適用于所有物 種（Dolez V el and Bartos ' 2005)。許多實驗室傾向于研發(fā)自己的細(xì)胞裂解緩沖液配方。
[0005] 菊花由于其品種變異豐富，分布廣泛，形態(tài)各樣，它的起源及遺傳背景相比其它眾 多植物要復(fù)雜得多，導(dǎo)致有些品種的菊花在用常規(guī)細(xì)胞裂解緩沖液處理時不能得到理想的 效果，因此需要針對菊花特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特點改進(jìn)細(xì)胞裂解緩沖液和染色液，最終 制備得到的樣品適用于流式細(xì)胞儀的分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品 的制備方法，可以得到合適的用于流式細(xì)胞術(shù)分析的菊花樣品。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0008] -種適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，包括以下步驟：
[0009] 裂解步驟：將菊花組織樣品進(jìn)行裂解處理、過濾處理、離心處理，得到待染色的細(xì) 胞核；
[0010] 染色步驟：對所述待染色的細(xì)胞核進(jìn)行染色處理，得到染色的細(xì)胞核。
[0011] 進(jìn)一步地，所述菊花的種類為甘菊、異色菊、亞菊、毛華菊、朝鮮菊、日本雛菊、紊 蒿、紫花野菊。
[0012] 進(jìn)一步地，所述裂解步驟中，菊花組織樣品為菊花未開花植株上部的新生幼嫩葉 片。
[0013] 進(jìn)一步地，所述裂解步驟的裂解處理中，采用的細(xì)胞裂解緩沖液包括如下組分：
[0014] 15mM的MOPS緩沖液，2mM的乙二胺四乙酸二鈉，0. 5mM的四鹽酸精胺，80mM的氯化 鉀，20mM的氯化鈉，0-1 % (v/v)的聚乙二醇單辛基苯基醚，0-1 % (w/v)的聚乙烯批咯燒酮 (平均分子量為10,000)，0-0. 2 % (v/v)的P -巰基乙醇；所述細(xì)胞裂解緩沖液的pH值為 7. 5。
[0015] 進(jìn)一步地，所述裂解步驟的裂解處理中，采用的細(xì)胞裂解緩沖液包括如下組分：
[0016] 15mM的MOPS緩沖液，2mM的乙二胺四乙酸二鈉，0. 5mM的四鹽酸精胺，80mM的氯 化鉀，20mM的氯化鈉，0. 1% (v/v)的聚乙二醇單辛基苯基醚，1% (w/v)的聚乙烯批咯燒 酮（平均分子量為1〇,〇〇〇)，〇. 1% (v/v)的￠-巰基乙醇；所述細(xì)胞裂解緩沖液的pH值為 7. 5。
[0017] 進(jìn)一步地，所述裂解步驟的離心處理中，轉(zhuǎn)速為900-3000rpm rpm，溫度為4°C，時 間為3-10分鐘。
[0018] 進(jìn)一步地，所述裂解步驟的離心處理中，轉(zhuǎn)速為1300rpm rpm，溫度為4°C，時間為 10分鐘。
[0019] 進(jìn)一步地，根據(jù)權(quán)利要求1或2所述適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，所述 染色步驟的染色處理中，采用的染色液含有50 y g/ml的Rnase A、50 y g/ml的碘化丙陡。
[0020] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下有益效果：
[0021] 1、因為本發(fā)明針對菊花流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)行了細(xì)胞裂解緩沖液的配制，所以能夠 有效地去除菊花完整的細(xì)胞核中殘留的胞質(zhì)碎片，保持細(xì)胞核在懸浮液中的穩(wěn)定并阻止凝 集，保護(hù)DNA不被降解，并提供適合的環(huán)境用來進(jìn)行專一的核DNA化學(xué)染色，有效地降低胞 質(zhì)成分對染色的負(fù)面影響。
[0022] 2、本發(fā)明中，樣品制備流程的優(yōu)化有效的減少了上機(jī)測試中雜峰的出現(xiàn)，提高了 檢測結(jié)果的精確性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖 1 :實施例 1 中，突光微球（Flow-Check? Fluorospheres)校準(zhǔn)圖。
[0024] 圖2 :實施例1中，甘菊（C. lavandii lifolium)葉部照片及流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。
[0025] 圖3 :實施例1中，異色菊（C. dichrum)葉部照片及及流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。
[0026] 圖4 :實施例1中，亞菊（C. glabriuscii Ium)葉部照片及及流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。
[0027] 圖5 :實施例1中，毛華菊（C. vestitum)葉部照片及及流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。
[0028] 圖6 :實施例1中，朝鮮菊葉部照片及流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。
[0029] 圖7 :實施例1中，日本雛菊葉部照片及流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。
[0030] 圖8 :實施例1中，紊蒿葉部照片及流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。
[0031] 圖9 :實施例1中，紫花野菊（C. zawadskii)葉部照片及流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。

【具體實施方式】
[0032] -種適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，包括以下步驟：
[0033] 第一步、裂解步驟：將菊花組織樣品進(jìn)行裂解處理、過濾處理、離心處理，得到待染 色的菊花細(xì)胞核。
[0034] 具體來說，該步驟具體包括以下操作：
[0035] A、取菊花葉片，放入盛有預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液的培養(yǎng)皿（優(yōu)選直徑為6cm)中， 將菊花葉片用鋒利的刀片在Imin內(nèi)切為碎片；
[0036] 菊花種類為：甘菊、異色菊、亞菊、毛華菊、朝鮮菊、日本雛菊、紊蒿、紫花野菊；菊 花葉片選取菊花未開花植株上部新生幼嫩葉片；
[0037] 菊花葉片和細(xì)胞裂解緩沖液的質(zhì)量體積（w/v)比為1-10 :100(比如為1:100、 2:100、3:100、4:100、5:100、6:100、7:100、7. 5:100、8:100、9:100、10:100 等中任意或任意 兩者之間的范圍，優(yōu)選為5:100)，該質(zhì)量體積比（w/v)的含義為：菊花葉片的質(zhì)量與胞裂解 緩沖液的體積之間的比例；
[0038] 細(xì)胞裂解緩沖液是以LB01(Dolez V el et al. (1989))裂解液為基礎(chǔ)加入15mM 的MOPS替換Tris，并加入1% (w/v)的pvp-10、0.1% (v/v)的￠-巰基乙醇，調(diào)PH值為 7. 5。LBOl 裂解液的組分為：15mM 的 Tris，2mM 的 Na2EDTA, 0? 5mM 的 spermine. 4HC1，80mM 的 KC1，20mM 的 NaCl，0. 1% (v/v)的 TritonX-100, pH 8. 0 ;
[0039] 改進(jìn)之后，本發(fā)明的細(xì)胞裂解緩沖液包括以下組分：
[0040] 15mM 的 MOPS，2mM 的 Na2EDTA, 0? 5mM 的 spermine. 4HCL，80mM 的 KCl，20mM 的 NaCl， 0-1% (v/v)的 TritonX-100,0-1% (w/v)的 pvp-10,0-0.2% (v/v)的 巰基乙醇，pH 7. 5 ；
[0041] 以上組分中，TritonX-100的體積百分比可以為0? 01%、0. 02%、0. 03%、0. 04%、 0. 05%,0. 75%,0. 08%,0. 09%,0. 1%,0. 2%,0. 3%,0. 4%,0. 5%,0. 6%,0. 7%,0. 75%, 0. 8%、0. 9%、1%等中任意或任意兩者之間的范圍；該體積百分比為：配制細(xì)胞裂解緩沖 液時，加入的TritonX-100的體積與得到的細(xì)胞裂解緩沖液的體積之間的百分比。
[0042] pvp-10 的質(zhì)量體積百分比可以為 0? 01 %、0? 02 %、0? 03 %、0? 04 %、0? 05 %、 0. 75 %,0. 08 %,0. 09 %,0. 1 %,0. 2 %,0. 3 %,0. 4%,0. 5 %,0. 6 %,0. 7 %,0. 75%,0. 8%, 0.9%、1%等中任意或任意兩者之間的范圍；該質(zhì)量體積百分比（w/v)為：配制細(xì)胞裂解緩 沖液時，加入的pvp-10的質(zhì)量與得到的細(xì)胞裂解緩沖液的體積之間的百分比。
[0043] P -巰基乙醇的體積百分比可以為0? 01 %、0? 02 %、0? 03 %、0? 04 %、0? 05 %、 0. 75%、0. 08%、0. 09%、0. 1%、0. 13%、0. 15%、0. 18%、0. 2%等中任意或任意兩者之間的 范圍；該體積百分比為：配制細(xì)胞裂解緩沖液時，加入的￠-巰基乙醇的體積與得到的細(xì)胞 裂解緩沖液的體積之間的百分比。
[0044] 細(xì)胞裂解緩沖液配制完成后，再濾膜過濾，于4°C保存。
[0045] 細(xì)胞裂解緩沖液選擇上述組分是因為：
[0046] 上述MOPS和Tris均為有機(jī)緩沖液，有利于DNA的熒光染料染色；但MOPS的pKa 值為7. 2, Tris的pKa值為8. 1，MOPS在該細(xì)胞裂解緩沖液中的緩沖能力好于Tris ;
[0047] 上述Na2EDTA為螯合劑用來結(jié)合二價陽離子（常作為DNase的輔酶因子），防止 DNA被降解；
[0048] 上述四鹽酸精胺（spermine. 4HCL)為核染色質(zhì)穩(wěn)定劑，作用在于保持DNA的完整 性；
[0049] 上述聚乙二醇單辛基苯基醚（TritonX-IOO)為非離子去污劑有利于細(xì)胞核的釋 放并阻止其凝集；
[0050] 上述KCl、NaCl為無機(jī)鹽用來保持緩沖液穩(wěn)定的離子強(qiáng)度；
[0051] 上述聚乙烯批咯燒酮（average mol wt 10, 000，平均分子量為10,000) (PVP-10) 為高分子化合物，主要作用在于減少多酚類物質(zhì)和其他次生代謝物如丹寧酸對于DNA熒光 染色的影響，并有效地減少菊花樣品中次生代謝物造成的峰圖質(zhì)量較差的問題；
[0052] P _巰基乙醇（P-mercaptoethanol)為有機(jī)化合物，主要作用是作為還原劑阻止 蛋白質(zhì)氧化和高分子聚合物，有效地阻止菊花樣品處理中易氧化的現(xiàn)象；
[0053] 上述細(xì)胞裂解緩沖液由于采用了合適的試劑配制，各種組分協(xié)同作用，有效地去 除菊花完整的細(xì)胞核中殘留的胞質(zhì)碎片，保持細(xì)胞核在懸浮液中的穩(wěn)定并阻止凝集；并保 護(hù)DNA不被降解；并提供適合的環(huán)境用來進(jìn)行專一的核DNA化學(xué)染色，有效地降低胞質(zhì)成分 對染色的負(fù)面影響。
[0054] B、再向碎片中加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液，釋放細(xì)胞核，得到細(xì)胞核懸浮液。
[0055] C、將細(xì)胞核懸浮液用300目尼龍網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞核濾液，再將細(xì)胞核濾液轉(zhuǎn)移 至塑料離心管。
[0056] D、將細(xì)胞核濾液于4°C轉(zhuǎn)速900-3000rpm進(jìn)行離心處理3-10min，棄上清保留沉 淀，該沉淀即為待染色的細(xì)胞核；
[0057] 以上離心處理的轉(zhuǎn)速可以為 900rpm、lOOOrpm、1300rpm、1500rpm、1700rpm、 2000rpm、2300rpm、2500rpm、2800rpm、3000rpm等中任意或任意兩者之間的范圍；以上離心 處理的時間可以為 3min、4min、5min、6min、7min、7. 5min、8min、9min、10min 等中任意或任 意兩者之間的范圍，優(yōu)選為5min。
[0058] 第二步、染色步驟：用熒光染料對待染色的細(xì)胞核進(jìn)行染色處理，得到染色的細(xì)胞 核。
[0059] 選用PI染色液作為熒光染料，該P(yáng)I染色液是濃度為50 iig/ml的碘化丙啶 (propidium iodide)的水溶液，該P(yáng)I染色液中還含有終濃度50ii g/ml的Rnase A。
[0060] 具體來說，該步驟具體包括以下操作：
[0061] 向待染色的細(xì)胞核中加入的PI染色液，混勻；再于4°C黑暗處放置5-40min (比如 為 5min、lOmin、15min、20min、25min、30min、35min、40min 等任意值或兩個任意兩者之間的 范圍），使PI染色液定量地與菊花DNA結(jié)合，得到染色的細(xì)胞核。
[0062] 第一、二步驟的樣品制備流程的優(yōu)化有效的減少了上機(jī)測試中雜峰的出現(xiàn)，提高 了檢測結(jié)果的精確性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
[0063] 第三步、檢測步驟：將染色后的細(xì)胞核在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測和分析。
[0064] 具體來說，該步驟具體包括以下操作：上機(jī)檢測中，先進(jìn)行熒光微球校準(zhǔn)，再檢測 細(xì)胞核的染色量，再利用軟件分析樣品基因組的大小。
[0065] 突光微球為Co ii Iter Flow-Check? Fluorospheres，的校準(zhǔn)為用488激光線性檢 測熒光微球HPCV〈3%;流式細(xì)胞儀的儀器型號：Cell Lab Quanta?SC(Beckman Coulter);
[0066] 參數(shù)設(shè)置：488nm激發(fā)光，電壓：4. 52V，激光功率：22mw，F(xiàn)L2激發(fā)光收集通道；流 速：30-50個細(xì)胞/s ;
[0067] 采用Quanta SC軟件對各個樣品的染色體大小進(jìn)行分析。
[0068] 上述 Tris, Na2EDTA, spermine. 4HC1, KC1, NaCl, TritonX-100, pvp-10 等化學(xué)試劑 購自Sigma-Aldrich公司，染色用propidium iodide購自Sigma-Aldrich公司，校準(zhǔn)用突 光微球Coulter Flow-Check? Fluorospheres購自貝克曼庫爾特公司，所述儀器Cell Lab QuantaTMSC購自貝克曼庫爾特公司；操作過程中使用的刀片、6cm培養(yǎng)皿、300目尼龍網(wǎng)購 自江晨宏偉生物技術(shù)公司。
[0069] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。對外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā) 明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0070] 實施例1 :
[0071] 一種適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，包括以下步驟：
[0072] (1)、取菊花葉片50mg，放入滴有Iml的預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液的培養(yǎng)皿中，將菊 花葉片用吉列雙面刀片在Imin內(nèi)切為碎片；
[0073] 菊花的種類為：甘菊、異色菊、亞菊、毛華菊、朝鮮菊、日本雛菊、紊蒿、紫花野菊； 菊花葉片選取菊花未開花植株上部新生幼嫩葉片；
[0074] 細(xì)胞裂解緩沖液的組分為：
[0075] 15mM 的 MOPS，2mM 的 Na2EDTA, 0? 5mM 的 spermine. 4HCL，80mM 的 KCl，20mM 的 NaCl， 0.1<%(￥/￥)的1'1'；[1：011)(-100，1(%(￥/￥)的卩￥卩-10,0.1 (%(￥/￥)的6-巰基乙醇，卩117.5;
[0076] (2)、再向碎片中加入Iml預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液，釋放細(xì)胞核，得到細(xì)胞核懸浮 液；
[0077] (3)、將細(xì)胞核懸浮液用300目尼龍網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞核濾液，再轉(zhuǎn)移至一次性2ml 塑料離心管；
[0078] (4)、將細(xì)胞核濾液于4°C轉(zhuǎn)速1300rpm進(jìn)行離心處理5min，棄上清保留沉淀，該沉 淀即為待染色的細(xì)胞核；
[0079] (5)、向待染色的細(xì)胞核中加入400 ill的PI染色液，混勻；再于4°C黑暗處放置 IOmin,得到染色的細(xì)胞核；
[0080] (6)、將染色的細(xì)胞核在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測和分析。
[0081] 具體來說，該檢測和分析步驟具體包括以下操作：
[0082] 上機(jī)檢測中，先進(jìn)行熒光微球校準(zhǔn)，再檢測細(xì)胞核的染色量，再利用軟件分析樣品 基因組的大小。
[0083] 突光微球為Co ii Iter Flow-Check? Fluorospheres，的校準(zhǔn)為用488激光線性檢 測熒光微球HPCV〈3% ;圖1為熒光微球（Flow-Check? Fluorospheres)校準(zhǔn)的結(jié)果：
[0084]

【權(quán)利要求】
1. 一種適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，其特征在于：該方法包括以下步驟： 裂解步驟：將菊花組織樣品進(jìn)行裂解處理、過濾處理、離心處理，得到待染色的細(xì)胞 核； 染色步驟：對所述待染色的細(xì)胞核進(jìn)行染色處理，得到染色的細(xì)胞核。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，其特征在于：所述菊 花的種類為甘菊、異色菊、亞菊、毛華菊、朝鮮菊、日本雛菊、紊蒿、紫花野菊。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，其特征在于：所 述菊花組織樣品為菊花未開花植株上部的新生幼嫩葉片。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，其特征在于：所 述裂解步驟的裂解處理中，采用的細(xì)胞裂解緩沖液包括如下組分：15mM的MOPS緩沖液，2mM 的乙二胺四乙酸二鈉，0. 5mM的四鹽酸精胺，80mM的氯化鉀，20mM的氯化鈉，0-1% (v/v)的 聚乙二醇單辛基苯基醚，0-1% (w/v)的平均分子量為10000的聚乙烯吡咯烷酮，〇-〇. 2% (v/v)的P -巰基乙醇；所述細(xì)胞裂解緩沖液的pH值為7. 5。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，其特征在于：所述裂 解步驟的裂解處理中，采用的細(xì)胞裂解緩沖液包括如下組分：15mM的MOPS緩沖液，2mM的 乙二胺四乙酸二鈉，0. 5mM的四鹽酸精胺，80mM的氯化鉀，20mM的氯化鈉，0. 1% (v/v)的聚 乙二醇單辛基苯基醚，1% (w/v)的平均分子量為10000的聚乙烯吡咯烷酮，〇. 1% (v/v)的 3 -巰基乙醇；所述細(xì)胞裂解緩沖液的pH值為7. 5。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，其特征在于：所 述裂解步驟的離心處理中，轉(zhuǎn)速為900-3000rpm rpm，溫度為4°C，時間為3-10分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，其特征在于：所述裂 解步驟的離心處理中，轉(zhuǎn)速為1300rpm rpm，溫度為4°C，時間為10分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，其特征在于：所 述染色步驟的染色處理中，采用的染色液包括如下組分：50li g/ml的Rnase A，50ii g/ml的 碘化丙啶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，其特征在于：所 述染色步驟中的染色處理中，將所述待染色的細(xì)胞核中加入染色液后混勻，再于4°C黑暗處 放置5-40分鐘。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述適用于菊花的流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法，其特征在于：所述染 色步驟中的染色處理中，將所述待染色的細(xì)胞核中加入染色液后混勻，再于4°C黑暗處放置 10分鐘。
【文檔編號】G01N1/28GK104374617SQ201410553962
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】羅昌, 陳東亮, 黃叢林, 程曦, 梁宏霞, 蘇國輝, 黃敦輝 申請人:北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心