利用幼嫩子房對(duì)煙草單個(gè)植株進(jìn)行染色體制片的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了利用幼嫩子房對(duì)煙草單個(gè)植株進(jìn)行染色體制片的方法，其包括如下步驟：(1)取材；(2)預(yù)處理及固定；(3)后續(xù)采用直接涂片、酶解后壓片和涂片方法得煙草染色體制片。本方法選取煙草幼嫩子房為材料，進(jìn)行染色體制片，由于煙草花量大，且花期長(zhǎng)，有大量材料備選?？色@得的較多分裂相，部分分裂相染色體形態(tài)良好，適于進(jìn)行核型分析及染色體原位雜交等后續(xù)試驗(yàn)分析過(guò)程。本方法克服了利用煙草根尖制片時(shí)材料細(xì)小和材料稀少的缺點(diǎn)，尤其適用于對(duì)單個(gè)煙草植株進(jìn)行染色體制片。
【專(zhuān)利說(shuō)明】利用幼嫩子房對(duì)煙草單個(gè)植株進(jìn)行染色體制片的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明涉及一種利用幼嫩子房進(jìn)行煙草染色體制片的方法，特別適用于對(duì)單個(gè)煙草植株進(jìn)行染色體制片。

【背景技術(shù)】
[0002]植物染色體制片是進(jìn)行核型分析、帶型分析和染色體原位雜交等細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)，隨著近年來(lái)細(xì)胞遺傳學(xué)在植物分類(lèi)學(xué)及植物育種中的應(yīng)用，植物染色體制片的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。特別是在育種中，很多情況下，需對(duì)單個(gè)(株)材料進(jìn)行染色體制片，且制片質(zhì)量要求甚高，這在很大程度上提高了對(duì)染色體制片的要求，無(wú)疑也增加了染色體制片的難度。尤其是一些種子細(xì)小的植物材料，其制片難度更大。
[0003]目前，植物染色體制片大多采用根尖，少數(shù)采用幼嫩葉片及花器官的不同部分。煙草染色體研究中大多采用根尖進(jìn)行染色體制片，但其可能需大量根尖作為處理對(duì)象，方可獲得比較優(yōu)良的染色體標(biāo)本。但是煙草育種過(guò)程中，往往會(huì)獲得的部分具有染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目發(fā)生變異的特殊材料。在研究過(guò)程中，要求對(duì)這部分材料的每個(gè)單株進(jìn)行染色體制片。由于煙草種子細(xì)微，萌發(fā)后的根也較小，這給對(duì)單個(gè)植株進(jìn)行染色體制片造成極大的難度，且根尖的切取往往對(duì)植株造成不利的影響，如影響生長(zhǎng)勢(shì)、感染病菌等。
[0004]因此，開(kāi)發(fā)一種取材方便，可獲得較多分裂相的制片方法對(duì)在煙草育種中篩選染色體變異株系并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)研究有著非常廣闊的應(yīng)用前景。有學(xué)者報(bào)道采用葉片、組織培養(yǎng)材料進(jìn)行煙草染色體制片的方法。但是由于葉片多居間分生組織，無(wú)法獲得大量分裂相，不能滿(mǎn)足后續(xù)分析需要；而組織培養(yǎng)的材料含水量較高，且老化組織和幼嫩組織混合，也難以獲得良好的染色體制片。由于煙草花序發(fā)育較快，在單核小孢子期前子房生長(zhǎng)迅速。因此，選用這一時(shí)期的子房作為材料進(jìn)行染色體制片時(shí)合適的。且煙草花期較長(zhǎng)，有大量材料可供選擇進(jìn)行染色體制片。目前，還未見(jiàn)有關(guān)利用煙草幼嫩子房進(jìn)行染色體制片的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種取材方便，可獲得較多分裂相、分裂相染色體較為舒展的制片方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明擬采用如下技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明涉及一種利用幼嫩子房進(jìn)行煙草染色體制片的方法，其特征包括如下步驟:
[0007](1)取材:于花期對(duì)單個(gè)煙草植株進(jìn)行取材，取材時(shí)間為晴朗早上8:00-9:00之間，取材對(duì)象為幼小花蕾，以小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期花蕾為佳，因不同材料花蕾大小存在差異;
[0008](2)預(yù)處理及固定:用眼科鑷將花蕾取下，去掉花柄后放入裝有蒸餾水的小玻璃管中，輕輕振蕩使花蕾浸入溶液中。后置于4°C冰箱放置18-24h (溫度及時(shí)間可根據(jù)染色體形態(tài)自行調(diào)整)，吸出蒸餾水，加入卡洛氏固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，固定過(guò)夜；
[0009](3)后續(xù)采用直接涂片、酶解后壓片或涂片方法得煙草染色體制片。
[0010]任選地，壓片后直接觀(guān)察，獲得良好中期分裂相，如需后續(xù)試驗(yàn)和長(zhǎng)期保存，可采用常規(guī)方法揭片；直接涂片和酶解后涂片還包括染色步驟:用5%吉姆薩溶液進(jìn)行染色，染色體時(shí)間控制在30秒至1分鐘之間。
[0011]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的直接涂片包括如下步驟:從玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科鑷剝?nèi)セㄝ?、花冠、雄蕊和柱頭；用鑷子夾取子房使其碎裂為小塊，用鑷尖夾取小塊組織并滴加少量卡洛氏固定液于鑷尖，直接在清潔、干燥的載玻片上涂抹，待材料涂布均勻后，滴加一滴固定液于涂布好材料的載玻片上，將固定液沿載玻片一端輕輕吹散開(kāi)；于酒精燈火焰上微烤至固定液呈液滴狀即可。
[0012]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的酶解壓片、涂片包括如下步驟:
[0013](4)酶解:從玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科鑷剝?nèi)セㄝ?、花冠、雄蕊和柱頭，切除花托，并將子房分解為合適大小(邊長(zhǎng)約1-1.5毫米的方形塊)后置于離心管中，力口入蒸餾水清洗2次，后加入蒸餾水浸泡約20分鐘，吸出蒸餾水，加入混合酶液(3%纖維素酶+0.03%果膠酶，不同廠(chǎng)家、批次的酶液可適當(dāng)調(diào)節(jié)濃度)，酶和子房體積比為8-12:1，浸沒(méi)材料，震蕩使組織塊在酶液中懸浮，于35°C恒溫箱中放置，1.0-1.5小時(shí)(可根據(jù)材料調(diào)整)后取出；
[0014](5)低滲處理:酶解后的材料從恒溫箱中取出后，尖嘴吸管吸出酶液，加入蒸餾水，放置10-15分鐘后吸出蒸餾水，加入卡洛氏固定液；
[0015](6)壓片:用鑷子小心夾取材料，至于清潔干燥的載玻片中央，滴加一滴卡包品紅染色液，用鑷子反復(fù)夾取材料使其分散于染液中，染色約1分鐘后，夾取清潔蓋玻片常規(guī)方法壓片即可。
[0016]可選擇地:
[0017](7)涂片:用鑷子夾取材料，并于鑷尖滴加卡洛氏固定液，在清潔的載玻片上快速涂抹，待材料涂布均勻后，滴加一滴卡洛氏固定液于載玻片上涂布有材料區(qū)域的中央，將固定液沿四周輕輕吹散開(kāi)，酒精燈火焰上微烤至固定液呈液滴狀即可。
[0018]本方法選取開(kāi)花期幼嫩的子房為材料，進(jìn)行染色體制片，由于煙草花量大，且花期長(zhǎng)，有大量材料可供備選。且提供直接涂片、酶解后壓片及涂片等方法進(jìn)行制片，其中直接涂片染色體舒展、背景淺、形態(tài)佳，可進(jìn)行核型分析，缺點(diǎn)是染色體易丟失、雜質(zhì)較多；酶解后壓片，材料丟失少獲得的中期分裂相多，且染色體形態(tài)較好，較適于進(jìn)行核型分析及染色體原位雜交等后續(xù)分析過(guò)程；酶解后涂片，可獲得較多中期分裂相，染色體較為舒展，背景較淺，適于進(jìn)行核型分析及染色體原位雜交等后續(xù)分析過(guò)程。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
:
[0019]圖1五倍體煙草(2n = 5x = 58)取材示意；
[0020]圖2五倍體煙草(2n = 5x = 58)直接涂片獲得中期分裂相(1000X，標(biāo)尺:5微米)；
[0021]圖3五倍體煙草(2n = 5x = 58)酶解后壓片效果(左:200 X，標(biāo)尺:50微米；右:1000 X，標(biāo)尺:10微米)，左圖可見(jiàn)大量中期分裂相(箭頭所指)；
[0022]圖4五倍體煙草(2n = 5x = 58)酶解后涂片獲得中期分裂相(1000X，標(biāo)尺:10微米)；
[0023]圖5經(jīng)酶解子房后涂片獲得六倍體煙草(2n = 6χ = 72)和野生二倍體煙草(2η=2χ = 20)中期分裂相(1000X，標(biāo)尺:10微米)。

【具體實(shí)施方式】
:
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0025]實(shí)施例1 (五倍體煙草、六倍體煙草及野生二倍體煙草的染色體制片)
[0026]1、取材:于初花期對(duì)單個(gè)煙草植株進(jìn)行取材，取材時(shí)間為晴朗早上8:30左右，取材對(duì)象為幼小花蕾(花冠長(zhǎng)度為花萼長(zhǎng)度的2/3左右為佳，約小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期)。
[0027]2、預(yù)處理及固定:用眼科鑷將花蕾取下，去掉花柄后放入裝有蒸餾水的小玻璃管中，輕輕振蕩使花蕾浸入溶液中。后置于4°C冰箱放置24h，吸出蒸餾水，加入卡洛氏固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，固定過(guò)夜。
[0028]后續(xù)制片分為3個(gè)方法:
[0029]方法一:直接涂片
[0030]涂片:從玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科鑷小心剝?nèi)セㄝ?、花冠、雄蕊和柱頭。用鑷子夾取子房使其碎裂為小塊，用鑷尖夾取小塊組織并滴加少量卡洛氏固定液于鑷尖，直接在清潔、干燥的載玻片上涂抹，待材料涂布均勻后，滴加一滴卡洛氏固定液于涂布好材料的載玻片上，將固定液沿載玻片一端輕輕吹散開(kāi)。于酒精燈火焰上微烤至固定液呈液滴狀。
[0031]5%吉姆薩染液染色，待干燥后鏡檢、拍照。
[0032]方法二:酶解壓片
[0033]酶解:從玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科鑷小心剝?nèi)セㄝ?、花冠、雄蕊和柱頭，切除花托，并將子房分解為1毫米見(jiàn)方大小后放置于1.5毫升離心管中，加入約1毫升蒸餾水清洗2次，后加入1毫升蒸餾水浸泡20分鐘，吸出蒸餾水，加入混合酶液(3%纖維素酶+0.03%果膠酶，酶和子房體積比為10:1)浸沒(méi)材料，輕微震蕩子房使其在酶液中懸浮一次。于35°C恒溫箱中放置，1.5小時(shí)后取出。
[0034]低滲處理:酶解后的材料從恒溫箱中取出后，尖嘴吸管小心吸出酶液，小心加入約200微升蒸餾水，放置15分鐘后吸出蒸餾水，小心加入約200微升的卡洛氏固定液。
[0035]壓片:用鑷子小心夾取酶解后的材料，至于清潔、干燥的載玻片中央，滴加一滴卡包品紅染色液，用鑷子反復(fù)夾取材料使其分散于染液中，染色約1分鐘后，夾取清潔蓋玻片常規(guī)方法壓片即可。
[0036]鏡檢、拍照。
[0037]方法三:酶解涂片
[0038]、酶解:同方法二3。
[0039]低滲處理:同方法二 4。
[0040]涂片:用鑷子小心夾取子房并于鑷尖滴加少量卡洛氏固定液，在清潔的載玻片上快速涂抹，待材料涂布均勻后，滴加一滴固定液于載玻片上涂布有材料區(qū)域的中央，將固定液沿四周輕輕吹散開(kāi)。于酒精燈火焰上微烤至固定液呈液滴狀即可。
[0041]染色:用5%吉姆薩染色，干燥后鏡檢、拍照。
[0042]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.利用幼嫩子房對(duì)煙草單個(gè)植株進(jìn)行染色體制片的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取材:于花期內(nèi)進(jìn)行取材，取材時(shí)間為晴朗早上8:00-9:00之間，取材對(duì)象為幼小花蕾，以小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期花蕾為佳，因不同材料花蕾大小存在差異； (2)預(yù)處理及固定:用鑷子將花蕾取下，去掉花柄后放入裝有蒸餾水的小玻璃管中，輕輕振蕩使花蕾浸入溶液中，快速置于4°C冰箱中放置18-24h(溫度及時(shí)間可根據(jù)染色體形態(tài)自行調(diào)節(jié))，吸出蒸餾水，加入卡洛氏固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，固定過(guò)夜； (3)后續(xù)采用直接涂片、酶解后壓片或涂片方法得煙草染色體制片； 任選地，壓片后直接觀(guān)察，獲得良好中期分裂相，如需后續(xù)試驗(yàn)和長(zhǎng)期保存，可采用常規(guī)方法揭片；直接涂片和酶解后涂片還包括染色步驟:用5%吉姆薩溶液進(jìn)行染色，染色體時(shí)間控制在30秒至I分鐘之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幼嫩子房對(duì)煙草單個(gè)植株進(jìn)行染色體制片的方法，所述的直接涂片包括如下步驟:從玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科鑷剝?nèi)セㄝ?、花冠、雄蕊和柱頭；用鑷子夾取子房使其碎裂為小塊，用鑷尖夾取小塊組織并滴加少量卡洛氏固定液于鑷尖，直接在清潔、干燥的載玻片上涂抹，待材料涂布均勻后，滴加一滴固定液于涂布好材料的載玻片上，將固定液沿載玻片一端輕輕吹散開(kāi)；于酒精燈火焰上微烤至固定液呈液滴狀即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幼嫩子房對(duì)煙草單個(gè)植株進(jìn)行染色體制片的方法，所述的酶解壓片和涂片包括步驟(4) - (6): (4)酶解:從玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科鑷剝?nèi)セㄝ唷⒒ü?、雄蕊和柱頭，切除花托，并將子房分解為合適大小(邊長(zhǎng)約1-1.5毫米的方形塊)后置于離心管中，加入蒸餾水清洗2次，后加入蒸餾水浸泡約20分鐘，吸出蒸餾水，加入混合酶液(3%纖維素酶+0.03%果膠酶，不同廠(chǎng)家、批次的酶液可適當(dāng)調(diào)節(jié)濃度)，酶和子房體積比為8-12:1，浸沒(méi)材料，震蕩使組織塊在酶液中懸浮，于35°C恒溫箱中放置，1.0-1.5小時(shí)(可根據(jù)材料調(diào)整)后取出； (5)低滲處理:酶解后的材料從恒溫箱中取出后，尖嘴吸管吸出酶液，加入蒸餾水，放置10-15分鐘后吸出蒸餾水，加入卡洛氏固定液； (6)壓片:用鑷子小心夾取材料，置于清潔干燥的載玻片中央，滴加一滴卡寶品紅染色液，用鑷子反復(fù)夾取材料使其分散于染液中，染色約I分鐘后，夾取清潔、干燥蓋玻片常規(guī)方法壓片即可； 可選擇地: 涂片:用鑷子夾取材料，并于鑷尖滴加卡洛氏固定液，在清潔的載玻片上快速涂抹，待材料涂布均勻后，滴加一滴固定液于載玻片上涂布好材料范圍的中央，將固定液沿四周輕輕吹散開(kāi)，酒精燈火焰上微烤至固定液呈液滴狀即可。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK104297034SQ201410557520
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】黨江波, 梁國(guó)魯, 向素瓊, 郭啟高, 汪衛(wèi)星, 李曉林, 孫海燕 申請(qǐng)人:西南大學(xué)