一種甲基汞離子的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甲基汞離子的檢測(cè)方法。該結(jié)合納米材料的優(yōu)勢(shì)，利用甲基汞離子對(duì)以標(biāo)記了熒光素的富T堿基DNA為模板的銀納米顆粒形成的阻斷，實(shí)現(xiàn)熒光的保留，以此來檢測(cè)甲基汞離子。本發(fā)明的甲基汞離子的檢測(cè)方法方便簡(jiǎn)單快速，無需昂貴儀器，花費(fèi)低廉，檢測(cè)靈敏度高，同時(shí)能夠在對(duì)甲基汞離子實(shí)現(xiàn)高響應(yīng)的同時(shí)較好的克服二價(jià)汞離子的干擾，具有良好的實(shí)際應(yīng)用前景。
【專利說明】-種甲基汞離子的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米技術(shù)和分析檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種甲基汞離子檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 汞是一種具有很強(qiáng)毒性的重金屬，并且由于其分布廣泛，容易形成各種形態(tài)的污 染物。在各種形態(tài)的汞化合物中，有機(jī)汞，尤其是其中的甲基汞，因其具有很強(qiáng)的脂溶性，易 于穿透血腦屏障，具有比無機(jī)汞強(qiáng)很多的中樞神經(jīng)毒性，此外，由于其性質(zhì)穩(wěn)定，難以代謝， 容易在生物體內(nèi)進(jìn)行原型蓄積,使其成為了一種備受關(guān)注的高毒性物質(zhì)（《The Toxicology of Mercury and Its Chemical Compounds》，Crit. Rev. Toxicology. 2006,36,609-662)。自 然界中的甲基汞多是在微生物的作用下由無機(jī)汞轉(zhuǎn)變而來，并能通過食物鏈進(jìn)行富集。歷 史上，日本的熊本縣水俁灣曾經(jīng)由于人們誤食了含有大量甲基汞的魚類而出現(xiàn)了嚴(yán)重的運(yùn) 動(dòng)，感覺機(jī)能萎縮的病癥，也就是后來為人所熟知的水俁病。由此可見，甲基汞的檢測(cè)對(duì)環(huán) 境和人類的健康都具有非常重要的意義。
[0003] 現(xiàn)有的甲基汞檢測(cè)手段主要是一些傳統(tǒng)的儀器方法，例如：原子吸收光譜，原子熒 光光譜，電感耦合等離子共振質(zhì)譜等這些傳統(tǒng)的金屬檢測(cè)儀器以及與氣相色譜，高效液相 色譜等分離手段進(jìn)行聯(lián)用，這些方法無一例外地都需要較長(zhǎng)的樣品前處理步奏，以及昂貴 的儀器花費(fèi)。
[0004] 熒光分析方法由于其高靈敏度，高選擇性，簡(jiǎn)單快速的優(yōu)勢(shì)，在金屬離子的檢測(cè)應(yīng) 用中得到了廣泛的發(fā)展，今年來，也出現(xiàn)了一些針對(duì)甲基汞設(shè)計(jì)的有機(jī)熒光探針。如：《A chemodosimeter approach to fluorescent sensing and imaging of inorganic and methylmercury species》， Chem Commun，2009,2115-2117,《Fluorescent detection of methylmercury by desulfurization reaction of rhodamine hydrazide derivatives)), Org. Biomol. Chem. 2009,7,4590-4593等。但這些工作都無一例外的存在一個(gè)缺陷，不能實(shí) 現(xiàn)單一識(shí)別甲基汞離子而不對(duì)汞離子響應(yīng)，相反地，由于甲基汞與配體結(jié)合較弱，往往二價(jià) 汞離子的響應(yīng)要明顯高于甲基汞離子。由此可見，設(shè)計(jì)一個(gè)簡(jiǎn)單，快速，同時(shí)相對(duì)于二價(jià)汞 離子，對(duì)甲基汞離子具有高響應(yīng)的熒光探針具有重要的意義。
[0005] 銀納米顆粒作為一種的常見貴金屬納米材料，繼金納米顆粒之后，吸引了廣泛的 關(guān)注。類似于金納米顆粒，銀納米顆粒在400nm左右具有特征的等離子共振吸收峰，該特征 峰隨著納米顆粒分散性的變化而變化。結(jié)合銀納米顆粒所具有更高的消光系數(shù)，這使得其 相較于金納米顆粒而言用于比色檢測(cè)能夠達(dá)到更高的靈敏度，而基于銀納米顆粒的比色檢 測(cè)方法已被應(yīng)用到DNA，金屬離子，蛋白質(zhì)等目標(biāo)物的檢測(cè)當(dāng)中。同時(shí)銀納米顆粒具有拉曼 增強(qiáng)的性質(zhì)，作為常見的拉曼增強(qiáng)基底而被廣泛的應(yīng)用于設(shè)計(jì)拉曼信號(hào)輸出探針。
[0006] 最近，M. Dickson等提出了以DNA為模板合成銀納米團(tuán)簇的方法，該方法通過 先將一定比列，而正因?yàn)榱捷^小，產(chǎn)生納米尺寸效應(yīng)，具有離散的電子能級(jí)，電子容易 被激發(fā)因而這一類團(tuán)簇往往具有較強(qiáng)的熒光，該工作發(fā)表在JACS上（《DNA-Templated Ag Nanocluster Formation》，J. Am. Chem. Soc. 2004,126, 5207-5212)。接下來，該課題 組繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)銀納米簇的熒光是跟模板DNA鏈的序列密切相關(guān)的，通過改變序列，可 以調(diào)控發(fā)射的波長(zhǎng)達(dá)到近紅外區(qū)域（《Oligonucleotide-Stablized Ag Nanocluster Fluorophores》，J. Am. Chem. Soc. 2008,130, 5038-5039)。此后，一系列利用具有熒光的銀納 米簇進(jìn)行分析檢測(cè)的工作得到了發(fā)表，包括DNA，金屬離子，以及單堿基多態(tài)性分析等。
[0007] 當(dāng)增加銀離子與DNA的比例時(shí)，利用DNA為模板形成的銀納米顆粒不再具有熒光， 而且它們會(huì)與DNA相連的熒光基團(tuán)的熒光將起到較強(qiáng)的猝滅作用。同時(shí)，文獻(xiàn)中曾經(jīng)報(bào)道 過，DNA序列中的T堿基與甲基萊離子具有的結(jié)合常數(shù)最強(qiáng)（《Association Constants of Methylmercuric and Mercuric Ions with Nucleosides》，J. Am. Chem. Soc. 1964,86, 2059-2065)，那么，在甲基汞離子存在的情況下，銀離子的結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)，將不能形成以 富含T堿基DNA為模板的銀納米顆粒，標(biāo)記在DNA上的熒光素的熒光得到保留。此外，由于 二價(jià)萊離子能與富含T堿基的DNA序列形成T-Hg2+-T的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)（《Mercuryll-Mediated Formation of Thymine HgII Thymine Base Pairs in DNA Duplexes》，J. Am. Chem. Soc. 2006,86, 2059-2065)，當(dāng)汞離子存在時(shí)，在硼氫化鈉的還原下，將會(huì)在富含T堿基的 DNA上形成銀汞納米顆粒，同樣能起到淬滅熒光素?zé)晒獾淖饔谩?br>

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種甲基汞離子的檢測(cè)方法。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0010] 所述甲基汞離子的檢測(cè)方法包括如下步驟：
[0011] (1)在TriS-HNO3緩沖溶液中加入標(biāo)記了熒光素的DNA溶液，TriS-HNO 3緩沖溶液 與標(biāo)記了熒光素的DNA溶液的體積比為50?60:1，震蕩混勻，得混合液1 ;所述Tris-HNO3緩沖溶液的pH為7. 2?7. 4, Tris-HNO3緩沖溶液中Tris的濃度為10mM/L?20mM/L，所 述標(biāo)記了熒光素的DNA溶液的濃度為4. 8 ii M/L?5. 2 ii M/L ;
[0012] ⑵向混合液1中加入硝酸銀溶液，所述硝酸銀溶液與步驟⑴中標(biāo)記了熒光素的 DNA溶液的體積比為1:0. 9?I. 1，震蕩混勻，靜置，使銀離子與DNA充分作用并吸附到DNA 上，得混合液2 ;所述硝酸銀溶液的濃度為0. 8mM/L?I. 2mM/L ;
[0013] (3)向混合液2中加入甲基汞離子溶液，甲基汞離子溶液與步驟⑵所述硝酸銀溶 液的體積比為1:1，搖勻，得混合液3 ;
[0014] (4)向混合液3中加入硼氫化鈉溶液；所述硼氫化鈉溶液的濃度為8mM/L?12mM/ L，硼氫化鈉溶液與步驟（2)所述硝酸銀溶液的體積比為0. 1?0. 5:1 ;
[0015] (5)于490?600nm的熒光光譜條件下檢測(cè)混合液3中的熒光素含量。
[0016] 優(yōu)選地，步驟（3)所述甲基汞離子溶液中甲基汞離子濃度為1. 0 M/L?I. 0mM/L。
[0017] 優(yōu)選地，所述標(biāo)記了熒光素的DNA溶液中的DNA為富含T堿基的20?45個(gè)堿基 的DNA序列。
[0018] 優(yōu)選地，所述標(biāo)記了熒光素的DNA溶液中的DNA為富含T堿基的25個(gè)堿基的DNA 序列。
[0019] 優(yōu)選地，所述標(biāo)記了熒光素的DNA溶液中的DNA序列為5 ' -FAM-CTTTGTTCTTAAAAA TTGTTCTTTG-3'（SEQ ID NO. 1)。
[0020] 下面結(jié)合原理對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0021] 在TriS-HNOj^沖溶液中加入標(biāo)記了的熒光素的富T堿基DNA，向上述溶液中加入 硝酸銀溶液，震蕩混勻，靜置，使銀離子與DNA充分作用；向上述溶液中加入硼氫化鈉，銀離 子在DNA上被還原形成銀納米顆粒,熒光素的熒光被淬滅。若在加入硼氫化鈉前向溶液中 加入一定量的甲基汞離子作用一段時(shí)間，則銀離子會(huì)在甲基汞離子的競(jìng)爭(zhēng)作用下脫離DNA 序列，只形成游離的銀納米顆粒而保留熒光，因此可用于檢測(cè)甲基汞離子。
[0022] 因此，本發(fā)明檢測(cè)甲基汞離子的方法為：在Tris-HNO3緩沖溶液中加入標(biāo)記了熒光 素的富T堿基DNA溶液，震蕩混勻；然后加入硝酸銀溶液，震蕩混勻，靜置，使銀離子與DNA 充分作用，吸附到DNA上；再加入甲基汞離子，搖勻；最后加入硼氫化鈉溶液，銀離子在甲基 汞離子的競(jìng)爭(zhēng)下脫離DNA序列形成游離的銀納米顆粒，熒光素的熒光得到保留。測(cè)量熒光 素在490nm-600nm的突光，實(shí)現(xiàn)甲基萊離子的檢測(cè)。
[0023] 概括來說，本發(fā)明以標(biāo)記有熒光素的富T堿基DNA為模板的銀納米顆粒的合成過 程為基礎(chǔ)，在形成銀納米顆粒之前加入甲基汞離子，甲基汞離子和富T堿基DNA序列結(jié)合 能力很強(qiáng)，銀離子與DNA的結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)，使得此時(shí)只能形成游離的銀納米顆粒，熒光素 的熒光得到保留，實(shí)現(xiàn)甲基汞離子的檢測(cè)。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：
[0025] 本發(fā)明為一種基于DNA為模板的銀納米顆粒來進(jìn)行甲基汞離子的檢測(cè)方法，它不 再依賴于復(fù)雜昂貴的儀器，而且與新興的納米材料進(jìn)行了較好的結(jié)合，通過DNA序列的選 擇，可以實(shí)現(xiàn)在對(duì)甲基汞離子高響應(yīng)的同時(shí)，對(duì)二價(jià)汞離子響應(yīng)較小。同時(shí)從結(jié)果上看，本 發(fā)明具有很好的靈敏度與選擇性（見實(shí)施例2至6)，且操作方法簡(jiǎn)單。
[0026] 本發(fā)明結(jié)合了新型的納米材料，利用了 DNA模板銀納米顆粒的淬滅特性，以及甲 基汞離子對(duì)特定DNA序列的強(qiáng)結(jié)合能力，設(shè)計(jì)了一種高特異性的甲基汞離子的納米探針， 并且其響應(yīng)性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于二價(jià)汞離子，實(shí)現(xiàn)了甲基汞離子探針選擇性的一個(gè)重大突破。
[0027] 總之，本發(fā)明結(jié)合納米材料的優(yōu)勢(shì)，利用甲基汞離子對(duì)以標(biāo)記了熒光素的富T堿 基DNA為模板的銀納米顆粒形成的阻斷，實(shí)現(xiàn)熒光的保留，以此來檢測(cè)甲基汞離子。本發(fā)明 的甲基汞離子的檢測(cè)方法方便簡(jiǎn)單快速，無需昂貴儀器，花費(fèi)低廉，檢測(cè)靈敏度高，同時(shí)能 夠在對(duì)甲基汞離子實(shí)現(xiàn)高響應(yīng)的同時(shí)較好的克服二價(jià)汞離子的干擾，具有良好的實(shí)際應(yīng)用 前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為實(shí)施例1中制得的以DNA為模板的銀納米顆粒透射電鏡圖；
[0029] 圖2為實(shí)施例1中制得的在二價(jià)汞離子存在的情況下還原后的透射電鏡圖；
[0030] 圖3為實(shí)施例1中制得的在甲基汞離子存在的情況下還原后的透射電鏡圖。
[0031] 圖4為實(shí)施例2中在標(biāo)記了熒光素的富含T堿基DNA序列上形成銀納米顆粒對(duì)熒 光素突光的淬滅情況；
[0032] 圖5為實(shí)施例2中形成游離的銀納米顆粒對(duì)同一序列的DNA上熒光素?zé)晒獾拇銣?情況。
[0033] 圖6為實(shí)施例3中采用標(biāo)記了熒光素的富含T堿基DNA為模板合成銀納米顆粒以 及在二價(jià)汞離子和甲基汞離子存在的情況下還原的吸收光譜圖；
[0034] 圖7為實(shí)施例4中采用標(biāo)記了熒光素的富含T堿基DNA為模板合成銀納米顆粒以 及在二價(jià)汞離子和甲基汞離子存在的情況下還原的熒光光譜圖；
[0035] 圖8為實(shí)施例5中利用瓊脂糖電泳對(duì)本檢測(cè)方法的響應(yīng)機(jī)理進(jìn)行考察的電泳成像 圖；
[0036] 圖9為實(shí)施例6中對(duì)使用本檢測(cè)方法進(jìn)行甲基汞離子檢測(cè)時(shí)對(duì)于其他干擾金屬離 子的選擇性響應(yīng)考察；
[0037] 圖10為實(shí)施例7中對(duì)使用本檢測(cè)方法進(jìn)行甲基汞離子檢測(cè)時(shí)對(duì)不同濃度甲基汞 離子的熒光響應(yīng)曲線。
[0038] 圖11為實(shí)施例7中對(duì)使用本檢測(cè)方法進(jìn)行二價(jià)汞離子檢測(cè)時(shí)對(duì)不同濃度二價(jià)汞 離子的熒光響應(yīng)曲線。
[0039] 圖12為實(shí)施例7中對(duì)使用本檢測(cè)方法進(jìn)行甲基汞和二價(jià)汞離子檢測(cè)時(shí)的濃度工 作曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 本發(fā)明實(shí)施例中所用的 DNA 序列為：5 ' -FAM-CTTTGTTCTTAAAAATTGTTCTTTG-3 '，其 中FAM是標(biāo)記的熒光素，此段序列是從生工生物工程（上海）有限公司購(gòu)買得到。
[0041] 實(shí)施例1制備以DNA為模板的銀納米顆粒：
[0042] 配制制備銀納米顆粒所需的溶液：將由25個(gè)堿基組成的富含T堿基的DNA原液 加水稀釋得5 ii M/L的溶液，配制ImM/L的硝酸銀（AgNO3)溶液，配制10mM/L的硼氫化鈉 (NaBH4)溶液，配制 10mM/L 的 Tris-HNO3 緩沖液（pH = 7. 4)待用；
[0043] 向I. 5mL的離心管內(nèi)加入490 ii L的Tris-HNO3緩沖溶液（10mM/L);取配制好的 5 ii M/L的DNA溶液5 ii L加入，搖勻；取配制好的ImM/L的硝酸銀溶液5 ii L加入，搖勻，放 置10分鐘（使得銀離子與DNA充分作用）；加入10mM/L的硼氫化鈉溶液I y L還原，并劇烈 震蕩離心管。由于銀離子與DNA上的堿基作用進(jìn)而吸附到了 DNA上，故形成了以DNA為模 板的銀納米顆粒，另兩份平行樣中在添加硼氫化鈉溶液進(jìn)行還原前分別再加入5 y L ImM/L 的二價(jià)汞離子和甲基汞離子。
[0044] 透射電鏡圖分析：從圖1可以看出，沒有甲基汞離子/二價(jià)汞離子存在時(shí)，形成了 均一，分散，直徑在5nm左右的銀納米顆粒，在二價(jià)汞離子存在的情況下，由圖2,不再有分 散的納米顆粒，取而代之的是網(wǎng)狀而不規(guī)則的銀汞納米顆粒聚集體，說明二價(jià)汞離子存在 的情況下，大量的銀汞納米顆粒堆積在了 DNA序列上。而當(dāng)甲基汞離子存在的情況下，由圖 3,形成的納米顆粒分散且大小不均一，這是由于失去了 DNA模板的穩(wěn)定作用，只能形成游 離的銀納米顆粒，分散度變差。
[0045] 實(shí)施例2以DNA為模板形成的銀納米顆粒與游離的銀納米顆粒對(duì)熒光素?zé)晒獾?淬滅作用：
[0046] 取Tris-HNOj^沖溶液（10mM/L，pH = 7. 4)480 ii L加入到容積為ImL的熒光池中； 取L標(biāo)記了熒光素的富含T堿基的DNA溶液（5 iiM/L)加入到熒光池中，搖勻；再在熒光 池中加入10 U L的不同濃度的銀離子溶液或10 ii L Tris-HNO3緩沖液，使得銀離子的終濃 度分別為 〇, 〇? 05, 0? 2, 0? 5, L 0, 2. 0, 4. 0, 8. 0, 15. 0 ii M，搖勻，放置 10 分鐘；最后加入 2 ii L 硼氫化鈉溶液（10mM/L)還原，搖晃后放置20分鐘，使得反應(yīng)進(jìn)行充分，測(cè)試并分別記錄其 熒光發(fā)射光譜，得到加入不同濃度銀離子形成的DNA模板銀納米顆粒加入對(duì)熒光素的熒光 的淬滅情況。
[0047] 同樣地，往容積為ImL的熒光池中加入480 ii L Tris-HNOj^沖溶液（10mM/L，pH = 7. 4);再取IOii L的不同濃度的銀離子溶液或IOii LTris-HNO3緩沖液加入熒光池中，使得 銀離子的終濃度分別為〇, 〇. 05, 0. 2, 0. 5, 1. 0, 2. 0, 4. 0, 8. 0, 15. 0 ii M，搖勻，放置10分鐘； 加入2 ii L硼氫化鈉溶液（10mM/L)還原,搖晃后放置20分鐘,使得反應(yīng)進(jìn)行充分；最后加入 5 ii L標(biāo)記了熒光素的富含T堿基的DNA溶液（5 ii M/L)加入到熒光池中，搖勻，測(cè)試并分別 記錄其熒光發(fā)射光譜，得到不同濃度游離的銀納米顆粒對(duì)熒光素標(biāo)記的DNA熒光的淬滅情 況。
[0048] 熒光譜圖分析：從圖4的熒光譜圖中可以看出，隨著銀離子濃度的增大，熒光素的 熒光被急劇淬滅，在銀離子濃度達(dá)到8 ii M時(shí)，熒光強(qiáng)度已經(jīng)能淬滅98%以上，說明以DNA為 模板形成的銀納米顆粒能夠?qū)?biāo)記的熒光素的熒光產(chǎn)生極強(qiáng)的淬滅作用（此時(shí)銀納米顆 粒離熒光素距離較近）；相反地，由圖5可知，當(dāng)銀納米顆粒處于游離狀態(tài)，未在DNA模板上 形成的時(shí)候，即便銀離子的濃度達(dá)到了 15 y M，熒光素的熒光也只淬滅了不到30% (此時(shí)銀 納米顆粒離熒光素較遠(yuǎn)），基于以上的現(xiàn)象，我們可以得到，當(dāng)甲基汞離子與模板DNA結(jié)合 能力很強(qiáng)時(shí)，一旦銀納米顆粒形成后游離在溶液中，將會(huì)極大的削弱其對(duì)DNA標(biāo)記的熒光 素的淬滅能力，這也是應(yīng)用本發(fā)明對(duì)甲基汞離子檢測(cè)的一個(gè)基礎(chǔ)。
[0049] 實(shí)施例3考察本檢測(cè)方法對(duì)二價(jià)汞離子和甲基汞離子響應(yīng)機(jī)理的紫外-可見吸 收光譜：
[0050] (1)取Tris-HNO3緩沖溶液（10mM/L，pH = 7. 4) 480 ii L加入到容積為ImL的吸收 池中；將5 ii L含標(biāo)記了熒光素的富含T堿基的DNA溶液（5 ii M/L)加入吸收池中，搖勻，測(cè) 試其吸收光譜；
[0051] (2)作三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組：第一組：向步驟（1)所得的溶液中加入5 UL硝酸銀溶液 (ImM/L)后,搖勻靜置10分鐘,再加入I ii L硼氫化鈉溶液（10mM/L)進(jìn)行還原,反應(yīng)20分 鐘，測(cè)試其吸收光譜；第二組：向步驟（1)所得的溶液加入5 y L硝酸銀溶液（lmM/L)后，搖 勻靜置10分鐘，再加入5 ii L甲基汞離子溶液（lmM/L)，最后加入2 ii L硼氫化鈉溶液（IOmM/ L)進(jìn)行還原，反應(yīng)20分鐘，測(cè)試其吸收光譜；第三組：向步驟⑴所得的溶液加入5 UL硝 酸銀溶液（lmM/L)后，搖勻靜置10分鐘，再加入L二價(jià)汞離子溶液（lmM/L)，最后加入 2 ii L硼氫化鈉溶液（10mM/L)進(jìn)行還原,反應(yīng)20分鐘,測(cè)試其吸收光譜；
[0052] 吸收譜圖分析：由圖6, (1)為只有含熒光素標(biāo)記的富含T堿基DNA的吸收,在 260nM和490nM處有兩個(gè)明顯的吸收峰，分別對(duì)應(yīng)DNA與熒光素的吸收。在（2)中，當(dāng)DNA 上形成銀納米顆粒的時(shí)候，除了（1)中的兩個(gè)峰以外，在390nM處增加了銀納米顆粒的特征 吸收峰。當(dāng)甲基汞離子存在時(shí)，（3)中與（2)相比銀納米顆粒的吸收峰仍存在，但強(qiáng)度下降， 這個(gè)時(shí)候形成的是在溶液中的游離的銀納米顆粒。而（4)中，當(dāng)存在二價(jià)汞離子的時(shí)候，銀 納米顆粒的特征吸收峰消失了，但在330nM處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這個(gè) 峰是銀汞復(fù)合納米顆粒的吸收峰，說明二價(jià)汞離子存在情況下，在硼氫化鈉還原后不能形 成銀納米顆粒，取而代之形成了銀汞納米顆粒。
[0053] 實(shí)施例4本檢測(cè)方法對(duì)二價(jià)汞離子和甲基汞離子響應(yīng)的熒光光譜：
[0054] (1)取Tris-HNO3緩沖溶液（10mM/L，pH = 7. 4) 480 ii L加入到容積為ImL的熒光 池中；將5 ii L含標(biāo)記了熒光素的富含T堿基的DNA溶液（5 iiM/L)加入熒光池中，搖勻，測(cè) 試其突光光譜；
[0055] (2)作三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組：第一組：向步驟（1)所得的溶液加入5 UL硝酸銀溶液 (ImM/L)后，搖勻靜置10分鐘,再加入I ii L硼氫化鈉溶液（10mM/L)進(jìn)行還原，反應(yīng)20分 鐘，測(cè)試其熒光光譜；第二組：向步驟（1)所得的溶液加入5 UL硝酸銀溶液（lmM/L)后，搖 勻靜置10分鐘，再加入5 ii L甲基汞離子溶液（lmM/L)，最后加入2 ii L硼氫化鈉溶液（IOmM/ L)進(jìn)行還原，反應(yīng)20分鐘，測(cè)試其熒光光譜；第三組：向步驟（1)所得的溶液加入5 UL硝 酸銀溶液（lmM/L)后，搖勻靜置10分鐘，再加入5 ii L二價(jià)汞離子溶液（lmM/L)，最后加入 2 ii L硼氫化鈉溶液（10mM/L)進(jìn)行還原,反應(yīng)20分鐘,測(cè)試其熒光光譜；
[0056] 熒光光譜分析：由圖7的熒光譜圖可以看出，單純的熒光素標(biāo)記的DNA的熒光峰即 (1)，在518nm左右，強(qiáng)度約為750 ;在（2)中，當(dāng)形成了 DNA為模板的銀納米顆粒后，熒光素 的熒光強(qiáng)度被急劇淬滅到15左右，淬滅比例超過98% ;存在10 y M的甲基汞離子和二價(jià)汞 離子的時(shí)候進(jìn)行還原，熒光強(qiáng)度分別為650和150即（3)和（4)，說明利用本發(fā)明進(jìn)行甲基 汞離子的檢測(cè)響應(yīng)信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二價(jià)汞離子。有可能實(shí)現(xiàn)在二價(jià)汞離子存在的情況下對(duì)甲 基萊尚子的1?選擇性響應(yīng)。
[0057] 實(shí)施例5利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)檢測(cè)機(jī)理的考察實(shí)驗(yàn)：
[0058] 將富含 T 堿基的的標(biāo)記了熒光素的 DNA C -FAM-CTTTGITCTTAAAAAITGTTCTTTG- 3')溶液（5 ii M/L)與硝酸銀溶液（lmM/L)按1:1的比例混合搖勻，靜置10分鐘；分別取 Tris-HNO3緩沖溶液（10mM/L，pH = 7. 4)480 ii L加入到容積為I. 5mL的離心管中，并編號(hào)； 分別在1-5號(hào)樣品中加入⑴10 y L銀離子DNA混合溶液；（2) 5 ii LDNA溶液（5 ii M/L)與 5 y L實(shí)施例2中所述游離銀納米顆粒混合液；(3) 10 y L銀離子DNA混合溶液+2 y L硼氫 化鈉溶液（10mM/L) ; (4) 10 ii L銀離子DNA混合溶液+5 ii L二價(jià)汞離子溶液（lmM/L) +2 ii L 硼氫化鈉溶液（10mM/L) ; (5) 10 ii L銀離子DNA混合溶液+5 ii L甲基汞離子離子溶液（lmM/ L)+2ii L硼氫化鈉溶液（10mM/L)。每一步加入均搖晃,混勻，并靜置10分鐘,待反應(yīng)充分后， 對(duì)1-5號(hào)樣品同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并成像。
[0059] 電泳圖分析：從圖8的瓊脂糖凝膠電泳成像圖中可以看出，泳道1中DNA和銀離子 結(jié)合以后與泳道2中DNA在游離的銀納米顆粒存在的情況下泳動(dòng)的速率差不多，且熒光強(qiáng) 度沒有明顯變化，說明游離的銀納米顆粒并不能對(duì)標(biāo)記在DNA上的熒光素產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光 淬滅作用。泳道3中以DNA為模板形成了銀納米顆粒，此時(shí)泳動(dòng)的速度明顯減慢，證明了銀 納米顆粒是在DNA鏈上形成的，與此同時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯減弱，證明了以DNA為模板形成的 銀納米顆粒對(duì)標(biāo)記在DNA上的熒光素具有很強(qiáng)的熒光淬滅能力。泳道4中顯示，當(dāng)存在二 價(jià)汞離子的時(shí)候，DNA的泳動(dòng)速度同樣減慢，且熒光依然很弱，說明此時(shí)形成的銀汞納米顆 粒是在DNA鏈上的。泳道5中顯示，當(dāng)存在甲基汞離子的時(shí)候，DNA的泳動(dòng)速度重新變快， 且熒光強(qiáng)度明顯增加，說明，此時(shí)銀納米顆粒是游離在溶液中的，并且游離的銀納米顆粒無 法對(duì)標(biāo)記在DNA鏈上的熒光素?zé)晒猱a(chǎn)生很強(qiáng)的淬滅。依靠凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明了本 發(fā)明方法能夠?qū)嶒?yàn)在二價(jià)汞離子存在的情況下，對(duì)甲基汞離子實(shí)現(xiàn)高選擇性響應(yīng)的機(jī)理。
[0060] 實(shí)施例6本檢測(cè)方法對(duì)各種金屬離子的選擇性熒光實(shí)驗(yàn)：
[0061] 將含標(biāo)記了熒光素富含T堿基的DNA溶液（5 ii M/L)與硝酸銀溶液（lmM/L)按1:1 的比例混合搖勻，靜置10分鐘；第一組取Tris緩沖溶液（10mM/L，pH = 7. 4) 480 ii L加入到 容積為ImL的熒光池中；接著加入10 ii L上述混合溶液搖勻；最后加入2 ii L硼氫化鈉溶液 (lOmM/L)還原，搖晃后放置20分鐘，使得反應(yīng)進(jìn)行充分。
[0062] 另一組取Tris緩沖溶液（10mM/L，pH = 7. 4) 480 ii L加入到容積為ImL的熒光池 中；接著加入5 ii L DNA溶液（5 ii M/L)搖勻；再加入10 ii L的不同金屬離子溶液（lmM/L)， 使得各種金屬離子濃度為20 ii M搖勻，放置10分鐘；最后加入2 ii L硼氫化鈉溶液（IOmM/ L)還原，搖晃后放置20分鐘，使得反應(yīng)進(jìn)行充分。測(cè)試并分別記錄兩組發(fā)射光譜，取的熒 光最大值518nm處的數(shù)據(jù)記錄，并分別作成歸一化熒光的棒狀圖。
[0063] 選擇性分析：從圖9的熒光強(qiáng)度棒狀圖中可以看出，當(dāng)未加入銀離子的情況下，各 種金屬離子存在時(shí)加入硼氫化鈉基本不影響熒光素的熒光。當(dāng)銀離子存在時(shí)除二價(jià)汞離 子和甲基汞離子外，其余金屬離子并不會(huì)對(duì)DNA模板銀納米顆粒的形成產(chǎn)生影響，熒光素 的熒光被基本淬滅（銅離子略有一點(diǎn)干擾），甲基汞離子的響應(yīng)信號(hào)約為汞離子的4倍，說 明了本發(fā)明用于檢測(cè)甲基汞離子的響應(yīng)遠(yuǎn)大于二價(jià)汞離子。對(duì)甲基汞離子具有高選擇性響 應(yīng)，且其他金屬離子不會(huì)對(duì)甲基汞離子的檢測(cè)形成干擾。
[0064] 實(shí)施例7本檢測(cè)方法對(duì)甲基汞離子和二價(jià)汞離子響應(yīng)實(shí)驗(yàn)：
[0065] 將含標(biāo)記了熒光素富含T堿基的DNA溶液（5 ii M/L)與硝酸銀溶液（lmM/L)按1:1 的比例混合搖勻，靜置10分鐘；取Tris-HNO3緩沖溶液（10mM/L，pH = 7. 4)480 ii L加入到 容積為ImL的熒光池中；接著加入10 ii L上述混合溶液搖勻；加入10 ii L的不同濃度的氯化 甲基萊溶液，搖勻，放置10分鐘；最后加入2 ii L硼氫化鈉溶液（10mM/L)還原,搖晃后放置 20分鐘，使得反應(yīng)進(jìn)行充分，測(cè)試并分別記錄其熒光光譜光譜，得到不同濃度甲基汞離子的 加入對(duì)熒光的保留情況。
[0066] 對(duì)于二價(jià)汞離子，實(shí)驗(yàn)過程相同，只是將加入的氯化甲基汞溶液替換為硝酸汞溶 液即可。
[0067] 熒光譜圖分析：從圖10和11的熒光譜圖中可以看出，隨著甲基汞離子和汞離子濃 度的增大，518nm處熒光峰的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，結(jié)合7-3可知在甲基汞離子濃度為IOnM的時(shí) 候，就有比較明顯的響應(yīng)，而汞離子濃度得至少到200nM，才會(huì)有明顯的響應(yīng)。繼續(xù)升高濃 度，甲基汞離子的響應(yīng)可以達(dá)到25 iiM,而當(dāng)二價(jià)汞離子濃度達(dá)到12 ii M時(shí)，繼續(xù)增加二價(jià) 汞離子，熒光強(qiáng)度基本維持不變，根據(jù)圖12可以看出，無論是檢出限，靈敏度，還是響應(yīng)的 動(dòng)態(tài)范圍，甲基汞離子都明顯優(yōu)于二價(jià)汞離子。且同濃度下，甲基汞離子的響應(yīng)信號(hào)明顯高 于二價(jià)汞離子，實(shí)現(xiàn)了對(duì)甲基汞離子的高選擇性檢測(cè)，具有能夠在二價(jià)汞離子存在的情況 下實(shí)現(xiàn)甲基汞離子檢測(cè)的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1. 一種甲基隸離子的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 在Tris-HN〇3緩沖溶液中加入標(biāo)記了英光素的DNA溶液，Tris-HN〇3緩沖溶液與標(biāo) 記了英光素的DNA溶液的體積比為50?60:1，震蕩混勻，得混合液1 ;所述Tris-HN〇3緩沖 溶液的抑為7. 2?7. 4, Tris-HN〇3緩沖溶液中Tris的濃度為lOmM/L?20mM/L，所述標(biāo)記 了英光素的DNA溶液的濃度為4. 8 y M/L?5. 2 y M/L ; (2) 向混合液1中加入硝酸銀溶液，所述硝酸銀溶液與步驟（1)中標(biāo)記了英光素的DM 溶液的體積比為1:0.9?1. 1，震蕩混勻，靜置，使銀離子與DM充分作用并吸附到DM上， 得混合液2 ;所述硝酸銀溶液的濃度為0. 8mM/L?1. 2mM/L ; (3) 向混合液2中加入甲基隸離子溶液，甲基隸離子溶液與步驟（2)所述硝酸銀溶液的 體積比為1:1，搖勻，得混合液3 ; (4) 向混合液3中加入測(cè)氨化軸溶液；所述測(cè)氨化軸溶液的濃度為8mM/L?測(cè) 氨化軸溶液與步驟（2)所述硝酸銀溶液的體積比為0. 1?0. 5:1 ; (5) 于490?600nm的英光光譜條件下檢測(cè)混合液3中的英光素含量。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述甲基隸離子溶液中甲基隸離子 濃度為 1. 0 y M/L ?1. OmM/L。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記了英光素的DM溶液中的DM為富 含T堿基的20?45個(gè)堿基的DNA序列。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記了英光素的DNA溶液中的DNA為富 含T堿基的25個(gè)堿基的DNA序列。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記了英光素的DNA溶液中的DNA序列 如SEQ ID NO. 1所示，所述DNA序列的5'端標(biāo)記有FAM。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104345054SQ201410571071
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】楊榮華, 鄧立 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)