一種基于循環(huán)酶法的標(biāo)記方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于循環(huán)酶法的標(biāo)記方法，技術(shù)方案是：以可用循環(huán)酶法進(jìn)行檢測的物質(zhì)作為標(biāo)記物，標(biāo)記待檢測物的抗原或抗體；本發(fā)明還公開了所述標(biāo)記方法用于血清中低含量抗原或抗體檢測的方法及其檢測試劑盒。本發(fā)明通過循環(huán)酶法放大檢測的信號，提高待檢測物的檢測靈敏度；采用基于分光光度法原理的檢測方法，儀器設(shè)備簡單，操作簡單、快速，適宜于大面積的推廣應(yīng)用。
【專利說明】
一種基于循環(huán)酶法的標(biāo)記方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)測定分析領(lǐng)域，特別涉及一種基于循環(huán)酶法檢測底物的標(biāo)記方法及循環(huán)酶法的標(biāo)記方法在免疫學(xué)測定中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]自從1961年Lowry OH等應(yīng)用兩種工具酶建立循環(huán)酶測定方法：即6_磷酸葡萄糖脫氫酶、谷氨酸脫氫酶的催化特性及酶偶聯(lián)反應(yīng)的原理，使反應(yīng)體系中NADP+與NADPH之間循環(huán)變化，對循環(huán)中生成的大量的6-磷酸葡萄糖酸，用指示酶6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶催化，檢測終產(chǎn)物NADPH，從而能提高檢出能力。ChiMMY等改進(jìn)Lowry OH酶循環(huán)法，即酶雙循環(huán)法，其操作方法包括待檢測樣品酶循環(huán)、工具酶滅活、加入指示酶雙循環(huán)及對終產(chǎn)物檢測。近些年來酶循環(huán)法技術(shù)也在不斷改進(jìn)，并作為一種放大反應(yīng)信號的檢測方法被廣泛應(yīng)用于一些低含量樣本體外診斷試劑盒的開發(fā)中，市面上現(xiàn)有的基于循環(huán)酶法的檢測試劑盒有總膽汁酸檢測試劑盒、同型半胱氨酸檢測試劑盒等，此外還有很多基于酶法的檢測項(xiàng)目如：腺苷脫氨酶、糖化血紅蛋白、單胺氧化酶等項(xiàng)目都是可以用循環(huán)酶法進(jìn)行檢測的。
[0003]在人的體液樣本中還有一些疾病的標(biāo)志物，他們的含量很低，但是又不能用循環(huán)酶法對其反應(yīng)信號進(jìn)行放大用于檢測中，而只能用一些更高靈敏度的檢測方法學(xué)，如：化學(xué)發(fā)光或者其他分子生物學(xué)的檢測手段對這些指標(biāo)實(shí)行檢測，如：胰蛋白酶原2、甲胎蛋白、胰島素、生長激素、乙肝病毒等等。但是與基于分光光度法原理的檢測方法來說，化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒試劑相對較貴、檢測成本相對較高、自動化程度相對低且檢測耗時長；分子生物學(xué)對實(shí)驗(yàn)室要求很嚴(yán)格，且對操作人員的要求極其嚴(yán)格，且需要配備專門的儀器以及特定環(huán)境要求的檢測實(shí)驗(yàn)室，且檢測周期相對較長，不利于快速和及時檢測，總的來說化學(xué)發(fā)光檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法都要求特殊的檢測儀器，且配套的試劑及儀器成本很高，不利于大面積的推廣應(yīng)用。比較而言，常規(guī)的基于分光光度法原理的檢測方法檢測成本低，對設(shè)備、人員以及配套的檢測環(huán)境要求較低，且基于現(xiàn)有的全自動生化及酶聯(lián)免疫檢測方法的普及,可以實(shí)現(xiàn)樣本的全自動化檢測,大大減少了人工成本及實(shí)驗(yàn)成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種基于循環(huán)酶法的標(biāo)記方法，能夠?qū)Υ龣z測抗原或抗體的檢測信號進(jìn)行放大，提高待檢測抗原或抗體的檢測靈敏度。
[0005]本發(fā)明的另一目的是以此標(biāo)記方法為基礎(chǔ)，用于低含量物質(zhì)的免疫學(xué)檢測，以及結(jié)合此標(biāo)記方法和分光光度法對低含量物質(zhì)進(jìn)行檢測的試劑盒產(chǎn)品。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007]一種基于循環(huán)酶法的標(biāo)記方法，以可用循環(huán)酶法進(jìn)行檢測的物質(zhì)作為標(biāo)記物，標(biāo)記待檢測物的抗原或抗體。
[0008]進(jìn)一步地，所述標(biāo)記物為總膽汁酸、同型半胱氨酸、腺苷脫氨酶、糖化血紅蛋白或單胺氧化酶，優(yōu)選為同型半胱氨酸或總膽汁酸。
[0009]上述的標(biāo)記方法在血清中低含量抗原或抗體的免疫學(xué)檢測中的應(yīng)用，方法如下：
[0010]I)以待檢測物的抗原或抗體包被的磁顆粒作為固相載體，與待檢測物的樣本溶液混勻，反應(yīng)；
[0011]2)向上述I)溶液中加入標(biāo)記物標(biāo)記的待檢測物的抗原或抗體溶液,混勻，反應(yīng)；
[0012]3)對上述2)得到的體系進(jìn)行分離，洗滌，重懸；
[0013]4)以循環(huán)酶法檢測方法為基礎(chǔ)，對重懸后的溶液進(jìn)行檢測，利用循環(huán)酶法檢測試劑盒檢測標(biāo)記物的含量，從而間接得出待檢測物的含量。
[0014]進(jìn)一步地，所述磁顆粒是指以四氧化三鐵為內(nèi)核、表面包裹帶有氨基、羧基、巰基或其他易于偶聯(lián)的活性基團(tuán)的聚合物。
[0015]進(jìn)一步地,所述磁顆粒直徑為5nm_l μ m。
[0016]進(jìn)一步地，用于血清中低含量抗原或抗體的檢測，包括：胰蛋白酶原2、附睪蛋白4、降鈣素原、乙肝抗體和HIV抗體。
[0017]利用上述的標(biāo)記方法檢測血清中低含量抗原或抗體的檢測試劑盒，包括待檢測物的校準(zhǔn)品、待檢測物的抗原或抗體包被的磁顆粒溶液、濃縮洗滌液、可用循環(huán)酶法檢測的底物標(biāo)記的待檢測物的抗原或抗體溶液和可用循環(huán)酶法檢測的底物的檢測試劑盒。
[0018]進(jìn)一步地，所述校準(zhǔn)品的原料為標(biāo)準(zhǔn)級，純度不低于90% ;所述待檢測物的抗原為基因工程重組制備的抗原或天然抗原或化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)得到的抗原，所述待檢測物的抗體為單克隆抗體，所述待檢測物的抗原和所述待檢測物的抗體的純度不低于95% ;所述濃縮洗滌液為磷酸緩沖液。
[0019]進(jìn)一步地，所述的可用循環(huán)酶法檢測的底物標(biāo)記的待檢測物的抗原或抗體溶液的制備方法如下：將待檢測物的抗原或抗體于MES緩沖液中2-8°C透析過夜，向待檢測物的抗原或抗體溶液中加入可用循環(huán)酶法檢測的底物溶液，室溫下反應(yīng)，之后轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)并于MES緩沖液中2-8°C透析過夜，加入甘油后于_20°C避光保存?zhèn)溆谩?br> [0020]進(jìn)一步地，所述待檢測物的抗原或抗體與所述可用循環(huán)酶法檢測的底物的質(zhì)量比為 1:10-50。
[0021 ] 本發(fā)明利用循環(huán)酶法標(biāo)記方法、磁分離方法及現(xiàn)有的生化檢測方法作為待檢測物檢測的通用技術(shù)平臺。以循環(huán)酶法檢測的底物標(biāo)記待檢測物的抗原或抗體，通過循環(huán)酶法放大底物信號，間接放大待檢測物信號；以待檢測物的抗原或抗體分子包被的磁顆粒作為捕獲試劑，利用磁性分離原理將待檢測的樣本與反應(yīng)體系分離。用本發(fā)明的技術(shù)原理制備出來的檢測試劑盒，可結(jié)合分光光度法進(jìn)行檢測，可用于檢測醫(yī)學(xué)病原微生物、臨床疾病診斷標(biāo)志物、環(huán)境分子檢測、食品安全檢測以及其他各種可基于免疫學(xué)反應(yīng)進(jìn)行檢測的物質(zhì)。
[0022]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0023]I)循環(huán)酶法可以放大反應(yīng)的信號，提高待檢測物的檢測靈敏度；
[0024]2)采用基于分光光度法原理的檢測方法，利用了分光光度法的靈敏度高；儀器設(shè)備簡單，操作簡單、快速；應(yīng)用范圍廣等諸多優(yōu)良特性，適宜于大面積的推廣應(yīng)用；
[0025]3)樣本前處理結(jié)合磁分離方法可以有效的去除檢測樣本中的干擾性組分，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠程度。

【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明實(shí)施例提供一種基于循環(huán)酶法的標(biāo)記方法，具體如下：以可用循環(huán)酶法進(jìn)行檢測的物質(zhì)作為標(biāo)記物，標(biāo)記待檢測物的抗原或抗體。所述標(biāo)記物為總膽汁酸、同型半胱氨酸、腺苷脫氨酶、糖化血紅蛋白或單胺氧化酶，優(yōu)選為同型半胱氨酸或總膽汁酸。（待檢測物指的是待檢測的低含量的抗體或抗原，當(dāng)待檢測物為抗原時，標(biāo)記物標(biāo)記的是待檢測物的抗體；當(dāng)待檢測物為抗體時，標(biāo)記物標(biāo)記的是待檢測物的抗原。）
[0027]基于循環(huán)酶法的標(biāo)記方法在血清中低含量抗原或抗體的免疫學(xué)檢測中的應(yīng)用，方法如下：
[0028]I)以待檢測物的抗原或抗體包被的磁顆粒作為固相載體，與待檢測物的樣本溶液混勻，反應(yīng)。當(dāng)待檢測物為抗原時，則用待檢測物的抗體包被磁顆粒；當(dāng)待檢測物為抗體時，則用待檢測物的抗原包被磁顆粒；所述磁顆粒是指以四氧化三鐵為內(nèi)核、表面包裹帶有氨基（NH2-)、羧基（-C00H)、巰基（-SH)或其他易于偶聯(lián)的活性基團(tuán)的聚合物，磁顆粒直徑為5nm_lμ m。
[0029]2)向上述I)溶液中加入標(biāo)記物標(biāo)記的待檢測物的抗原或抗體溶液，混勻，反應(yīng)；
[0030]3)對上述2)得到的體系進(jìn)行分離，洗滌，重懸；
[0031]4)以循環(huán)酶法檢測方法為基礎(chǔ)，對重懸后的溶液進(jìn)行檢測，利用循環(huán)酶法檢測試劑盒檢測標(biāo)記物的含量，從而間接得出待檢測物的含量。循環(huán)酶法生化檢測試劑盒檢測的是標(biāo)記物，即可用循環(huán)酶法檢測的底物，由于是用循環(huán)酶法檢測的底物標(biāo)記待檢測物的抗體或抗原，所以循環(huán)酶法檢測的底物與待檢測物（即待檢測抗原或抗體）之間有對應(yīng)的關(guān)系，循環(huán)酶法檢測試劑盒放大酶底物的信號，所以間接放大了待檢測抗原或抗體的檢測信號。可用于血清中低含量抗原或抗體的檢測，包括：胰蛋白酶原2、附睪蛋白4、降鈣素原、乙肝抗體和HIV抗體檢測等各類血清中低含量抗原或抗體物質(zhì)的檢測。
[0032]利用本發(fā)明的標(biāo)記方法檢測血清中低含量抗原或抗體的檢測試劑盒，包括待檢測物的校準(zhǔn)品、待檢測物的抗原或抗體包被的磁顆粒溶液、濃縮洗滌液、可用循環(huán)酶法檢測的底物標(biāo)記的待檢測物的抗原或抗體溶液和可用循環(huán)酶法檢測的底物的檢測試劑盒。所述校準(zhǔn)品的原料為標(biāo)準(zhǔn)級，純度不低于90% ;所述待檢測物的抗原為基因工程重組制備的抗原或天然抗原或化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)得到的抗原，所述待檢測物的抗體為單克隆抗體，所述待檢測物的抗原和所述待檢測物的抗體的純度不低于95% ;所述濃縮洗滌液為磷酸緩沖液。
[0033]可用循環(huán)酶法檢測的底物標(biāo)記的待檢測物的抗原或抗體溶液的制備方法如下：將待檢測物的抗原或抗體于MES緩沖液中2-8°C透析過夜，向待檢測物的抗原或抗體溶液中加入可用循環(huán)酶法檢測的底物溶液，二者質(zhì)量比為1:10-50，室溫下反應(yīng)，之后轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)并于MES緩沖液中2-8°C透析過夜，加入甘油后于_20°C避光保存?zhèn)溆谩⒋龣z測抗原或抗體溶液置于MES緩沖液中透析過夜，使后續(xù)的反應(yīng)在MES緩沖液中進(jìn)行，保證了反應(yīng)體系的PH值的穩(wěn)定；反應(yīng)體系中過量的循環(huán)酶法檢測的底物比例保證標(biāo)記效率和后續(xù)產(chǎn)品質(zhì)量。
[0034]下面詳細(xì)論述本發(fā)明的一種基于循環(huán)酶法的標(biāo)記方法及其用于血清中抗原或抗體的檢測。
[0035]實(shí)施例一利用本發(fā)明的標(biāo)記方法原理的高靈敏度定量檢測血清中胰蛋白酶原2檢測試劑盒及其制備和應(yīng)用
[0036](一 )血清中胰蛋白酶原2檢測試劑盒包括：胰蛋白酶原2單克隆抗體包被的磁顆粒溶液、同型半胱氨酸標(biāo)記的抗體溶液、胰蛋白酶原2定標(biāo)液、濃縮洗滌液和市售同型半胱氨酸檢測試劑盒。
[0037]( 二 )試劑盒的制備方法包括以下步驟：
[0038]I)胰蛋白酶原2單克隆抗體包被磁顆粒溶液的制備：
[0039]磁顆粒洗滌緩沖液的配制：用雙蒸水和2-(N_嗎啉）乙磺酸（MES)配制pH值為4. 7-5. 0，濃度為 50mmol/ml 的 MES 緩沖液，加入 Tween-20 至終濃度為 O. 15 %，Proclin-300終濃度為O. 1%，然后用O. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌后2-8°C保存?zhèn)溆?，有效期?個月。
[0040]工作緩沖液的配制：用雙蒸水，磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制pH為7. 0-7. 4，終濃度為50mM的磷酸緩沖液，并按照相應(yīng)的濃度加入以下各種組分：1% PVP, I % BSA, O. 1%Tween-20，3%蔗糖，O. 2% Proclin-300，然后用O. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌后于2_8°C保存?zhèn)溆?，有效期一年?br> [0041]胰蛋白酶原2單克隆抗體包被磁顆粒溶液的制備方法：使用磁顆粒洗滌緩沖液緩沖洗滌磁顆粒（磁顆粒為四氧化三鐵為內(nèi)核，表面包裹帶有羧基聚合物，粒徑為5nm-lym，購自JSR Corporation)，然后加入終濃度為50mmol/L的EDC和NHS，混勻，并于室溫下反應(yīng)30-60分鐘，洗滌3次后加入胰蛋白酶原2單克隆抗體使單克隆抗體與磁顆粒的摩爾比為5:1，然后于室溫下反應(yīng)3小時，加入含有O. 5% BSA的50mM PBS室溫封閉30分鐘，洗滌5遍，使用工作緩沖液復(fù)溶磁顆粒（Img磁顆粒用20ml工作緩沖液復(fù)溶)，分裝成5ml/支，2-8 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0042]2)同型半胱氨酸標(biāo)記抗體的制備
[0043]同型半胱氨酸標(biāo)記胰蛋白酶原2抗體的制備方法如下：將抗胰蛋白酶原2的抗體于O. 05mol/L MES緩沖液中于2-8°C透析過夜，后將抗體的濃度調(diào)整為2mg/mL，然后以10:1的比例向抗體溶液中加入所需量的同型半胱氨酸溶液，室溫下反應(yīng)30分鐘，之后轉(zhuǎn)入分子截留直徑為4000-8000的透析袋內(nèi)并于O. 05mol/L MES緩沖液中于2_8°C透析過夜，加入等體積甘油后于-20°C避光保存?zhèn)溆谩?br> [0044]3)膜蛋白酶原2定標(biāo)液的制備
[0045]取胰蛋白酶原2純品（購自R&D Systems, Inc.),然后用牛血清（含0.1%Proclin-300)稀釋成 10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml 和 160ng/ml,分裝成 Iml/支，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0046]4)濃縮洗滌液的制備
[0047]用雙蒸水、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制pH為7. 0-7. 4，終濃度為lmol/L的磷酸緩沖液，加入終濃度為300mmol/L的氯化鈉，加入Tween-20終濃度5%，分裝成50ml/支2-8 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0048]5)試劑盒的組裝
[0049]將胰蛋白酶原2單克隆抗體包被的磁顆粒溶液、同型半胱氨酸標(biāo)記胰蛋白酶原2抗體、胰蛋白酶原2定標(biāo)液、濃縮洗滌液和檢測同型半胱氨酸的試劑盒（購自武漢生之源生物科技有限公司）統(tǒng)一裝入一個大試劑盒中，封裝，檢驗(yàn)合格后入2-8°C冷庫保存。
[0050](三）胰蛋白酶原2檢測試劑盒檢測樣本中胰蛋白酶原2的操作流程如下：
[0051]I)在磁性分離器專用反應(yīng)管（購自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司）中加入200ul胰蛋白酶原2單克隆抗體包被的磁顆粒溶液，然后再加入IOul血清樣本混勻，室溫下反應(yīng)3分鐘；包被磁顆粒的胰蛋白酶原2單克隆抗體與血清樣本中的胰蛋白酶原2蛋白免疫反應(yīng)更徹底，另外過量的胰蛋白酶原2單克隆抗體包被的磁顆粒溶液可以保證完全結(jié)合血清樣本中的胰蛋白酶原2蛋白，即待檢測物。
[0052]2)在上述反應(yīng)體系中加入200ul同型半胱氨酸標(biāo)記的胰蛋白酶原2抗體溶液，混勻，室溫下反應(yīng)3分鐘；使同型半光氨酸標(biāo)記的胰蛋白酶原2抗體與血清樣本中已經(jīng)與磁顆粒結(jié)合的胰蛋白酶原2蛋白結(jié)合，間接與磁顆粒相結(jié)合。
[0053]3)將磁性分離器專用反應(yīng)管放入磁性分離器上對樣本進(jìn)行分離；使反應(yīng)體系中間接結(jié)合磁顆粒的同型半胱氨酸標(biāo)記抗體和未與磁顆粒間接結(jié)合的同型半胱氨酸標(biāo)記抗體分離，便于后續(xù)的檢測步驟。
[0054]4)將濃縮洗滌液按照10倍比例稀釋，并用500ul稀釋后的洗滌液洗滌上述反應(yīng)管中待檢測組分，洗滌完成后，用IOul的雙蒸水重懸反應(yīng)體系；清洗可以去掉附著在反應(yīng)體系中未與磁顆粒間接結(jié)合的同型半胱氨酸標(biāo)記抗體，用雙蒸水重懸反應(yīng)體系是為了后續(xù)反應(yīng)的進(jìn)行提供樣本。
[0055]5)將步驟4)得出的雙蒸水重懸反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，檢測方法與市售同型半胱氨酸檢測試劑盒的檢測方法相同，采用全自動生化分析儀進(jìn)行，其參數(shù)及操作設(shè)計(jì)參照市售同型半胱氨酸檢測試劑盒說明書進(jìn)行，得出反應(yīng)體系中間接與磁顆粒結(jié)合的同型半胱氨酸標(biāo)記抗體中同型半胱氨酸的含量，從而得出血清中胰蛋白酶原2的含量。
[0056]6)結(jié)果計(jì)算，所有的樣本及校準(zhǔn)品按照同樣的操作進(jìn)行相關(guān)的檢測實(shí)驗(yàn)，根據(jù)胰蛋白酶原2定標(biāo)液的濃度及對應(yīng)的測試結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線以及樣本測試的結(jié)果換算血清中胰蛋白酶原2的含量。
[0057](四）試劑盒性能測試結(jié)果
[0058]經(jīng)檢測，本試劑盒的關(guān)鍵性能指標(biāo)為：
[0059]靈敏度：0.5ng/ml ；
[0060]批內(nèi)精密性：<10%;
[0061]批間精密性：<15%;
[0062]準(zhǔn)確性：國家標(biāo)準(zhǔn)品檢測偏差在± 10 %以內(nèi)。
[0063]檢驗(yàn)結(jié)果符合性：使用1000份臨床標(biāo)本，與進(jìn)口胰蛋白酶原2檢測試劑盒進(jìn)行測試比對,并進(jìn)行相關(guān)性分析,相關(guān)系數(shù)> O. 975。
[0064]穩(wěn)定性：不少于12個月，開封后穩(wěn)定性不少于28天。
[0065]實(shí)施例二利用本發(fā)明的標(biāo)記方法原理的高靈敏度定量檢測血清中降鈣素原檢測試劑盒及其制備和應(yīng)用
[0066](一 )血清中降鈣素原檢測試劑盒包括：降鈣素原單克隆抗體包被的磁顆粒溶液、總膽汁酸標(biāo)記的抗體溶液、降鈣素原定標(biāo)液、濃縮洗滌液和市售總膽汁酸檢測試劑盒。
[0067]( 二 )試劑盒的制備方法包括以下步驟：
[0068]I)降鈣素原單克隆抗體包被磁顆粒的制備：
[0069]磁顆粒洗滌緩沖液的配制：用雙蒸水和2-(N_嗎啉)乙磺酸（MES)配制pH值為4. 7-5. 0，濃度為 50mmol/ml 的 MES 緩沖液，加入 Tween-20 至終濃度為 O. 15 %，Proclin-300終濃度為O. I %，O. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌后2-8°C保存?zhèn)溆?，有效期?個月。
[0070]工作緩沖液的配制：用雙蒸水，磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制pH為7. 0-7. 4，終濃度為50mM的磷酸緩沖液，并按照相應(yīng)的濃度加入以下各種組分：1% PVP, I % BSA, O. 1%Tween-20，3%蔗糖，O. 2% Proclin-300，然后用O. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌后于2_8°C保存?zhèn)溆?，有效期一年?br> [0071]降鈣素原單克隆抗體包被磁顆粒的制備方法：使用磁顆粒（磁顆粒為四氧化三鐵為內(nèi)核，表面帶有-NH2聚合物,粒徑5nm-l μ m,購自JSRCorporation)洗漆緩沖液緩沖洗漆磁顆粒，然后加入終濃度為50mmol/L的EDC和NHS，混勻，并于室溫下反應(yīng)30-60分鐘，洗滌3次后加入降鈣素原單克隆抗體使單克隆抗體與磁顆粒的摩爾比為5:1，然后于室溫下反應(yīng)3小時，加入含有O. 5% BSA的50mM PBS室溫封閉30分鐘，洗滌5遍，使用工作緩沖液復(fù)溶磁顆粒（Img磁顆粒用20ml工作緩沖液復(fù)溶)，分裝成5ml/支，2_8°C保存?zhèn)溆谩?br> [0072]2)總膽汁酸標(biāo)記抗體的制備
[0073]總膽汁酸標(biāo)記降鈣素原抗體的制備方法如下：將抗降鈣素原的抗體于O. 05mol/L MES緩沖液中于2-8°C透析過夜，后將抗體的濃度調(diào)整為2mg/mL，然后以50:1的比例向抗體溶液中加入所需量的總膽汁酸溶液，室溫下反應(yīng)30分鐘，之后轉(zhuǎn)入分子截留直徑為4000-8000的透析袋內(nèi)并于O. 05mol/L MES緩沖液中于2_8°C透析過夜，加入等體積甘油后于-20°C避光保存?zhèn)溆谩?br> [0074]3)降鈣素原定標(biāo)液的制備
[0075]取降鈣素原純品（購自R&D Systems, Inc.)，然后用牛血清（含0.1%Proclin-300)稀釋成 O. 02ng/ml、0. 5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml 和 15ng/ml,分裝成 lml/支，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0076]4)濃縮洗滌液的制備
[0077]用雙蒸水、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制pH為7. 0-7. 4，終濃度為lmol/L的磷酸緩沖液，加入終濃度為300mmol/L的氯化鈉，加入Tween-20終濃度5%，分裝成50ml/支2-8 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0078]5)試劑盒的組裝
[0079]將上述抗體包被的磁微粒工作液、總膽汁酸標(biāo)記的抗體、降鈣素原定標(biāo)液、濃縮洗滌液和檢測總膽汁酸的試劑盒（購自武漢生之源生物科技有限公司）統(tǒng)一裝入一個大試劑盒中，封裝，檢驗(yàn)合格后入2-8 °C冷庫保存。
[0080](三）降鈣素原檢測試劑盒檢測樣本中降鈣素原的操作流程如下：
[0081]I)在磁性分離器專用反應(yīng)管（購自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司）中加入200ul降鈣素原單克隆抗體包被的磁顆粒溶液，然后再加入IOul血清樣本混勻，室溫下反應(yīng)3分鐘；使包被磁顆粒的單克隆抗體與血清樣本中的降鈣素原蛋白免疫反應(yīng)更徹底，另外過量的降鈣素原單克隆抗體包被的磁顆粒溶液是為了保證完全結(jié)合血清樣本中的降鈣素原蛋白。
[0082]2)在上述反應(yīng)體系中加入200ul總膽汁酸標(biāo)記的抗體溶液，混勻，室溫下反應(yīng)3分鐘；使總膽汁酸標(biāo)記的抗體與血清樣本中已經(jīng)與磁顆粒結(jié)合的降鈣素原蛋白結(jié)合，間接與磁顆粒相結(jié)合。
[0083]3)將磁性分離器專用反應(yīng)管放入磁性分離器上對樣本進(jìn)行分離；使反應(yīng)體系中間接結(jié)合磁顆粒的總膽汁酸標(biāo)記抗體和未與磁顆粒間接結(jié)合的總膽汁酸標(biāo)記抗體分離，便于后續(xù)的檢測。
[0084]4)將濃縮洗滌液按照10倍比例稀釋，并用500ul稀釋后的洗滌液洗滌上述反應(yīng)管中待檢測組分，洗滌完成后，用IOul的雙蒸水重懸反應(yīng)體系；清洗的目的是為了去掉附著在反應(yīng)體系中未與磁顆粒間接結(jié)合的總膽汁酸標(biāo)記抗體，用雙蒸水重懸反應(yīng)體系為后續(xù)反應(yīng)的進(jìn)行提供樣本。
[0085]5)將步驟4)得出的雙蒸水重懸反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，檢測方法與市售總膽汁酸檢測試劑盒的檢測方法相同，采用全自動生化分析儀進(jìn)行，其參數(shù)及操作設(shè)計(jì)參照試劑盒說明書進(jìn)行，檢測反應(yīng)體系中間接與磁顆粒結(jié)合的總膽汁酸標(biāo)記抗體中總膽汁酸的含量，進(jìn)而得出血清中降鈣素原的含量。
[0086]6)結(jié)果計(jì)算，所有的樣本及校準(zhǔn)品按照同樣的操作進(jìn)行相關(guān)的檢測實(shí)驗(yàn)，根據(jù)降鈣素原標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的測試結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線以及樣本測試的結(jié)果換算血清中降鈣素原的含量。
[0087](四）試劑盒性能測試結(jié)果
[0088]經(jīng)檢測，本試劑盒的關(guān)鍵性能指標(biāo)為：
[0089]靈敏度：0.5ng/ml ；
[0090]批內(nèi)精密性：<10%;
[0091]批間精密性：<15%;
[0092]準(zhǔn)確性：國家標(biāo)準(zhǔn)品檢測偏差在± 10 %以內(nèi)。
[0093]檢驗(yàn)結(jié)果符合性：使用1000份臨床標(biāo)本，與進(jìn)口降鈣素原檢測試劑盒進(jìn)行測試比對，并進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)> O. 975。
[0094]穩(wěn)定性：不少于12個月，開封后穩(wěn)定性不少于28天。
[0095]最后所應(yīng)說明的是，以上【具體實(shí)施方式】僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1.一種基于循環(huán)酶法的標(biāo)記方法，其特征在于:以可用循環(huán)酶法進(jìn)行檢測的物質(zhì)作為標(biāo)記物，標(biāo)記待檢測物的抗原或抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記方法，其特征在于:所述標(biāo)記物為總膽汁酸、同型半胱氨酸、腺苷脫氨酶、糖化血紅蛋白或單胺氧化酶，優(yōu)選為同型半胱氨酸或總膽汁酸。
3.權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)記方法在血清中低含量抗原或抗體的免疫學(xué)檢測中的應(yīng)用，其特征在于方法如下: 1)以待檢測物的抗原或抗體包被的磁顆粒作為固相載體，與待檢測物的樣本溶液混勻，反應(yīng)； 2)向上述I)溶液中加入標(biāo)記物標(biāo)記的待檢測物的抗原或抗體溶液,混勻，反應(yīng)； 3)對上述2)得到的體系進(jìn)行分離，洗滌，重懸； 4)以循環(huán)酶法檢測方法為基礎(chǔ)，對重懸后的溶液進(jìn)行檢測，利用循環(huán)酶法檢測試劑盒檢測標(biāo)記物的含量，從而間接得出待檢測物的含量。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述磁顆粒是指以四氧化三鐵為內(nèi)核、表面包裹帶有氨基、羧基、巰基或其他易于偶聯(lián)的活性基團(tuán)的聚合物。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用,其特征在于:所述磁顆粒直徑為5nm_lμ m。
6.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:用于血清中低含量抗原或抗體的檢測，包括:胰蛋白酶原2、附睪蛋白4、降鈣素原、乙肝抗體和HIV抗體。
7.利用權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)記方法檢測血清中低含量抗原或抗體的檢測試劑盒，其特征在于:包括待檢測物的校準(zhǔn)品、待檢測物的抗原或抗體包被的磁顆粒溶液、濃縮洗滌液、可用循環(huán)酶法檢測的底物標(biāo)記的待檢測物的抗原或抗體溶液和可用循環(huán)酶法檢測的底物的檢測試劑盒。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述校準(zhǔn)品的原料為標(biāo)準(zhǔn)級，純度不低于90% ;所述待檢測物的抗原為基因工程重組制備的抗原或天然抗原或化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)得到的抗原，所述待檢測物的抗體為單克隆抗體，所述待檢測物的抗原和所述待檢測物的抗體的純度不低于95% ;所述濃縮洗滌液為磷酸緩沖液。
9.如權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于:所述的可用循環(huán)酶法檢測的底物標(biāo)記的待檢測物的抗原或抗體溶液的制備方法如下:將待檢測物的抗原或抗體于MES緩沖液中2-8°C透析過夜，向待檢測物的抗原或抗體溶液中加入可用循環(huán)酶法檢測的底物溶液，室溫下反應(yīng)，之后轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)并于MES緩沖液中2-8°C透析過夜，加入甘油后于-20°C避光保存?zhèn)溆谩?br> 10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于:所述待檢測物的抗原或抗體與所述可用循環(huán)酶法檢測的底物的質(zhì)量比為1:10-50。
【文檔編號】G01N33/577GK104297492SQ201410571282
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】沈鶴霄, 華權(quán)高 申請人:沈鶴霄