檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的雜合型化合物及其應用的制作方法
【專利摘要】檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的雜合型化合物及其應用，分子通式如（I）所示：X-L-H（I）；H為激素或羥化膽固醇部分；X為能被抗體識別的小分子基團；L為能使X部分與H部分基團連接的連接部分。本發(fā)明提供一種靈敏度高、重現(xiàn)性好、取材方便、操作簡單易行和安全性高的檢測和分析方法，能夠快速檢測樣品中的硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明提出用激素或羥化膽固醇的雜合體作為酶底物，通過免疫分析法檢測被硫酸化酶底物的水平，以確定被測樣品中硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的方法。
【專利說明】檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的雜合型化合物及其應用

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性檢測領域，具體涉及一種檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的 雜合型化合物及其應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 硫酸基轉(zhuǎn)移酶（sulfotransferase，SULT)家族是一類主要負責催化硫?；?(S03-)從供體3磷酸腺苷一 5磷酸硫酸鹽（PAPS)轉(zhuǎn)移到廣泛存在的含有羥基（hydroxyl) 或氨基（amine)基團的化合物，從而形成硫酸鹽（sulfates)或磺胺鹽（sulfmates)，使底物 發(fā)生硫酸化代謝，也被稱為硫酸化（Sulfation)。
[0003] 人類SULT基因家族主要有SULT1，SULT2，SULT4和SULT6,在類固醇分泌器官、肝、 血液和激素依賴型組織（激素反應性器官，如胎盤、前列腺、皮膚和乳腺等）中高表達。催 化雌激素硫酸化的主要有酚類固醇（SULT1)亞家族，包括SULT1E1，SULT1A1和SULT1B1 (如 圖1A所示），其中SULTIE1編碼的蛋白質(zhì)與雌二醇（E2)、雌酮（E1)的親和力最強。羥基類 固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶（家族成員SULT2A1和SULT2B1)主要催化雄酮、孕烯醇酮、脫氫表雄酮 等羥基類固醇的硫酸化。SULT2A1可催化雌激素、甲狀腺激素、外源性激素、藥物的硫酸化。 此外，SULT2Blb能催化25-羥化膽固醇（25HC)硫酸化反應，主要產(chǎn)物為3-硫酸-25-羥化 膽固醇（25HC3S)(如圖1B所示）。
[0004]目前已有的主要檢測手段僅能分析SULT1E1的表達水平，并不能準確地反映硫 酸基轉(zhuǎn)移酶對酶底物的硫酸化能力。（l)SULTlEl蛋白水平的檢測試劑盒（人雌激素硫 酸轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的C末端融合了一個6個氨基酸的His標簽，該蛋白最終由標準的色 譜技術(shù)純化出）；（2)用SULT1E1抗體進行免疫組織染色，反映SULT1E1的表達量；（3)用 Westernblot的方法，檢測SULT1E1的蛋白水平；（4)用實時定量RT-PCR的方法，檢測細胞 中SULT1E1的mRNA水平。
[0005] 此外，本 申請人:已申請的檢測雌激素硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性（專利申請?zhí)枺?201310366700. 8)技術(shù)方案：用H3標記-雌激素（H3-E2)作為反應底物，PAPSS提供硫 酸基團，添加血漿樣品作為SULT1E1的供體；反應后產(chǎn)生17 0 -雌二醇-3硫酸鹽結(jié)合體 (H3 -E2-S)用液體閃爍計數(shù)儀進行檢測標記E2的放射性濃度來分析硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性。
[0006]目前國內(nèi)外檢測雌激素、雄激素、甲狀腺激素的技術(shù)僅限于報告總的激素水平，包 括有活性功能的激素、被代謝和降解的無功能活性激素二部分。因此迫切需要開拓一種新 技術(shù)方案能區(qū)分活性激素或無活性激素的水平。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 解決的技術(shù)問題：本發(fā)明的目的在于提供一種檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的雜合型化 合物及其應用，利用該化合物可以簡單便捷且準確度高的檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性。
[0008] 技術(shù)方案：檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶（sulfotransferase，SULT)活性的雜合型化合物， 分子通式如（I)所示：X-L_H(I) ;H為激素或羥化膽固醇部分；X為能被抗體識別的小分子 基團；L為能使X部分與H部分基團連接的連接部分。
[0009]所述H為雌激素/雌酮（E2/E1)、甲狀腺激素（T4/T3)、睪酮（T)、孕烯醇酮（PREG)、 脫氫表雄酮（DHEA)、外源性激素或25-羥化膽固醇（25HC)。
[0010] 所述X為磺胺類（Sulfonamides)、鏈霉素（Streptomycin)、氯霉素 (Chloramphenicol)、呋喃唑酮西林代謝物、呋喃它酮妥因代謝物、喹諾酮類（Quinolones)、 新霉素（Neomycin)、慶大霉素（Gentamicin)、呋喃它酮妥因代謝物、呋喃西林唑酮代謝物、 四環(huán)素類（Tetracyclines)、孔雀石綠（MalachiteGreen)、伏馬毒素（FumonisinB1)、赫 曲霉毒素A(0chratoxinA)、T_2 毒素（Trichothecenes2)、玉米赤霉稀麗（Zearalenol)、 嘔吐毒素（Deoxynivalenol)、黃曲霉毒素Ml(AflatoxinsMl)、黃曲霉毒素B1(Aflatoxins Bl)、泰樂菌素（Tylosin)、植物維生素C(VC)、植物鈣調(diào)素（CAM)、花生凝集素（PNA)、植物維 生素B6(VB6)、雙花扁豆凝集素（DBA)、植物吲哚乙酸（IAA)、植物維生素D(VD)、豌豆凝集素 (PSA)、植物凝脂酸（PA)、植物維生素D3 (VD3)、蓖麻凝集素（RCA)、植物生長激素（GH)、植物 維生素D2、扁豆凝集素（LCA)、植物血凝素（phA)、植物維生素E(VE)、植物赤霉素（GA)、植物 維生素A(VA)、植物玉米索核苷（ZR)、植物維生素B12 (VB12)、槐凝集素（SJA)、植物磷脂酰 甘油（PG)、植物激素脫落酸（ABA)或荊豆凝集素（UEA)。
[0011] 所述L是直接鍵、C1-C12亞烷基、C2-C12亞鏈烯基或C2-C12亞炔基，所述亞烷基、 亞鏈烯基或亞炔基的至少一個-CH2-基團任選被-0-、-5-、-502-、亞環(huán)烷基、亞芳基、亞雜脂 環(huán)基、亞雜芳基和/或-NR5-置換，以及所述亞烷基、亞鏈烯基或亞炔基任選被至少一個羰 基氧和/或羥基取代。
[0012] 優(yōu)選為以下化合物：

【權(quán)利要求】
1. 檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的雜合型化合物，其特征在于分子通式如（I)所示： X-L-H(I) H為激素或羥化膽固醇部分； X為能被抗體識別的小分子基團； L為能使X部分與H部分基團連接的連接部分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的雜合型化合物，其特征在于所述H 為雌激素/雌酮、甲狀腺激素、睪酮、孕烯醇酮、脫氫表雄酮、外源性激素或25-羥化膽固醇。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的雜合型化合物，其特征在于所述X 為磺胺類、鏈霉素、氯霉素、呋喃唑酮西林代謝物、呋喃它酮妥因代謝物、喹諾酮類、新霉素、 慶大霉素、呋喃它酮妥因代謝物、呋喃西林唑酮代謝物、四環(huán)素類、孔雀石綠、伏馬毒素、赭 曲霉毒素 A、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、黃曲霉毒素 Ml、黃曲霉毒素 B1、泰樂菌素、 植物維生素 C、植物鈣調(diào)素、花生凝集素、植物維生素 B6、雙花扁豆凝集素、植物吲哚乙酸、 植物維生素 D、豌豆凝集素、植物凝脂酸、植物維生素 D3、蓖麻凝集素、植物生長激素、植物 維生素 D2、扁豆凝集素、植物血凝素、植物維生素 E、植物赤霉素、植物維生素 A、植物玉米索 核苷、植物維生素 B12、槐凝集素、植物磷脂酰甘油、植物激素脫落酸或荊豆凝集素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的雜合型化合物，其特征在于所述L 是直接鍵、C1-C12亞烷基、C2-C12亞鏈烯基或C2-C12亞炔基，所述亞烷基、亞鏈烯基或亞炔 基的至少一個-CH 2-基團任選被-0-、-S-、-S02-、亞環(huán)烷基、亞芳基、亞雜脂環(huán)基、亞雜芳基 和/或-NR5-置換，以及所述亞烷基、亞鏈烯基或亞炔基任選被至少一個羰基氧和/或羥基 取代。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的雜合型化合物，其特征在于為以下 化合物：

6. 權(quán)利要求1?5任一所述雜合型化合物檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于 包括：（1)將雜合型化合物X-L-H作為硫酸基轉(zhuǎn)移酶的底物；（2)將所述底物和硫供體在含 有硫酸基轉(zhuǎn)移酶的待測樣品催化作用下發(fā)生硫酸化反應；（3)通過免疫分析法對反應得到 的硫酸化底物進行檢測，計算出硫酸基轉(zhuǎn)移酶的活性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的雜合型化合物檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于所 述的硫供體為5' -磷酸磺基-3' -磷酸腺苷或5 "-磷酸磺基-2' -磷酸腺苷；所述的待測 樣品為體液或器官組織；所述的免疫分析法包括酶免疫分析法、熒光免疫分析法或化學發(fā) 光免疫分析法。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的雜合型化合物檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于： X-L-H作為反應底物，5' -磷酸磺基-3' -磷酸腺苷或5' -磷酸磺基-2' -磷酸腺苷作為硫供 體提供硫酸基團，添加含有硫酸基轉(zhuǎn)移酶的待測樣品，反應后產(chǎn)生X-L-H的硫酸鹽結(jié)合體 X_L_H-[S];反應體系中加入二氯甲燒或氯仿抽提3次，尚心提取含有X_L_H-[S]的上清，去 除未反應的X-L-H ;將含有X-L-H-[S]的上清與X的特異性抗體進行免疫反應；通過檢測反 應液中X與抗體結(jié)合的水平，計算出反應液中X-L-H-[S]的濃度，推算出待測樣品中硫酸基 轉(zhuǎn)移酶的活性。
9. 權(quán)利要求1?5任一所述雜合型化合物在檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性試劑盒中的應用。
10. 檢測硫酸基轉(zhuǎn)移酶活性試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求1?5任一所述雜合型化 合物。
【文檔編號】G01N33/573GK104387436SQ201410572319
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】陳玲, 王小麗, 繆冶煉 申請人:南京醫(yī)科大學, 繆冶煉