一種植物甾醇的檢測分析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種植物甾醇的檢測分析方法，該方法首次使用衍生化試劑4’-羧基羅丹明對植物甾醇進(jìn)行衍生化，并利用多反應(yīng)監(jiān)測模式的超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性定量檢測分析。該方法步驟為：首先利用超聲輔助-分散液液微萃取技術(shù)提取植物甾醇，然后向所得植物甾醇萃取物中加入4’-羧基羅丹明乙腈溶液，2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和4-二甲氨基吡啶乙腈溶液，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，最后通過超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測。該方法溫和快速、靈敏度高，對于富含植物甾醇的植物油、飲料、藥材的質(zhì)量控制具有重要意義。
【專利說明】一種植物皆醇的檢測分析方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物甾醇的檢測分析方法，尤其是涉及一種利用4' -羧基羅丹明 進(jìn)行衍生化的植物甾醇的檢測分析方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物留醇（Phytosterol)是以環(huán)戊烷全氫菲為骨架的一類物質(zhì)，主要存在于植物 的根、莖、B十、果實(shí)和種子中。近年來的研究表明，植物留醇的營養(yǎng)價值高、生理活性強(qiáng)，具有 降低血液膽固醇水平、防治冠狀動脈粥樣硬化、抗氧化、抗癌等藥用和保健功能，在醫(yī)學(xué)、食 品、化妝品等領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注。
[0003] 但植物留醇分子缺少一個發(fā)色團(tuán)或者質(zhì)譜響應(yīng)靈敏的分子部件，因此對于傳統(tǒng)的 紫外-可見、熒光及質(zhì)譜檢測的靈敏度都很低，難以進(jìn)行檢測。在這種情況下，使用衍生化 技術(shù)提高靈敏度是一個很好的解決辦法。中國專利（CN102967647A)公開了一種利用吡啶或 氘代吡啶作為衍生試劑、三氟甲磺酸酐作為催化劑，通過電噴霧離子化-四極桿-飛行時間 串聯(lián)質(zhì)譜對食用油中的甾醇類化合物的分析檢測，提高了留醇類化合物的檢測靈敏度，但 是該方法所采用的衍生試劑具有惡臭且強(qiáng)烈的刺激性，催化劑三氟甲磺酸酐具有強(qiáng)烈刺激 性氣味，環(huán)境不友好，對人體危害大，且衍生反應(yīng)前需要進(jìn)行提取后皂化處理，反應(yīng)條件苛 亥IJ、過程繁瑣，檢測物質(zhì)為特定的樣品；中國專利（CN102978272A )利用多元有機(jī)酸或酸酐 在催化劑作用下合成了植物留醇多元酸單酯，但該方法反應(yīng)時間長達(dá)6-72小時，反應(yīng)溫度 高，能耗大。因此，利用環(huán)境友好的衍生化試劑，建立一種衍生化反應(yīng)條件溫和、簡單快速、 靈敏度高的測定植物留醇的檢測分析方法，對于食品和藥品品質(zhì)的評價具有十分重要的意 義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種利用環(huán)境友好的衍生化試 齊?，條件溫和、簡單快速、靈敏度高且適用性好的植物留醇的檢測分析方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案為： 本發(fā)明提供了一種植物留醇的檢測分析方法，其特征在于：所述的植物留醇在催化劑 2-氯-1-甲基碘代吡啶（CMPI)和4-二甲氨基吡啶（DMAP)作用下，通過與衍生劑4'-羧基 羅丹明（CSR)進(jìn)行衍生化反應(yīng)，得到的衍生化產(chǎn)物經(jīng)濾膜過濾后利用超高效液相色譜三重 四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測。
[0006] 所述的檢測分析方法是通過以下步驟進(jìn)行： a.超聲輔助-分散液液微萃取技術(shù)提取植物留醇：取50-50〇μ?植物留醇樣品溶液，力口 水定容至2-5 mL，調(diào)節(jié)pH為5_7,加入50-300μ?的萃取劑和250-80〇μ?的分散劑，超聲波 振蕩萃取，離心分離，所得沉積相用氮?dú)獯登Ш笕苡谶m量乙腈，得到植物留醇萃取物； 所述的萃取劑為二氯甲烷，三氯甲烷，三氯乙烯，四氯乙烯或氯苯； 所述的分散劑為丙酮，乙腈，甲醇或乙醇； b_衍生化反應(yīng)：向步驟a中的植物甾醇萃取物中加入衍生化試劑200-6〇〇μ?的4，-羧 基羅丹明乙腈溶液，l〇〇-3〇〇ML2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和100-300 4-二甲氨基 批陡乙腈溶液，密封后搖勻，置于40-60°C水浴中反應(yīng)15-40分鐘，得到衍生化產(chǎn)物； c.將步驟c中的衍生化產(chǎn)物經(jīng)濾膜過濾后利用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng) 進(jìn)行定性定量分析檢測。
[0007] 所述的三氯甲烷，丙酮等化學(xué)試劑為分析純，乙腈為高效液相色譜純。
[0008] 所述的植物留醇樣品溶液為富含植物留醇的植物油、飲料、藥材等實(shí)際樣品。
[0009]所述的步驟a超聲輔助-分散液液微萃取技術(shù)中，超聲波震蕩萃取時間為2分鐘， 離心3 min，轉(zhuǎn)速為10000 r/m。
[0010]上述的超聲輔助-分散液液微萃取技術(shù)，優(yōu)化的萃取劑為三氯甲烷，優(yōu)化的分散 劑為甲醇。 所述的目標(biāo)分析物植物甾醇是游離的豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇或 麥角甾醇。
[0012] 所述的衍生化試劑4' -羧基羅丹明按照2012年Cardoso等報(bào)道的合成方法執(zhí)行 (European Journal of Organic Chemistry, 2012，29，5810 - 5817)，經(jīng)樣品純化和譜學(xué) 表征對比后表明合成的4' -羧基羅丹明結(jié)構(gòu)正確。采用高效液相色譜-二極管陣列檢測 器檢測用于監(jiān)控合成反應(yīng)進(jìn)程，經(jīng)過三次微波輔助反應(yīng)處理(每次15 min)即可獲得最高收 率。粗產(chǎn)品采用半制備液相色譜法進(jìn)行純化，得到純度為99%的CSR，產(chǎn)率48%。
[0013] 所述的步驟b中的4' -羧基羅丹明乙腈溶液的摩爾濃度為lXl〇-4m〇l/L。
[0014] 所述2-氯-1-甲基碘代吡啶（CMPI)溶于乙腈中制成質(zhì)量濃度為1-10%的溶液， 2-氯-1-甲基碘代吡啶的摩爾數(shù)為4'-羧基羅丹明的500-10000倍，更優(yōu)選的為7500倍。
[0015] 所述的4-二甲氨基吡啶（DMAP)溶于乙腈中制成質(zhì)量濃度為10-25%的溶液，4-二 甲氨基吡啶的摩爾數(shù)為4' -羧基羅丹明的100-1000倍，更優(yōu)選的為490倍。
[0016] 所述的步驟b中衍生化反應(yīng)優(yōu)化的條件為；置于45°C水浴中反應(yīng)30分鐘。
[0017] 所述的步驟c衍生化產(chǎn)物經(jīng)〇. 45 Mm濾膜過濾后用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì) 譜系統(tǒng)進(jìn)行定性定量分析檢測。
[0018] 上述的超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)由安捷倫1290系列超高效液相 色譜，配備安捷倫6460三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)組成。
[0019] 上述的超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)中色譜分離使用安捷倫SB C18 色譜柱：2.1 mm X 50 mm，1.8 μηι，進(jìn)樣體積為2 μ?，柱溫30 ° C，采用梯度洗脫法。
[0020] 上述的梯度洗脫法,時間為5分鐘，流速為〇. 2 mL/min，流動相Α為5%乙腈水溶液 含有0. 1%甲酸，流動相B為乙腈含有〇· 1%甲酸，0 min流動相組成為50%A+50%B，5 min時 10%A+90%B。
[0021] 所述的超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測時的質(zhì)譜的優(yōu)選 條件為：千燥氣溫度300 ° C，流速10 L/min，噴霧器氣壓40 psi，鞘氣溫度280 ° C，流速 11 L/min，毛細(xì)管電壓3. 5 kV。
[0022] 所述的游離的豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇或麥角甾醇的結(jié)構(gòu)式如 下：

【權(quán)利要求】
1. 一種植物留醇的檢測分析方法，其特征在于：所述的植物留醇在催化劑2-氯-1-甲 基碘代吡啶和4-二甲氨基吡啶作用下，通過與衍生劑4' -羧基羅丹明進(jìn)行衍生化反應(yīng)，得 到的衍生化產(chǎn)物經(jīng)濾膜過濾后利用超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢 測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測分析方法，其特征在于：是通過以下步驟進(jìn)行： a. 超聲輔助-分散液液微萃取技術(shù)提取植物留醇：取5〇-50〇μ?植物留醇樣品溶液，力口 水定容至2-5 mL，調(diào)節(jié)pH為5-7,加入50-300μ?的萃取劑和250-800μ?的分散劑，超聲波 振蕩萃取，離心分離，所得沉積相用氮?dú)獯蹈桑玫街参锪舸驾腿∥铮? 所述的萃取劑為二氯甲烷，三氯甲烷，三氯乙烯，四氯乙烯或氯苯； 所述的分散劑為丙酮，乙腈，甲醇或乙醇； b. 衍生化反應(yīng)：向步驟a中的植物留醇萃取物中加入200-600μ?4' -羧基羅丹明乙腈 溶液，100-300μ?2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和100-300μ?4-二甲氨基吡啶乙腈溶液， 密封后搖勻，置于40-60°C水浴中反應(yīng)15-40分鐘，得到衍生化產(chǎn)物； c. 將步驟c中的衍生化產(chǎn)物經(jīng)濾膜過濾后利用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng) 進(jìn)行定性定量分析檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測分析方法，其特征在于：步驟a中所述的萃取劑為三氯 甲烷，分散劑為甲醇。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的檢測分析方法，其特征在于：所述的植物留醇是游 離的豆甾醇、β_谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇或麥角甾醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測分析方法，其特征在于：步驟b所述的4' -羧基羅丹明 乙腈溶液的摩爾濃度為1X l(T4m〇l/L，2-氯-1-甲基碘代吡啶的摩爾數(shù)為4' -羧基羅丹明 的500-10000倍，4-二甲氨基吡啶的摩爾數(shù)為4' -羧基羅丹明的100-1000倍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測分析方法，其特征在于：所述的2-氯-1-甲基碘代吡啶 的摩爾數(shù)為4'-羧基羅丹明的7500倍，4-二甲氨基吡啶的摩爾數(shù)為4'-羧基羅丹明的490 倍。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測分析方法，其特征在于：所述步驟b衍生化反應(yīng)的條件 為：置于45°C水浴中反應(yīng)30分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的檢測分析方法，其特征在于：所述的超高效液相色 譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)中色譜分離使用安捷倫SB C18色譜柱：2. 1 mm X 50 mm，1.8 Mm，進(jìn)樣體積為2 μ?，柱溫30°C，采用梯度洗脫法。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測分析方法，其特征在于：所述的梯度洗脫法，時間為5分 鐘，流速為〇. 2 mL/min，流動相A為5%乙腈水溶液含有0. 1%甲酸，流動相B為乙腈含有 0. 1% 甲酸，0 min 流動相組成為 50%A+50%B，5 min 時 10%A+90%B。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的檢測分析方法，其特征在于：所述的超高效液相色 譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測時的質(zhì)譜的優(yōu)選條件為：干燥氣溫度300°C，流 速10 L/min，噴霧器氣壓40 psi，鞘氣溫度280°C，流速11 L/min，毛細(xì)管電壓3. 5 kV。
【文檔編號】G01N30/02GK104297377SQ201410574366
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】朱樹蕓, 趙先恩, 呂濤, 尤進(jìn)茂 申請人:曲阜師范大學(xué)