腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒制備及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒及其制備和應(yīng)用，包括以下物質(zhì)：（1）致敏原核表達(dá)腸道病毒71型VP1特異性抗原的羧化乳膠試劑；（2）致敏三株針對腸道病毒71型VP1的單克隆混合抗體的羧化乳膠試劑；（3）腸道病毒71型陰陽性標(biāo)準(zhǔn)血清，滅活病毒溶液及PBS和（4）含有可供致敏乳膠進(jìn)行凝集反應(yīng)的玻片平臺及用于混勻乳膠和待反應(yīng)血清的牙簽或塑膠棒。本發(fā)明可以檢測不同來源樣本中的EV71抗原，克服了蛋白致敏普通乳膠時，致敏抗原量少、不穩(wěn)定、致敏后的蛋白容易脫落等缺點(diǎn)。本發(fā)明的檢測方法可用于腸道病毒71型的血清流行病學(xué)調(diào)查、臨床輔助診斷以及EV71病毒的復(fù)制調(diào)控、抗病毒治療藥物篩選等科研領(lǐng)域。
【專利說明】腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒制備及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病原生物學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種腸道病毒71型抗原抗體的快速雙向乳膠凝集檢測試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]手足口病是全球性傳染病，近年來已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅兒童健康的傳染病之一。其以發(fā)熱和手、足、咽等部位的皮疹或皰疹為主要特征。少數(shù)患者可并發(fā)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，個別重癥患兒病情進(jìn)展快，易發(fā)生死亡，重癥患兒病死率在10%-25%。
[0003]手足口病主要由腸道病毒屬的柯薩奇病毒(Cox, A組16、4、5、7、9、10型，B組2、
5、13型)、?？刹《?Echo)和EV71引起，其中以EV71及CoxA16型最常見。而EV71感染引起重癥病例較為常見。我國自1981年在上海始見本病，之后多個省市區(qū)均有報道。2008年5月2日我國正式將手足口病列為丙類傳染病進(jìn)行法定傳染病管理。
[0004]病毒從咽部或腸道侵入，在局部黏膜或淋巴組織中繁殖，并由局部排出，此時可引起局部癥狀。繼而病毒又侵入局部淋巴結(jié)，并由此進(jìn)入血液循環(huán)導(dǎo)致第一次病毒血癥。病毒經(jīng)血循環(huán)侵入網(wǎng)狀內(nèi)皮組織、深層淋巴結(jié)、肝、脾、骨髓等處大量繁殖并由此進(jìn)入血液循環(huán)，引起第二次病毒血癥。病毒可隨血流進(jìn)入全身各器官，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚黏膜、心臟等處，進(jìn)一步繁殖并引起病變。易感者感染EV71后，出現(xiàn)血管變態(tài)反應(yīng)和組織炎癥病變。當(dāng)病毒累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)時，組織炎癥較神經(jīng)毒性作用更加強(qiáng)烈，中樞神經(jīng)系統(tǒng)小血管內(nèi)皮最易受到損害。細(xì)胞融合、血管炎性變、血栓形成可導(dǎo)致缺血和梗死。在脊髓索、腦干、間腦、大腦和小腦的局部組織中，除嗜神經(jīng)性作用外，還存在廣泛的血管周圍和實(shí)質(zhì)細(xì)胞炎癥。患兒感染EV71后臨床表現(xiàn)多樣，從隱形感染、普通手足口病到中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等重癥，部分重癥患者病情進(jìn)展較快，甚至死亡。患者主要為學(xué)齡前兒童，尤以3歲以下兒童發(fā)病率高。與其他腸道病毒引起的手足口病相比，由EV71感染引起的疾病發(fā)生重癥感染的比例相對較高。同時，由于腸道病毒傳染性強(qiáng)，易引起暴發(fā)或流行。加強(qiáng)對EV71感染的防控，已成為我國病毒性傳染病管理工作的目標(biāo)之一。
[0005]目前對于EV71感染性疾病尚無特效的藥物，主要采用對癥及支持治療，積極防止并發(fā)癥發(fā)生。加強(qiáng)疾病及病原的監(jiān)測、準(zhǔn)確及時處置疫情、展開健康教育等是控制EV71流行的關(guān)鍵。EV71疫苗正在開發(fā)當(dāng)中，將成為預(yù)防的關(guān)鍵。對人群特別是嬰幼兒群體的EV71的血清流行病學(xué)狀態(tài)和規(guī)律進(jìn)行研究，可為手足口病的免疫規(guī)劃的制訂提供數(shù)據(jù)參考。因此EV71的抗體快速檢測試劑盒的開發(fā)顯得尤為必要。
[0006]而相關(guān)疫苗的開發(fā)及病毒抗原快速檢測試劑盒的研制則是預(yù)防控制該病的關(guān)鍵。目前檢測腸道病毒之方式除了傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)鑒定法外，國內(nèi)已有生物科技公司利用生物芯片技術(shù)研發(fā)出“腸道病毒鑒定芯片”(EV typing chip)，可快速檢測出腸病毒之型別，不致延誤病患就診治療的首要時機(jī)。因腸道病毒鑒定芯片感染易引起并發(fā)癥，且往往在一星期內(nèi)即轉(zhuǎn)成重癥，所以若能提早確知所感染的病毒類型，即可掌握對癥治療的第一時間。腸道病毒鑒定芯片鑒定芯片主要是針對并發(fā)癥較嚴(yán)重之EV71、Cox A15、Cox A16及Cox B3等幾型腸道病毒鑒定芯片所設(shè)計出的生物芯片，利用腸道病毒鑒定芯片的特定基因序列來鑒別腸道病毒鑒定芯片的類型。在我國公共衛(wèi)生系統(tǒng)，出現(xiàn)手足口癥狀的患兒樣本，咽拭子或肛拭子采樣后，用探針標(biāo)記的Real-time PCR進(jìn)行腸道病毒檢測。
[0007]目前已經(jīng)研發(fā)出針對腸道病毒IgG、IgM抗體以及檢測病毒病毒粒子的的ELISA試劑盒。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所公開了 “EV71型病毒抗原的檢測方法”專利(申請?zhí)?00910094972.0)，該專利是采用酶聯(lián)免疫的方法來檢測EV71抗原。北京科興生物制品有限公司公開了 “EV71病毒中和表位抗原檢測試劑盒或試劑及其制備方法”專利(申請?zhí)?00910131382.0)，該專利提供了一種采用具有光譜性活性的HD6單克隆抗體對EV71病毒抗原進(jìn)行定量檢測的方法。以上均是采用酶聯(lián)免疫的方法來檢測EV71抗原，適用于臨床診斷，由于檢測時間較長且需要借助專業(yè)儀器設(shè)備，價格昂貴，操作步驟繁瑣費(fèi)時，且需要洗板機(jī)，排槍，酶標(biāo)記等昂貴儀器，不適合在普通的鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣使用。湖南康潤藥業(yè)有限公司公開了 “腸道病毒71型膠體金檢測試紙條及其制備方法和應(yīng)用”專利(申請?zhí)?01210151666.8)，該專利是采用膠體金標(biāo)記的方法來檢測EV71抗體，方法簡單快捷，但是成本高，不利于大規(guī)模的血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對現(xiàn)有技術(shù)的上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測腸道病毒71型抗原抗體的快速雙向乳膠凝集檢測試劑盒及其制備和應(yīng)用，本發(fā)明基于羧化乳膠顆粒為載體，通過碳化二亞胺把目的蛋白或者抗體偶聯(lián)到乳膠顆粒上，用于檢測腸道病毒71型。
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒，由以下物質(zhì)組成:
(1)致敏原核表達(dá)腸道病毒71型VPl特異性抗原的羧化乳膠試劑；
(2)致敏三株針對腸道病毒71型VPl的單克隆混合抗體的羧化乳膠試劑；
(3)腸道病毒71型陰陽性標(biāo)準(zhǔn)血清，滅活病毒溶液及PBS
和(4)含有可供致敏乳膠進(jìn)行凝集反應(yīng)的玻片平臺及用于混勻乳膠和待反應(yīng)血清的牙簽或塑膠棒。
[0010]一種腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
(1)制備三種EV71單克隆抗體:用原核表達(dá)純化的EV71VPl蛋白免疫BALB/c小鼠，采用常規(guī)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備若干株雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后收集培養(yǎng)液，然后用免疫印跡方法篩選出三株特異性敏感性均較高的三株，進(jìn)行層析純化后濃縮并凍干，_80°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)pET-28a-VPl的構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化:把EV71-C4標(biāo)準(zhǔn)株的VPl基因克隆入原核表達(dá)載體pET-28a，BL21大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)EV71病毒VPl蛋白，Ni柱進(jìn)行親和純化，_80°C保存?zhèn)溆茫?br> (3)羧化乳膠凝集方法的建立:通過碳化二亞胺把純化后的蛋白或者單克隆抗體偶聯(lián)到乳膠顆粒上，遵循固定其它條件，改換其中一個條件的原則，摸索偶聯(lián)蛋白量，偶聯(lián)時間，膠乳濃度，選擇偶聯(lián)反應(yīng)終止劑和封閉劑；
所述碳化二亞胺的工作液濃度為1.0-2.3%，碳化二亞胺的反應(yīng)終濃度為60-80 μ 1，碳化二亞胺的反應(yīng)時間為2.5-3小時；
所述的偶聯(lián)蛋白量為20-70ug，偶聯(lián)時間為4.5-9.6小時，所述的乳膠濃度為110-180ul ；
所述的偶聯(lián)反應(yīng)終止劑為20-60 μ I的0.1M乙醇胺溶液加入l-2mlpH8.0硼酸緩沖液懸浮的乳膠溶液中制得；
(4)腸道病毒71型抗原抗體的快速雙向乳膠凝集檢測試劑盒的組裝:將上述制備好的致敏乳膠、陰陽性對照、載玻片和膠棒組裝成檢測試劑盒。
[0011]所述步驟(3)中通過碳化二亞胺把純化后的蛋白或者單克隆抗體偶聯(lián)到乳膠顆粒上的具體步驟為:
Ca)取羧化膠乳放入離心管中，用pH9.6的碳酸緩沖液洗3遍后，再用pH4.5的磷酸緩沖液洗3遍；
(b)加入水溶性碳化二亞胺在pH4.5的磷酸緩沖液中室溫作用3h ；
(c)用pH8.0硼酸緩沖液洗3遍；
(d)在膠乳懸液中加入VPl蛋白質(zhì)抗原或混合單抗,搖床上感作6小時后,將膠乳抗體檢測試劑懸浮于貯存液中。
[0012]所述的腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒制備后，對試劑盒的特異性、敏感性、重復(fù)性和保存期等進(jìn)行了測定和優(yōu)化。
[0013]一種腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒在檢測腸道病毒71型抗原和抗體中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的原理是:采用三株EV71單克隆抗體或原核表達(dá)純化的VPl蛋白通過EDC偶聯(lián)，致敏羧化乳膠，采用抗原抗體反應(yīng)并發(fā)生凝集的原理檢測樣品中的EV71抗原和抗體。
[0015]本發(fā)明有益效果是:本發(fā)明的腸道病毒71型抗原抗體的快速雙向乳膠凝集檢測方法操作簡單、快捷、價格低廉且無需應(yīng)用專業(yè)儀器設(shè)備，適于腸道病毒71型的早期篩查和臨床輔助診斷，尤其適應(yīng)于普通的鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣使用。同時，本方法無需攜帶標(biāo)記的二抗，直接進(jìn)行抗原抗體的凝集反應(yīng)，因此不僅可以檢測人源抗體還可以檢測動物源抗體，如小鼠，兔子等實(shí)驗動物來源的血樣。因此可以廣泛應(yīng)用于科研實(shí)驗中的相關(guān)動物實(shí)驗。
[0016]本發(fā)明不僅可以檢測人源性血清中的抗EV71的IgG，還適應(yīng)于動物源性的血清。抗原檢測試劑盒可以檢測不同來源樣本中的EV71抗原。由于采用了共價偶聯(lián)的技術(shù)，克服了蛋白致敏普通乳膠時，致敏抗原量少、不穩(wěn)定、致敏后的蛋白容易脫落等缺點(diǎn)。同時，采用VPl蛋白作為抗原，與全病毒相比使該方法具有更高的生物安全性。本發(fā)明建立的檢測方法可用于腸道病毒71型的血清流行病學(xué)調(diào)查、臨床輔助診斷以及EV71病毒的復(fù)制調(diào)控、抗病毒治療藥物篩選等科研領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為超聲波破碎后初步純化的VPl蛋白聚丙烯酰胺電泳；
圖2為Ni柱進(jìn)行親和純化的VPl蛋白聚丙烯酰胺電泳；
圖3為ffestern-blot檢測VPl蛋白；
圖4為羧化乳膠微球羧基基團(tuán)和碳化二亞胺以化學(xué)鍵連接； 圖5為乳膠凝集抗體檢測試劑盒檢測不同來源血清樣本中的抗EV71 VPl抗體；
圖6為EV71病毒在VERO細(xì)胞上產(chǎn)生細(xì)胞病變；
圖7為乳膠凝集抗原檢測試劑盒檢測VPl蛋白和病毒培養(yǎng)上清，其中原液為2M0I。

【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0019]實(shí)施例1
EV71單克隆抗體的制備
本產(chǎn)品的關(guān)鍵原料為EV71單克隆抗體和VPl純化蛋白，二者的研發(fā)及制備地點(diǎn)均為中國科學(xué)院武漢病毒研究所。
[0020]EV71單克隆抗體制備:用原核表達(dá)純化的EV71 VPl蛋白，分別免疫BALB/c小鼠，常規(guī)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，用ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞并測定效價，篩選出具有抗EV71抗體高分泌性、高親合力的雜交瘤細(xì)胞作為原始細(xì)胞株準(zhǔn)備投入生產(chǎn)，液氮中存放保存。將按上述方法篩選得到的細(xì)胞種子從_173°C液氮罐中取出，盡快融化，在37°C培養(yǎng)獲得一級種子液，同樣條件培養(yǎng)得二級種子液，然后將種子液移至細(xì)胞培養(yǎng)缸中，于37°C的二氧化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液。上述培養(yǎng)液通過離心后獲取上清液，再經(jīng)膜分離系統(tǒng)過濾，收集到的上清液即為含EV71單抗的粗提物。將粗提物分別經(jīng)過親和層析，收集抗體，再經(jīng)濃縮管濃縮至規(guī)定濃度。配制的2種包含不同EV71核心位置的抗體溶液，分別灌裝、凍干成凍干管，_80°C保存?zhèn)溆?。生產(chǎn)時其中一種用于膠體金標(biāo)記蛋白的制備，另一種用于包被于硝酸纖維膜上。
[0021]實(shí)施例2
EV71 VPl純化蛋白的生產(chǎn)，即把EV71-C4標(biāo)準(zhǔn)株的VPl基因克隆入原核表達(dá)載體pET-28a，BL21大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)EV71病毒VPl蛋白，Ni柱進(jìn)行親和純化:如圖1-圖3所示，在平板上選擇陽性菌落接種于卡那平板上，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600約等于0.6時加IPTG至終濃度為0.4mM,繼續(xù)培養(yǎng)3h，無菌條件下取Iml菌液樣本，10000r/min離心lmin，取沉淀按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達(dá)情況。取誘導(dǎo)表達(dá)3h的細(xì)菌培養(yǎng)物8000r/min離心lOmin，收集細(xì)菌，加1/10原培養(yǎng)物體積的緩沖液A重懸，強(qiáng)超聲波處理約8次，1s/次(冰上操作)，直到液體變?yōu)橥该鳎?°C 12000r/min離心15min，取100 μ L上清備用，將沉淀加等體積(離心前)緩沖液A重懸，取100 μ L加100 μ L 2 X SDS凝膠加樣緩沖液，混勻后沸水浴5min，作為SDS-PAGE電泳樣品。剩下的可置_80°C備用。Western_blot方法鑒定所表達(dá)純化的蛋白的免疫原性。
[0022]實(shí)施例3
腸道病毒71型抗原抗體的快速雙向乳膠凝集檢測試劑盒的建立，如圖4-圖7所示:
1、通過碳化二亞胺把純化后的蛋白或者單克隆抗體偶聯(lián)到乳膠顆粒上。具體步驟為:a.取125 μ L 10%羧化膠乳放入離心管中；b.碳酸緩沖液(pH9.6)洗3遍；c.磷酸緩沖液(ρΗ4.5)洗3遍；d.加入水溶性碳化二亞胺(EDC)在磷酸緩沖液(pH4.5)中室溫作用3h ；e.硼酸緩沖液(pH8.0)洗3遍；f.在膠乳懸液中加入VPl蛋白質(zhì)抗原或混合單抗,搖床上感作6小時；g.膠乳抗體檢測試劑懸浮于貯存液中。
[0023]2、遵循固定其它條件，改換其中一個條件的原則，摸索本發(fā)明方法的最佳的偶聯(lián)蛋白量，最佳的偶聯(lián)時間，最佳的膠乳濃度，偶聯(lián)反應(yīng)終止劑和封閉劑的選擇等。
[0024]最佳的碳化二亞胺的工作液濃度為1.0-2.3%，如2%，即5g溶解在250ml雙蒸水中，最佳的碳化二亞胺的反應(yīng)終濃度為60-80 μ 1，如2%碳化二亞胺加入到Iml ρΗ4.5的磷酸鹽緩沖液懸浮的乳膠溶液中，最佳的碳化二亞胺的反應(yīng)時間為2.5-3小時；
偶聯(lián)蛋白量為20-70ug，偶聯(lián)時間為4.5-9.6小時，所述的乳膠濃度為110_180ul ；偶聯(lián)反應(yīng)終止劑為20-60 μ I的0.1M乙醇胺溶液加入l-2mlpH8.0硼酸緩沖液懸浮的乳膠溶液中制得；
最佳的偶聯(lián)蛋白量為20-70ug，最佳的偶聯(lián)時間為4.5-9.6小時，最佳的乳膠濃度為110-180ul ;最佳的緩沖液用量為Iml緩沖液/150 μ I羧化乳膠；
最佳的偶聯(lián)反應(yīng)終止劑為20-60 μ I的0.1M乙醇胺溶液加入l-2mlpH8.0硼酸緩沖液懸浮的乳膠溶液中制得。
[0025]3、腸道病毒71型抗原抗體的快速雙向乳膠凝集檢測試劑盒的組裝:將上述制備好的致敏乳膠，陰陽性對照，載玻片，膠棒組裝成檢測試劑盒。
[0026]實(shí)施例4
本發(fā)明腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒的檢測方法及結(jié)果。
[0027]1、檢測方法:用移液器吸取15 μ L乳膠試劑至載玻片上，吸取15 μ L待檢血清或者含病毒的樣本與乳膠混勻，并用塑膠棒旋轉(zhuǎn)攪勻，感作2-5分鐘后，即可進(jìn)行結(jié)果判定，依據(jù)凝集反應(yīng)的強(qiáng)度由弱至強(qiáng)可以分為“-”、“ + ”、“++”、“+++”、“++++”。
[0028]2、檢測結(jié)果:本發(fā)明的檢測試紙條在紹興市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行臨床考核，包括手足口病門診患者、手足口病入院患者、肝病中心住院兒童、感染科各種疾病住院兒童，共考核了 600名臨床患兒及400份健康體檢幼兒的血清樣本。臨床實(shí)驗驗證的結(jié)果表明腸道病毒71型抗原抗體的快速雙向乳膠凝集檢測試劑盒，準(zhǔn)確度高，特異性好，其中對血清樣本抗體檢測考核結(jié)果:準(zhǔn)確度為89.5%，特異度為92.4%，靈敏度為81.3%，陽性樣本與商業(yè)化的ELISA檢測試劑盒的符合率為82.6%，陰性樣本與PCR的符合率為94.5% ;對抗原檢測的考核結(jié)果:用本發(fā)明的抗原檢測乳膠試劑盒抗原檢測包含2 MOI EV71病毒的原液至100倍稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清。對病毒含量低的咽拭子、肛拭子等檢出率較低，real-time PCR檢測，病毒拷貝數(shù)較高的樣本呈乳膠凝集實(shí)驗“ + ”或“++”。
[0029]本發(fā)明的腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒制備后，對試劑盒的特異性、敏感性、重復(fù)性和保存期等進(jìn)行了測定和優(yōu)化。
[0030]本發(fā)明的抗體檢測試劑可適用于人及動物來源血清中EV71抗體的檢測，且操作簡便、價格低廉、可即時得知結(jié)果，非常方便各醫(yī)療機(jī)構(gòu)快速輔助診斷?？乖瓩z測乳膠凝集試劑盒可以檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒復(fù)制水平高低差異，對于研究EV71病毒的復(fù)制調(diào)控、抗病毒治療藥物篩選等方面具有重要的應(yīng)用前景。
[0031]上面所述的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明技術(shù)方案做出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒，其特征在于由以下物質(zhì)組成: (1)致敏原核表達(dá)腸道病毒71型VPl特異性抗原的羧化乳膠試劑； (2)致敏三株針對腸道病毒71型VPl的單克隆混合抗體的羧化乳膠試劑； (3)腸道病毒71型陰陽性標(biāo)準(zhǔn)血清，滅活病毒溶液及PBS 和(4)含有可供致敏乳膠進(jìn)行凝集反應(yīng)的玻片平臺及用于混勻乳膠和待反應(yīng)血清的牙簽或塑膠棒。
2.一種腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)制備三種EV71單克隆抗體:用原核表達(dá)純化的EV71VPl蛋白免疫BALB/c小鼠，采用常規(guī)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備若干株雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后收集培養(yǎng)液，然后用免疫印跡方法篩選出三株特異性敏感性均較高的三株，進(jìn)行層析純化后濃縮并凍干，_80°C保存?zhèn)溆茫? (2)pET-28a-VPl的構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化:把EV71-C4標(biāo)準(zhǔn)株的VPl基因克隆入原核表達(dá)載體pET-28a，BL21大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)EV71病毒VPl蛋白，Ni柱進(jìn)行親和純化，_80°C保存?zhèn)溆茫? (3)羧化乳膠凝集方法的建立:通過碳化二亞胺把純化后的蛋白或者單克隆抗體偶聯(lián)到乳膠顆粒上，遵循固定其它條件，改換其中一個條件的原則，摸索偶聯(lián)蛋白量，偶聯(lián)時間，膠乳濃度，選擇偶聯(lián)反應(yīng)終止劑和封閉劑； 所述碳化二亞胺的工作液濃度為1.0-2.3%，碳化二亞胺的反應(yīng)終濃度為60-80 μ 1，碳化二亞胺的反應(yīng)時間為2.5-3小時； 所述的偶聯(lián)蛋白量為20-70ug，偶聯(lián)時間為4.5-9.6小時，所述的乳膠濃度為110-180ul ； 所述的偶聯(lián)反應(yīng)終止劑為20-60 μ I的0.1M乙醇胺溶液加入l-2mlpH8.0硼酸緩沖液懸浮的乳膠溶液中制得； (4)腸道病毒71型抗原抗體的快速雙向乳膠凝集檢測試劑盒的組裝:將上述制備好的致敏乳膠、陰陽性對照、載玻片和膠棒組裝成檢測試劑盒。
3.如權(quán)利要求2所述腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中通過碳化二亞胺把純化后的蛋白或者單克隆抗體偶聯(lián)到乳膠顆粒上的具體步驟為: Ca)取羧化膠乳放入離心管中，用pH9.6的碳酸緩沖液洗3遍后，再用pH4.5的磷酸緩沖液洗3遍； (b)加入水溶性碳化二亞胺在pH4.5的磷酸緩沖液中室溫作用3h ； (c)用pH8.0硼酸緩沖液洗3遍； (d)在膠乳懸液中加入VPl蛋白質(zhì)抗原或混合單抗,搖床上感作6小時后,將膠乳抗體檢測試劑懸浮于貯存液中。
4.如權(quán)利要求2所述腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒的制備方法，其特征在于:所述的腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒制備后，對試劑盒的特異性、敏感性、重復(fù)性和保存期等進(jìn)行了測定和優(yōu)化。
5.一種腸道病毒71型乳膠凝集檢測試劑盒在檢測腸道病毒71型抗原和抗體中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/569GK104407145SQ201410586139
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】欽博, 屠春雨, 傅利軍, 何婷婷 申請人:紹興市疾病預(yù)防控制中心