免疫親和柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定海洋生物中河豚毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種免疫親和柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定海洋生物中河豚毒素的方法，其基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏性和精確性，利用免疫親和柱的獨(dú)特選擇識(shí)別性，能快速、簡便、高效測(cè)定海洋生物中的河豚毒素。
【專利說明】免疫親和柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定海洋生物中河 豚毒素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種河豚毒素的檢測(cè)方法，特別涉及一種免疫親和柱凈化-液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定海洋生物中河豚毒素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX)是一種天然海洋生物神經(jīng)毒素，分布廣泛，主要存 在于河豚魚中，圓尾鱟、藍(lán)環(huán)章魚、螺類等其他動(dòng)物體內(nèi)也有存在。河豚毒素毒性極強(qiáng)，食用 〇. 5mg就可致人死亡，其帶正電荷的胍基能伸入鈉通道的離子選擇過濾器，和通道內(nèi)壁上的 游離羧基結(jié)合，阻礙鈉離子進(jìn)入，從而抑制神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，使人感覺神經(jīng)麻痹，四肢癱瘓， 呼吸困難，最后因呼吸抑制而死亡。我國每年都有因食帶有TTX的海洋生物而導(dǎo)致中毒的 事件發(fā)生。鑒于河豚毒素的嚴(yán)重危害，有必要建立一種簡便、能有效檢測(cè)河豚毒素的方法。
[0003] 目前，河豚毒素的檢測(cè)方法有生物測(cè)定法、高效液相色譜法（HPLC)、液相色譜串聯(lián) 質(zhì)譜法（LC-MS)及酶聯(lián)免疫法（ELISA)等。其中生物測(cè)定法一般需要專門動(dòng)物，適用性差， 且操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力重復(fù)性差；酶聯(lián)免疫法雖特異性強(qiáng)，但酶聯(lián)免疫反應(yīng)耗時(shí)長，操作難 度較大；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，但現(xiàn)有的文獻(xiàn)方法檢出限偏高，前處理復(fù)雜，且采 用的固相萃取技術(shù)凈化樣品不理想、易受基質(zhì)干擾，回收率低。免疫親和柱（IAC)是一種基 于抗原抗體反應(yīng)的新型層析柱，利用生物大分子具有對(duì)一類生物大分子特異識(shí)別和可逆結(jié) 合的特性制作而成，具有獨(dú)特的選擇專一性和良好的吸附凈化性能。目前，尚未有以免疫親 和柱作為前處理凈化手段檢測(cè)河豚毒素的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種免疫親和柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定海洋生物 中河豚毒素的方法，其基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏性和精確性，利用免疫親和柱的獨(dú) 特選擇識(shí)別性，能快速、簡便、高效測(cè)定海洋生物中的河豚毒素。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是： 一種免疫親和柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定海洋生物中河豚毒素的方法，包括以 下步驟： (1) 樣品處理：準(zhǔn)確稱取已充分均質(zhì)樣品2. OOg于50mL具塞離心管中，加入IOmL含有 1 %乙酸的甲醇溶液，潤旋振蕩2min，6(TC水浴超聲提取15min，冷卻至室溫后，6000r/min 離心5min，移取5mL上清液至另一 50mL離心管中，加入20ml PBS溶液進(jìn)行稀釋，用lmol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7?8,得樣品液； (2) 免疫親和柱凈化：免疫親和柱上樣品液，上樣結(jié)束后，用水淋洗親和柱，擠干柱內(nèi) 殘留液，并棄去以上全部流出液，最后用含有1 %乙酸的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液于 60°C氮?dú)獯蹈?，用ImL流動(dòng)相定容溶解得凈化液； (3) 液相色譜-質(zhì)譜分析：凈化液經(jīng)濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定獲得河 豚毒素的峰面積，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線分析計(jì)算，從而獲得樣品中河豚毒素的含量。
[0006] 本發(fā)明開發(fā)了獨(dú)特的樣品處理工藝及制備了對(duì)TTX獨(dú)特選擇識(shí)別性的免疫親和 柱，配合優(yōu)化的液相色譜-質(zhì)譜分析方法，能快速、簡便、高效測(cè)定海洋生物中的河豚毒素 作為優(yōu)選，步驟（2)中流動(dòng)相配比為：含0. 1%甲酸的5mmol/L乙酸銨溶液：乙腈= 5% :95%。
[0007] 作為優(yōu)選，步驟（3)中色譜條件為：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide柱；樣品室 溫度KTC;柱溫40°C;進(jìn)樣體積10 μ L ;流速0. 3mL/min ;流動(dòng)相A為含0. 1 %甲酸的5mmol/ L乙酸銨溶液，B為乙腈，梯度洗脫：0?I. 5min，5 %?80% A ; L 5?3. Omin, 80% A ;3· 0? 3. 5min，80%?5% A ;3· 5 ?5min，5% Α。
[0008] 作為優(yōu)選，步驟（3)中質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源，正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng) 監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：3. OkV ;離子源溫度：110°C ;脫溶劑氣溫度：350°C ;錐孔氣流量：50L/h ; 脫溶劑氣流量：600L/h。
[0009] 作為優(yōu)選，步驟（3)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法為：配制濃度為0. 3μ g/L、l. 0μ g/L、 2. 0 μ g/L、5. 0 μ g/L、10. 0 μ g/L和20. 0 μ g/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以TTX濃度為橫坐標(biāo)，峰面 積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0010] 作為優(yōu)選，所述免疫親和柱的制備方法為： A、抗原合成 免疫原的合成： 在小燒瓶中依次加入IOmg的BSA，2mL 0· 05M ρΗ7· 4乙酸鈉緩沖液，Img的TTX，60 μ L 的37% (質(zhì)量濃度）的甲醛，混勻，37°C攪拌48h。然后用0. IM ρΗ7. 3的PBS緩沖液，于 4°C透析3天，每天換液2次，免疫原TTX-BSA ;此抗原用作免疫。
[0011] 檢測(cè)原的合成： 用OVA替代BSA，按照免疫原的合成方法合成檢測(cè)原TTX-0VA，用于ELISA實(shí)驗(yàn)的包被。
[0012] B、單克隆抗體制備及純化 取5只，6?8周齡的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多點(diǎn)注射TTX-BSA，20 μ g/只，免疫4 周后開始加強(qiáng)免疫，每隔2周加強(qiáng)免疫1次；初次免疫時(shí)，用TTX-BSA與等體積弗氏完全佐 劑乳化，加強(qiáng)免疫時(shí)用TTX-BSA與等體積弗氏不完全佐劑乳化，免疫劑量、免疫方式不變； 第2次加強(qiáng)免疫10天后，取小鼠尾靜脈血檢測(cè)，包被TTX-0VA，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢 測(cè)血清的效價(jià)，選擇效價(jià)最高的BALB/c小鼠用于制備雜交瘤細(xì)胞，融合前3天小鼠腹腔加 強(qiáng)免疫一次，取效價(jià)最高的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0融合，篩選獲得雜交瘤 細(xì)胞； BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL液體石蠟致敏，8天后向小鼠腹腔內(nèi)注射I X IO7個(gè)雜交瘤 細(xì)胞，10天后開始用注射器從小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1天抽取腹水1次，離心，收集上 清液，采用飽和硫酸銨法純化上清液，再用ProteinG親和層析法進(jìn)一步純化獲得TTX單克 隆抗體； C、親和柱制備 稱取0· 5g CNBr活化的S印harose 4B干粉用IOOmL IM HCl溶脹，并洗滌；再用IOOmL 偶聯(lián)緩沖液（〇· Imol · L-1NaHCO3A. 5mol · L-1NaCl, ρΗ8· 3)洗滌得凝膠； 取I. 5mL溶脹后的凝膠，加入I. 5mL 10mg/mL的TTX單克隆抗體，室溫振蕩 偶聯(lián)反應(yīng)2h，抽濾，并用30mL偶聯(lián)緩沖液洗滌凝膠，抽濾，加入IOmL封閉緩沖液 (0· Imol .L-ITris-HCLpH 8.0)，室溫振蕩反應(yīng) 2h，抽濾，再用 100mLPBS(0.01M ρΗ7·3) 緩沖液洗滌凝膠，并轉(zhuǎn)移到5mL柱管中，加入含有0. 05 %硫柳汞及0. 05% BSA的0. OlM pH7. 3PBS溶液，于2?8°C儲(chǔ)存。
[0013] 作為優(yōu)選，偶聯(lián)緩沖液組成為：0· lmol/L NaHC03,0. 5mol/L NaCl，ρΗ8· 3。
[0014] 作為優(yōu)選，封閉緩沖液為0· lmol/L的Tris-HCl，pH 8· 0。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏性和精確性，利用 免疫親和柱的獨(dú)特選擇識(shí)別性，能快速、簡便、高效測(cè)定海洋生物中的河豚毒素。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是TTX -級(jí)質(zhì)譜全掃描圖。
[0017] 圖2是提取試劑酸度對(duì)TTX提取效果的影響。
[0018] 圖3是樣品液PH對(duì)樣品中TTX的回收率的影響。
[0019] 圖4是10 μ g/kg加標(biāo)陰性樣品經(jīng)免疫親和柱凈化后的MRM圖譜。
[0020] 圖5是0· 3 μ g/mL的TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面通過具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0022] 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0023] 儀器和試劑 ACQUITY超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀Quattro Premier XE (美國Waters公司）；MS2 漩潤混合器（德國IKA公司）；氮?dú)獯蹈蓛x（美國Organomatio公司）；Centrifuge5810高 速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；12通道固相萃取裝置（美國supelco公司）。 TTX標(biāo)準(zhǔn)品（純度彡98. 0%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲醇（色譜純，德國 Merck公司）；乙酸銨、甲酸（美國Sigma公司）；乙酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二 氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉（上海國藥集團(tuán)）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。
[0024] 溶液的配制 (I)TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取5, OOmgTTX標(biāo)準(zhǔn)品，用含有0. 1 %甲酸乙腈-水溶液（1 : I(VV))溶解定容至50mL，4°C避光保存，保存期限為6個(gè)月；使用時(shí)逐級(jí)用含有0. 1%甲酸 乙腈-水溶液（I :1(V/V))稀釋至100ng/mL。
[0025] (2)磷酸鹽緩沖液（PBS):分別稱取十二水合磷酸氫二鈉6. 45g，二水合磷酸二氫 鈉I. 〇9g，氯化鈉4. 25g，用水溶解并定容至500mL。
[0026] 實(shí)施例： 一種免疫親和柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定海洋生物中河豚毒素的方法，包括以 下步驟： (1)樣品處理：準(zhǔn)確稱取已充分均質(zhì)樣品2. OOg于50mL具塞離心管中，加入IOmL含有 1 %乙酸的甲醇溶液，潤旋振蕩2min，6(TC水浴超聲提取15min，冷卻至室溫后，6000r/min 離心5min，移取5mL上清液至另一 50mL離心管中，加入20ml PBS溶液進(jìn)行稀釋，用lmol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7?8,得樣品液。
[0027] (2)免疫親和柱凈化：免疫親和柱上樣品液，上樣結(jié)束后，用水淋洗親和柱，擠干 柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液，最后用含有1%乙酸的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液 于601：氮?dú)獯蹈桑?1^流動(dòng)相（含0.1(%甲酸的5111111〇1/1乙酸銨溶液 ：乙腈=5(%:95(%) 定容溶解得凈化液。
[0028] 免疫親和柱的制備方法為： A、抗原合成 免疫原的合成： 在小燒瓶中依次加入IOmg的BSA，2mL 0· 05M ρΗ7· 4乙酸鈉緩沖液，Img的TTX，60 μ L 的37% (質(zhì)量濃度）的甲醛，混勻，37°C攪拌48h。然后用0. IM ρΗ7. 3的PBS緩沖液，于 4°C透析3天，每天換液2次，免疫原TTX-BSA ;此抗原用作免疫。
[0029] 檢測(cè)原的合成： 用OVA替代BSA，按照免疫原的合成方法合成檢測(cè)原TTX-0VA，用于ELISA實(shí)驗(yàn)的包被。
[0030] B、單克隆抗體制備及純化 取5只，6?8周齡的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多點(diǎn)注射TTX-BSA，20 μ g/只，免疫4 周后開始加強(qiáng)免疫，每隔2周加強(qiáng)免疫1次；初次免疫時(shí)，用TTX-BSA與等體積弗氏完全佐 劑乳化，加強(qiáng)免疫時(shí)用TTX-BSA與等體積弗氏不完全佐劑乳化，免疫劑量、免疫方式不變。
[0031] 第2次加強(qiáng)免疫10天后，取小鼠尾靜脈血檢測(cè)，包被TTX-0VA，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法檢測(cè)血清的效價(jià)，選擇效價(jià)最高的BALB/c小鼠用于制備雜交瘤細(xì)胞，融合前3天小鼠腹 腔加強(qiáng)免疫一次，取效價(jià)最高的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0融合，篩選獲得雜 交瘤細(xì)胞（現(xiàn)有常規(guī)方法）。
[0032] BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL液體石蠟致敏，8天后向小鼠腹腔內(nèi)注射I X IO7個(gè)雜 交瘤細(xì)胞，10天后開始用注射器從小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1天抽取腹水1次，離心，收 集上清液，采用飽和硫酸銨法純化上清液，再用ProteinG親和層析法進(jìn)一步純化獲得TTX 單克隆抗體。
[0033] C、親和柱制備 稱取0· 5g CNBr活化的S印harose 4B干粉（市售）用IOOmL IM HCl溶脹，并洗滌；再 用 IOOmL 偶聯(lián)緩沖液（0· Imol .L-1NaHOVO. 5mol .L-1NaCl, ρΗ8· 3)洗滌得凝膠（已溶脹）。
[0034] 取I. 5mL溶脹后的凝膠，加入I. 5mL 10mg/mL的TTX單克隆抗體，室溫振 蕩偶聯(lián)反應(yīng)2h，抽濾，并用30mL偶聯(lián)緩沖液洗滌凝膠，抽濾，加入IOmL封閉緩沖液 (0· Imol .L-ITris-HCl，pH 8.0)，室溫振蕩反應(yīng) 2h，抽濾，再用 IOOmLPBS ((XOlM ρΗ7· 3) 緩沖液洗滌凝膠，并轉(zhuǎn)移到5mL柱管中，加入含有0.05%硫柳汞及0.05% BSA的0. OlM pH7. 3PBS溶液，于2?8°C儲(chǔ)存。
[0035] (3)液相色譜-質(zhì)譜分析： 色譜條件為：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide柱；樣品室溫度KTC ;柱溫40°C ;進(jìn)樣 體積10 μ L ;流速0. 3mL/min ;流動(dòng)相A為含0. 1 %甲酸的5mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈， 梯度洗脫：〇 ?I. 5min，5%?80% A ;1· 5 ?3. 0min，80% A ;3· 0 ?3. 5min，80%?5% A ; 3. 5 ?5min，5% A0
[0036] 質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源，正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓： 3. OkV ;離子源溫度：110°C ;脫溶劑氣溫度：350°C ;錐孔氣流量：50L/h ;脫溶劑氣流量： 600L/h。
[0037] 錐孔電壓、碰撞能量、分析物母離子及子離子等質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件如表1 所示。
[0038] 表1河豚毒素的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件

【權(quán)利要求】
1. 一種免疫親和柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定海洋生物中河豚毒素的方法，其特 征在于，包括以下步驟： (1) 樣品處理：準(zhǔn)確稱取已充分均質(zhì)樣品2. OOg于50mL具塞離心管中，加入10mL含有 1%乙酸的甲醇溶液，潤旋振蕩2min，60°C水浴超聲提取15min，冷卻至室溫后，6000r/min 離心5min，移取5mL上清液至另一 50mL離心管中，加入20ml PBS溶液進(jìn)行稀釋，用lmol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7?8,得樣品液； (2) 免疫親和柱凈化：免疫親和柱上樣品液，上樣結(jié)束后，用水淋洗親和柱，擠干柱內(nèi) 殘留液，并棄去以上全部流出液，最后用含有1 %乙酸的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液于 60°C氮?dú)獯蹈?，用lmL流動(dòng)相定容溶解得凈化液； (3) 液相色譜-質(zhì)譜分析：凈化液經(jīng)濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定獲得河 豚毒素的峰面積，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線分析計(jì)算，從而獲得樣品中河豚毒素的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中流動(dòng)相配比為：含0.1 %甲酸 的5mmol/L乙酸銨溶液：乙腈=5% :95%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3)中色譜條件為：色譜柱： ACQUITYUPLC BEH Amide 柱；樣品室溫度 KTC;柱溫40°C;進(jìn)樣體積 10 y L ;流速0. 3mL/min ; 流動(dòng)相A為含0. 1%甲酸的5mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈，梯度洗脫：0?1.5min，5%? 80% A ;1. 5 ?3. 0min，80% A ;3. 0 ?3. 5min，80%?5% A ;3. 5 ?5min，5% A。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3)中質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源， 正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：3. OkV ;離子源溫度：11(TC ;脫溶劑氣溫 度：350°C ;錐孔氣流量：50L/h ;脫溶劑氣流量：600L/h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：步驟（3)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 方法為：配制濃度為 〇? g/L、l. Oil g/L、2. Oil g/L、5. Oil g/L、10. Oil g/L 和 20. Oil g/L 的 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以TTX濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述免疫親和柱的制備方法為： A、 抗原合成 免疫原的合成： 在小燒瓶中依次加入l〇mg的BSA，2mL 0? 05M pH7. 4乙酸鈉緩沖液，lmg的TTX，60 ii L 的37%的甲醛，混勻，371：攪拌4811，然后用0.說？117.3的？85緩沖液，于41：透析3天，每 天換液2次，免疫原TTX-BSA ; 檢測(cè)原的合成： 用OVA替代BSA，按照免疫原的合成方法合成檢測(cè)原TTX-0VA ; B、 單克隆抗體制備及純化 取5只，6?8周齡的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多點(diǎn)注射TTX-BSA，20 y g/只，免疫4 周后開始加強(qiáng)免疫，每隔2周加強(qiáng)免疫1次；初次免疫時(shí)，用TTX-BSA與等體積弗氏完全佐 劑乳化，加強(qiáng)免疫時(shí)用TTX-BSA與等體積弗氏不完全佐劑乳化，免疫劑量、免疫方式不變； 第2次加強(qiáng)免疫10天后，取小鼠尾靜脈血檢測(cè)，包被TTX-0VA，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢 測(cè)血清的效價(jià)，選擇效價(jià)最高的BALB/c小鼠用于制備雜交瘤細(xì)胞，融合前3天小鼠腹腔加 強(qiáng)免疫一次，取效價(jià)最高的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0融合，篩選獲得雜交瘤 細(xì)胞； BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL液體石蠟致敏，8天后向小鼠腹腔內(nèi)注射1 X 107個(gè)雜交瘤 細(xì)胞，10天后開始用注射器從小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1天抽取腹水1次，離心，收集上 清液，采用飽和硫酸銨法純化上清液，再用ProteinG親和層析法進(jìn)一步純化獲得TTX單克 隆抗體； C、親和柱制備 稱取0? 5g CNBr活化的S印harose 4B干粉用100mL 1M HC1溶脹，并洗滌；再用100mL 偶聯(lián)緩沖液洗滌得凝膠； 取1. 5mL溶脹后的凝膠，加入1. 5mL 10mg/mL的TTX單克隆抗體，室溫振蕩偶聯(lián)反應(yīng) 2h，抽濾，并用30mL偶聯(lián)緩沖液洗滌凝膠，抽濾，加入10mL封閉緩沖液，室溫振蕩反應(yīng)》1， 抽濾，再用1〇〇1111^85緩沖液洗滌凝膠，并轉(zhuǎn)移到51^柱管中，加入含有0.05%硫柳汞及 0? 05% BSA 的 0? 01M pH7. 3PBS 溶液，于 2 ?8°C儲(chǔ)存。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：偶聯(lián)緩沖液組成為：0. lmol/L NaHC03， 0?5mol/L NaCl，pH8. 3。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：封閉緩沖液為0. lmol/L的Tris-HCl， pH8. 0〇
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK104391061SQ201410603308
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】張小軍, 王瑩, 倫麗麗 申請(qǐng)人:浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 江蘇美正生物科技有限公司