內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測肝毒性方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于代謝組學(xué)的內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測肝毒性方面的應(yīng)用。其中內(nèi)源性小分子物質(zhì)指12個肝毒性生物標記物L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-肉堿、L-肉堿棕櫚酰、色氨酸、花生四烯酸、膽酸、溶血磷脂酰膽堿(14:0)、溶血磷脂酰膽堿(16:1)、溶血磷脂酰膽堿(18:2)、溶血磷脂酰膽堿(20:3)、溶血磷脂酰乙醇胺(18:2)；同時也指3個肝毒性專屬生物標記物L-肉堿、膽酸、溶血磷脂酰膽堿(14:0)。本發(fā)明篩選得到的肝毒性生物標記物使肝損傷的發(fā)現(xiàn)與診斷較現(xiàn)有生化檢測指標有所提前，能夠更好的用于肝臟毒性的預(yù)防、發(fā)現(xiàn)和治療，彌補現(xiàn)有指標的局限性，及時提供準確的檢測信息。
【專利說明】內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測肝毒性方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到使用代謝組學(xué)技術(shù)尋找肝毒性生物標記物，然后對其進行專屬性考 察，接著使用支持向量機（SVM)對它們進行驗證與優(yōu)化。更具體地說是內(nèi)源性小分子物質(zhì) 在快速檢測肝毒性方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 肝臟在物質(zhì)代謝的過程發(fā)揮著重要作用，因此它成為毒性物質(zhì)損害的主要靶器 官。肝毒性是藥物開發(fā)中面臨的重大安全性問題，同時也是臨床前試驗失敗和藥物撤回的 常見原因。目前，血液天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)是常用于檢測肝功能 的兩項指標，但其由于缺乏特異性和敏感性而不能及時的發(fā)現(xiàn)肝損傷狀況。因此，目前亟需 我們建立一種能夠早期、準確的肝毒性評價方法，以彌補現(xiàn)有指標的局限性。代謝組學(xué)是系 統(tǒng)生物學(xué)的重要分支，它作為一種新興技術(shù)在毒性評價、藥物代謝分析、疾病診斷等方面取 得了突破性的進展。代謝組學(xué)作為一種理想的毒性評價手段，不僅能夠反映毒性物質(zhì)本身 的代謝變化，同時還能夠有效的表現(xiàn)出毒性物質(zhì)對機體代謝網(wǎng)絡(luò)的影響。代謝組學(xué)在毒性 評價上具有靈敏度高、分析簡便快捷的特點。如今，超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì) 譜（UPLC/Q-T0F-MS)以其精確、靈敏、高通量等優(yōu)點為代謝組學(xué)的更廣泛應(yīng)用提供了強大的 技術(shù)支持，與此同時卻帶來了龐雜的數(shù)據(jù)處理過程。因此，我們需要尋找更為有效的數(shù)據(jù)處 理方法。機器學(xué)習能夠從數(shù)據(jù)里提取規(guī)則或模式來把數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成信息，找到內(nèi)在的相互依 賴關(guān)系，對未知數(shù)據(jù)進行預(yù)測和判斷。支持向量機作為機器學(xué)習的一種，其基于非線性計算 的統(tǒng)計學(xué)習理論，能夠彌補主成分分析（PCA)和偏最小二乘-判別分析（PLS-DA)無 法診斷 或區(qū)分以及提供量化的評估信息的缺點，能有效的對特征代謝物的聯(lián)合診斷進行評估，同 時在解決小樣本、非線性及高維模式識別數(shù)據(jù)上表現(xiàn)出特有的優(yōu)勢。因此，將SVM與代謝組 學(xué)技術(shù)相結(jié)合，用于生物標志物的篩選、驗證與優(yōu)化以及潛在生物標志物對疾病的預(yù)測方 面，能為代謝組學(xué)的進一步發(fā)展提供更廣闊的思路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明通過代謝組學(xué)技術(shù)與SVM相結(jié)合發(fā)現(xiàn)肝毒性生物標記物使肝損傷的發(fā)現(xiàn) 與診斷較現(xiàn)有生化檢測指標有所提前，能夠更好的用于肝臟毒性的預(yù)防、發(fā)現(xiàn)和治療，彌補 現(xiàn)有指標的局限性。及時提供準確的檢測信息。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)方案： 內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測肝毒性方面的應(yīng)用，特別是在快速判斷肝臟是否受 到損傷方面的應(yīng)用。其中所述的內(nèi)源性小分子物質(zhì)指肝毒性生物標記物，它們是基于代 謝組學(xué)技術(shù)篩選出來的，包括L-丙氨酸（L-alanine)、L-肉堿（L-carnitine)、L-苯丙 氨酸（L-Phenylalanine)、色氨酸（Tryptophan)、花生四烯酸（Arachidonic acid)、左旋 肉堿棕櫚酰（L-Palmitoyl carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [Lys0PC(14:0)]、溶血磷脂酰膽堿（16:1) [Lys0PC(16:l)]、溶血磷脂酰膽堿（18:2)
[LysoPC (18:2)]、溶血磷脂酰膽堿（20:3) [LysoPC (20:3)]、溶血磷脂酰乙醇胺（18:2) [LysoPE (18:2)]，它們能夠快速檢測肝毒性。在肝毒性生物標記物的基礎(chǔ)上經(jīng)過SVM驗 證與優(yōu)化的內(nèi)源性小分子物質(zhì)指肝毒性專屬生物標記物，包括L-肉堿（L-carnitine)、膽 酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC(14:0)]，它們能夠快速判斷肝臟是否 受到損傷。由于體內(nèi)內(nèi)源性小分子物質(zhì)在肝臟受到毒性或者損傷作用時代謝發(fā)生變化， 我們研究表明以L-肉堿（L-carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC (14:0)]專屬性最強。所以更具體地說是內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測肝毒性以及 肝臟疾病方面的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明進一步公開了基于代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合SVM的肝毒性生物標志物的篩選方 法，包括樣品前處理、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理(多元統(tǒng)計分析)、生物標記物的專屬性考察、專屬 生物標記物的驗證與優(yōu)化等步驟。其特征在于：在數(shù)據(jù)采集中使用梯度洗脫的條件：〇_〇. 5 min，A: 99%-99%;0.5-2 min，A: 99%-50%;2-9 min，A: 50%-1%;9-10 min，A: 1%-1%; 10-10.5 min，A: 1%-99%;10.5-12 min，A: 99%-99%，其中流動相 A 指 0.1% 甲酸的水，流 動相B指0. 1%甲酸的乙腈；在專屬生物標記物的驗證與優(yōu)化中使用MATLAB R2010a軟件 (USA)基于肝毒性生物標記物建立SVM預(yù)測模型，該過程如下：將生物標記物在生理鹽水 組和各個藥物組中的峰面積作為輸入變量，隨機選擇數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集和測試集建立預(yù)測模 型，通過優(yōu)化找到最優(yōu)的懲罰參數(shù)（c)和核函數(shù)（g)，然后以逐一排除一個生物標志物為基 礎(chǔ)，利用SVM進行分類預(yù)測，得到相應(yīng)的模型預(yù)測準確度，分析準確度，對其是否與肝毒性 密切相關(guān)進行區(qū)分。
[0006] 我們經(jīng)過代謝組學(xué)技術(shù)篩選出肝毒性生物標記物，具體是L-丙氨酸 (L-alanine)、L-肉喊（L-carnitine)、L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine)、色氨酸 (Tryptophan)、花生四烯酸（Arachidonic acid)、左旋肉堿棕櫚酰（L-Palmitoyl carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC(14:0)]、溶血磷脂 酰膽堿（16:1) [Lys0PC(16:l)]、溶血磷脂酰膽堿（18:2) [Lys0PC(18:2)]、溶血磷脂酰 膽堿（20:3) [LysoPC(20:3)]、溶血磷脂酰乙醇胺（18:2) [LysoPE (18:2)]。肝毒性生物 標記物經(jīng)過專屬性考察、驗證與和優(yōu)化后得到肝毒性專屬生物標記物，具體是L-肉堿 (L-carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC(14:0)]。
[0007] 本發(fā)明更加詳細的技術(shù)方案如下： 1、樣品前處理：樣品處理前將血漿在室溫下解凍。然后，將300 μ L乙腈加入到100 μ L 血漿中，并渦旋混合1分鐘。接著將混合物在冰水浴中超聲10分鐘，然后以13000轉(zhuǎn)在4°C 下離心15分鐘。收集上清液用于UPLC/Q-T0F-MS分析。
[0008] 2、數(shù)據(jù)采集：使用UPLC/Q-T0F-MS系統(tǒng)(美國Waters公司）對大鼠血漿樣品進行 信息采集。色譜柱用 ACQUITY UPLC HSS C18 (2.1X100 mm，L7ym，美國 Waters 公司）， 柱溫為40°C，流速為0. 3mL/min，進樣量為5 μ L。UPLC分離系統(tǒng)包括二元溶劑系統(tǒng)，用流 動相A (0.1%甲酸的水）和流動相Β (0.1%甲酸的乙腈)。采用梯度洗脫，具體洗脫條 件：0-0· 5 min，A: 99%-99% ;0· 5-2 min，A: 99%-50% ;2-9 min，A: 50%-1% ;9-10 min，A: 1%-1%;10-10.5 min，A: 1%-99%;10.5-12 min，A: 99%-99%。質(zhì)譜采用電噴霧電離（ESI) 源，在正離子電離模式下進行質(zhì)譜分析。MS參數(shù)如下：干燥氣流速為10mL/min，干燥氣體溫 度為325°C，霧化氣氣壓為350 psi，脫溶劑氣流量600L/h，毛細管電離電壓3. 5 kV，四極桿 掃描范圍m/z50-1000。蒸發(fā)氣體和輔助氣體是高純度氮。用（[M+H]+= 556. 2771，[M-H]_ =554. 26)作為參考離子來確保光譜采集過程中的精度。為了確保代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集的可 靠性，我們從每個樣品中吸取等量的血漿混合成為QC樣品，用它們對儀器的穩(wěn)定性、方法 精密度進行監(jiān)控，直到整個系統(tǒng)在一個良好穩(wěn)定的狀態(tài)下才能開始樣品信息采集。同時在 24小時之內(nèi)，QC樣品每4個小時檢測一次，用來監(jiān)測整個采集過程中樣品與系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
[0009] 3、數(shù)據(jù)處理：本研究采用UPLC-Q-T0F-MS技術(shù)對大鼠的血漿樣本信息進行無靶向 分析。具體的數(shù)據(jù)處理過程如下：原始數(shù)據(jù)經(jīng)工作站中的Masslynx (Waters, USA)軟件采 集后，由Makerlynx software (Version 4.1)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對采集得到的譜圖進行離子對 的提取、峰對齊、峰匹配和峰強度校正等操作。然后將80%修約后的數(shù)據(jù)（Excel格式)導(dǎo)入 SIMCA-P12. 0統(tǒng)計軟件(瑞典Umetrics公司)進行多元統(tǒng)計分析。在UV模式下進行PLS-DA 分析，并驗證模型的可靠性，進而將篩選得到的對分類有顯著貢獻的化合物（VIP>1)作為候 選標記物。接著我們使用SPSS軟件對獲得潛在變量進行T檢驗，將P〈0. 05的物質(zhì)作為顯 著性差異的標記物。然后我們將它們進行整合化分析，篩選出四氯化碳組和柴胡組共有的 生物標記物，利用維恩圖譜（http: //bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index. html) 直觀地反映它們之間的關(guān)系。此外，與非肝毒性組數(shù)據(jù)進行比較，初步確定肝毒性專屬標 記物。接著，我們隨機選取數(shù)據(jù)(肝毒性組和非肝毒性組中生物標志物的峰面積）作為訓(xùn) 練集和預(yù)測集，通過采用MATLAB R2010a ( USA)對其建立SVM模型，將模型預(yù)測準確性高 的物質(zhì)最終視為肝毒性的專屬性生物標志物。繼而利用標記物的質(zhì)量數(shù)（m/z值）在HMDB (http://www. hmdb. ca/)數(shù)據(jù)庫和 KEGG (http://www. genome, jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫中查找可 能的物質(zhì)。最后，通過比較標準品和樣品之間的指紋圖譜來鑒定物質(zhì)。如果沒有標準品，我 們分析它們的MS/MS信息以及參考文獻等信息來確認候選的生物標記物。最后對專屬標記 物利用 MetPA (http://metpa. metabolomics. ca. /MetPA/faces/Home. jsp)數(shù)據(jù)庫進行代 謝通路分析。
[0010] 本發(fā)明的有益效果在于： 當肝臟的肝細胞膜受損或細胞壞死時，血液中的酶才會發(fā)生變化，且ALT并非肝損傷 發(fā)生時所特有的，因此傳統(tǒng)的血清免疫檢測會存在時效性差和特異性低的缺點。本發(fā)明篩 選出的肝毒性生物標志物具有較強的靈敏性和特異性。它們可以在肝臟組織病理尚未出現(xiàn) 明顯損傷的情況下表現(xiàn)出顯著性差異，即毒性發(fā)現(xiàn)時間較現(xiàn)有生化檢測指標有所提前，能 夠更好的用于肝臟毒性的預(yù)防、發(fā)現(xiàn)和治療，彌補現(xiàn)有指標的局限性。這也是我們利用代謝 組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝毒性專屬生物標記物的目的所在。
[0011]

【專利附圖】

【附圖說明】： 圖1 :肝毒性各藥物組多元統(tǒng)計分析的PLS-DA得分圖； 圖2 :用維恩圖顯示整合化分析篩選得到48個共同的碎片離子； 圖3 :篩選得到的14個肝毒性共有的且含量變化趨勢相同的碎片離子信息； 圖4 :支持向量機模型的預(yù)測準確率； 圖5 :3個肝毒性專屬生物標記物在肝毒性組和非肝毒性組中的PLS-DA模型得分圖； 圖6 :各個組的肝毒性生化指標AST和ALT含量變化。
[0012]

【具體實施方式】： 下面結(jié)合說明書和【具體實施方式】對做進一步說明。但本實施例并不用于限制本發(fā)明， 凡是采用本發(fā)明的相似變化，均應(yīng)列入本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所用到的試劑、藥品均有 市售。
[0013] 實施例1 1、試劑：乙腈購自O(shè)ceanpak (瑞典哥德堡)，甲酸購自R0E (美國)，均為分析純。純凈水 購自娃哈哈公司（中國杭州)。生理鹽水購自齊都藥業(yè)有限公司（中國山東)。慶大霉素，依替 米星，異丙腎上腺素，5-氟尿嘧啶，柴胡和四氯化碳購自士蘭科技有限公司（中國天津)。藥 品分別用生理鹽水配置后給予動物。
[0014] 2、動物實驗：動物實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所（中國天津）進行。 70只雄性Wistar大鼠（200±20克）保持在SPF級實驗室。大鼠購入后置12小時晝夜更 替，環(huán)境溫度為25± 1 °C，環(huán)境濕度為50±5%的控制環(huán)境條件下飼養(yǎng)。經(jīng)過一周的適應(yīng)后， 將大鼠隨機分為7組，分別為空白組、慶大霉素組、依替米星組、異丙腎上腺素組、5-氟尿嘧 啶組、柴胡組和四氯化碳組。
[0015] 3、樣品收集：樣品收集之前，所有動物禁食12小時。大鼠輕微麻醉后從腹主動脈 搜集血液。一部分血樣置肝素化試管中，3500轉(zhuǎn)離心15分鐘，分離血漿，置-80°C冰箱中儲 存，用于代謝組學(xué)研究。另一部分血樣置于普通炮彈管中，500轉(zhuǎn)離心15分鐘，分離血清， 置-80°C冰箱中儲存，用于臨床生化檢測。
[0016] 4、我們將上述血漿樣品按照本發(fā)明的技術(shù)方案進行分析研究。多元統(tǒng)計分析中， 首先進行PLS-DA分析，結(jié)果表明給藥組和對照組之間呈現(xiàn)出很好的區(qū)分，說明了藥物引起 了體內(nèi)內(nèi)源性代謝物的改變，且表明兩組在代謝水平上有明顯的區(qū)分，見圖1。在此基礎(chǔ) 上，我們進一步挖掘數(shù)據(jù)潛在信息，將VIP>1的變量認為是潛在標記物。繼而通過T-test 檢驗，進一步的篩選肝毒性生物標記物。其中，四氯化碳組共篩選得到74個碎片離子，柴胡 組篩選得到135個碎片離子。繼而采用維恩圖譜對找到的碎片離子進行整合化分析，發(fā)現(xiàn) 48個共同的碎片離子，見圖2。最終得到14個共有的且含量變化趨勢相同的碎片離子，我 們認為這些離子為肝毒性共有的生物標記物，見圖3。為了進一步確定14個碎片離子的專 屬性和準確性，我們應(yīng)用支持向量機對生物標志物的專屬性進行進一步評估。在用于SVM 優(yōu)化的數(shù)據(jù)中以76個作為訓(xùn)練集、以30個作為測試集建立模型，最終獲得預(yù)測準確率為 96.00%。然后，逐一刪除這14個標記物，可得到相應(yīng)的模型準確率，見圖4。結(jié)果表明當分 別剔除左旋肉堿（L-carnitine)，膽酸（cholic acid)和LysoPC(14:0)后，模型預(yù)測準確率 都不同程度的下降，說明左旋肉堿，膽酸和LPC (14:0)這三個物質(zhì)對模型具有貢獻度，可見 與藥物肝毒性具有較高的專屬性。最后，我們在肝毒性組和非肝毒性組中基于這3個物質(zhì) 建立PLS-DA模型，見圖5,結(jié)果顯示這三個物質(zhì)的肝毒性組與非肝毒性組分布在不同區(qū)域。
[0017] 5、我們經(jīng)過物質(zhì)鑒定得到的12個肝毒性生物標志物的生物學(xué)意義： (1)肝臟的主要功能是脂類的吸收與合成和中性脂肪、磷脂、蛋白質(zhì)的分解。在正常的 生理狀態(tài)下，肝臟能夠維持脂質(zhì)新陳代謝的動態(tài)平衡，但當肝臟受到損害時，出現(xiàn)大量肝細 胞壞死，超出了肝臟的代償能力，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝發(fā)生障礙。磷脂酰膽堿類（PC)是細胞膜的重 要組成部分，PC在磷脂酶A2 (PLA2)或卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT)的作用下水解生成 LPC。目前，LPC類物質(zhì)已經(jīng)作為一類可靠的生物標志物被廣泛報道。LPCs是一類具有生物 活性的脂類物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)多種細胞的功能。LPCs與炎癥反應(yīng)和自身免疫有關(guān)。LPC含量 的升高顯示機體已經(jīng)發(fā)生了炎癥反應(yīng)。同時，血液中LPCs水平還反映出機體的免疫抑制功 能，LPCs含量的升高使受損的肝臟難以進行自我修復(fù)。因此，血漿中LPCs含量的升高提示 炎癥反應(yīng)和免疫力降低已經(jīng)發(fā)生。
[0018] (2)膽汁酸作為膽汁的重要成分，主要存在于腸肝循環(huán)系統(tǒng)并通過再循環(huán)起一定 的保護作用，同時也在脂肪代謝中起著重要作用。而膽酸是是膽汁酸中含量最豐富的一類 固醇成分，膽酸含量的下降，可能會導(dǎo)致脂類代謝的異常，脂質(zhì)代謝的異常會擾亂正常的生 理功能，例如花生四烯酸主要來源于質(zhì)膜的磷脂，是不同炎癥因子的前體物質(zhì)?；ㄉ南┧?代謝主要發(fā)生在肝臟，我們認為引起花生四烯酸含量下降的原因一方面可能是由于脂質(zhì)氧 化引起了花生四烯酸的消耗加快，另一方面可能抑制了肝臟中亞油酸代謝成花生四烯酸。 并且有文獻報道稱脂質(zhì)中肝細胞的過氧化作用增強會加重肝臟損傷。因此我們推斷花生四 烯酸含量的下降可能與肝損傷有關(guān)。
[0019] (3)左旋肉堿屬于脂肪酸的β氧化代謝通路。在脂肪酸氧化（FA0)過程中，左旋 肉堿的主要功能是攜帶、轉(zhuǎn)運活化的脂肪酸，特別是與長鏈飽和及不飽和脂肪酸結(jié)合，穿越 線粒體膜，進入線粒體內(nèi)，進行β氧化和三羧酸循環(huán)反應(yīng)，為機體的代謝活動提供能量。左 旋肉堿的消耗，可能是肝臟損傷導(dǎo)致能量代謝發(fā)生異常。
[0020] (4)苯丙氨酸和色氨酸是機體中的必需氨基酸。苯丙氨酸作為一個具有生理活性 的芳香族氨基酸，是由葡萄糖和脂肪酸代謝生成。苯丙氨酸代謝生成酪氨酸主要是在肝臟 中進行的。色氨酸作為蛋白質(zhì)合成的原料物質(zhì)，絕大部分代謝發(fā)生在肝臟。因此，苯丙氨酸 和色氨酸發(fā)生變化可能是肝臟發(fā)生損傷后，影響的相應(yīng)的代謝酶，導(dǎo)致氨基酸代謝收到干 擾。
[0021] 實施例2 基于代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合SVM的肝毒性生物標志物的篩選方法，包括：樣品前處理、數(shù)據(jù) 采集、數(shù)據(jù)處理(多元統(tǒng)計分析)、生物標記物的專屬性考察、專屬生物標記物的驗證與優(yōu)化 等步驟。其特征在于：在數(shù)據(jù)采集中使用梯度洗脫的條件：0-0. 5 min，Α: 99%-99% ;0. 5-2 min，A: 99%-50%;2-9 min，A: 50%-1%;9-10 min，A: 1%-1%;10-10.5 min，A: 1%-99%; 10. 5-12 min，A: 99%-99%，其中流動相A指0. 1%甲酸的水，流動相B指0. 1%甲酸的乙腈； 在專屬生物標記物的驗證與優(yōu)化中使用MATLAB R2010a軟件（USA)基于肝毒性生物標記物 建立SVM預(yù)測模型，該過程如下：將生物標記物在生理鹽水組和各個藥物組中的峰面積作 為輸入變量，隨機選擇數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集和測試集建立預(yù)測模型，通過優(yōu)化找到最優(yōu)的懲罰 參數(shù)（c)和核函數(shù)（g)，然后以逐一排除一個生物標志物為基礎(chǔ)，利用SVM進行分類預(yù)測，得 到相應(yīng)的模型預(yù)測準確度，分析準確度，對其是否與肝毒性密切相關(guān)進行區(qū)分。
[0022] 實施例3 實際應(yīng)用： 我們將收集起來的血清在室溫下解凍，用于檢測血清中的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST) 和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)。結(jié)果顯示與對照組相比，柴胡組和四氯化碳組中的生化指標均出現(xiàn)顯 著性變化（P〈〇. 05)，但是非肝毒性ISO組的ALT值也出現(xiàn)升高的情況，見圖6。出現(xiàn)這種狀 況是由于ALT并非肝臟所特有的物質(zhì)，它同時也存在于心臟組織中，因此當心臟組織受損 時，表現(xiàn)出ALT值升高。由此可見，ALT對于肝臟的檢測不具有專屬性。相比較之下，我們通 過代謝組學(xué)結(jié)合SVM發(fā)現(xiàn)的肝毒性專屬生物標記物具有較強的靈敏性和專屬性。能夠更好 的用于肝臟毒性的預(yù)防、發(fā)現(xiàn)和治療，彌補現(xiàn)有指標的局限性，及時提供準確的檢測信息。
[0023] 具體的數(shù)據(jù)比較如下：

【權(quán)利要求】
1. 內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測肝毒性方面的應(yīng)用；其中所述的內(nèi)源性小分子 物質(zhì)指12個肝毒性生物標記物，它們是基于代謝組學(xué)技術(shù)篩選出來的，包括L-丙 氨酸（L-alanine)、L-肉喊（L-carnitine)、L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine)、色氨 酸（Tryptophan)、花生四烯酸（Arachidonic acid)、左旋肉堿棕櫚酰（L-Palmitoyl carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC(14:0)]、溶血磷脂酰 膽堿（16:1)[1^8〇?0(16 :1)]、溶血磷脂酰膽堿（18:2)[1^8〇?0(18:2)]、溶血磷脂酰膽堿 (20:3) [LysoPC (20:3)]、溶血磷脂酰乙醇胺（18:2) [LysoPE (18:2)]。
2. 內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速判斷肝臟是否受到損傷方面的應(yīng)用；其中所述的內(nèi)源性 小分子物質(zhì)指的是3個肝毒性專屬生物標記物，它們是在肝毒性生物標記物的基礎(chǔ)上經(jīng)過 專屬性考察和SVM驗證與與優(yōu)化篩選出來的，包括L-肉堿（L-carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC (14:0)]。
3. 權(quán)利要求1-2任一項所述的應(yīng)用，其中基于代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合SVM的肝毒性生物標 志物的篩選方法，包括樣品前處理、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理(多元統(tǒng)計分析)、生物標記物的專 屬性考察、專屬生物標記物的驗證與優(yōu)化步驟，其特征在于：在數(shù)據(jù)采集中使用梯度洗脫的 條件：0-0.5 min，A: 99%-99%;0· 5-2 min，A: 99%-50%;2-9 min，A: 50%-1%;9-10 min，A: 1%-1% ;10-10· 5 min，Α: 1%-99% ;10· 5-12 min，A: 99%-99%，其中流動相 A 指 0· 1% 甲酸的 水，流動相B指0. 1 %甲酸的乙腈；在專屬生物標記物的驗證與優(yōu)化中使用MATLAB R2010a 軟件（USA)基于肝毒性生物標記物建立SVM預(yù)測模型，該過程如下：將生物標記物在生理鹽 水組和各個藥物組中的峰面積作為輸入變量，隨機選擇數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集和測試集建立預(yù)測 模型，通過優(yōu)化找到最優(yōu)的懲罰參數(shù)（c)和核函數(shù)（g)，然后以逐一排除一個生物標志物為 基礎(chǔ)，利用SVM進行分類預(yù)測，得到相應(yīng)的模型預(yù)測準確度，分析準確度，對其是否與肝毒 性密切相關(guān)進行區(qū)分。
【文檔編號】G01N30/02GK104280477SQ201410607892
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】李遇伯, 張艷軍, 王磊 申請人:天津中醫(yī)藥大學(xué)