內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測(cè)早期心臟毒性方面的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了基于代謝組學(xué)的內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測(cè)早期心臟毒性方面的應(yīng)用。其中內(nèi)源性小分子物質(zhì)指9個(gè)早期心臟毒性生物標(biāo)記物L(fēng)-肉堿、L-色氨酸、L-棕櫚酰肉堿、19-羥基脫氧皮質(zhì)酮、膽酸、溶血磷脂酰膽堿(14:0)、溶血磷脂酰膽堿(22:6)、溶血磷脂酰膽堿(20:2)、溶血磷脂酰膽堿(16:0)；同時(shí)也指4個(gè)早期心臟毒性專(zhuān)屬生物標(biāo)記物L(fēng)-肉堿、19-羥基脫氧皮質(zhì)酮、溶血磷脂酰膽堿(14:0)、溶血磷脂酰膽堿(20:2)。本發(fā)明篩選得到的心臟毒性早期生物標(biāo)記物能夠在心臟組織受到病理性損傷之前對(duì)其毒性做出快速預(yù)警，使毒性發(fā)現(xiàn)時(shí)間早于現(xiàn)有生化檢測(cè)指標(biāo)，更加靈敏地對(duì)藥物毒性和疾病做出判斷，為臨床心臟毒性的早發(fā)現(xiàn)、早治療提供了更為充裕的時(shí)間。
【專(zhuān)利說(shuō)明】?jī)?nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測(cè)早期心臟毒性方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到使用代謝組學(xué)技術(shù)尋找早期心臟毒性生物標(biāo)記物，然后對(duì)其進(jìn)行專(zhuān) 屬性考察，接著使用支持向量機(jī)（SVM)對(duì)它們進(jìn)行驗(yàn)證與優(yōu)化。更具體的說(shuō)是內(nèi)源性小分 子物質(zhì)在快速檢測(cè)早期心臟毒性方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 藥物心臟毒性由于發(fā)病急、危害大、恢復(fù)困難被重視。據(jù)報(bào)道現(xiàn)有多達(dá)8. 7%的上 市藥物由于易產(chǎn)生心臟毒性而被撤回。因此藥物心臟毒性的檢測(cè)以及預(yù)防就顯得尤為重 要。藥物進(jìn)入機(jī)體到毒性暴露存在一定的時(shí)間，如何運(yùn)用現(xiàn)有的技術(shù)更早的發(fā)現(xiàn)藥物毒性 是早期預(yù)測(cè)的意義所在。在目前臨床檢測(cè)中，常采用乳酸脫氫酶（LDH)、肌酸激酶（CK )和肌 酸激酶同工酶（CK-MB)等作為心臟毒性的檢測(cè)指標(biāo)，但目前的評(píng)價(jià)手段在檢測(cè)靈敏度以及 容易造成的假陽(yáng)性結(jié)果等方面均需要改進(jìn)。代謝組學(xué)作為分析體內(nèi)小分子物質(zhì)的分析手段 被廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)和疾病的診斷、預(yù)防以及機(jī)理的解釋。代謝組學(xué)作為代謝 終端的研究方法，在機(jī)體不同階段的內(nèi)源性物質(zhì)變化與機(jī)體實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化分析等方面，與 基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比，可以在代謝物層面上提供更好的解釋。隨著學(xué)科的不斷發(fā)展， 代謝組學(xué)在藥物安全性評(píng)價(jià)和毒性預(yù)測(cè)的方面被人們?cè)絹?lái)越重視。代謝組學(xué)作為功能端點(diǎn) 的研究手段，在毒性預(yù)測(cè)方面，能夠很好的作為毒性反應(yīng)的表型，具有靈敏度高、覆蓋面廣 和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。目前，UPLC/Q-T0F-MS以其高分辨率、高靈敏度、快速分離等特點(diǎn)為無(wú) 靶向代謝輪廓分析在龐雜的內(nèi)源性小分子物質(zhì)中找到顯著性變化的物質(zhì)并指認(rèn)其結(jié)構(gòu)提 供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。此外，新的數(shù)據(jù)處理分析技術(shù)也為代謝組學(xué)的研究提供了更為廣闊 的空間。SVM作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)分支，基于經(jīng)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)最小化的原則，被廣泛應(yīng)用于分類(lèi)和 回歸學(xué)習(xí)過(guò)程中。作為解決二分類(lèi)問(wèn)題的有力工具，在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的信號(hào)分類(lèi)、圖像處理 以及疾病診斷等方面均有良好的應(yīng)用前景。因此，SVM與代謝組學(xué)的結(jié)合，將為代謝組學(xué)的 應(yīng)用提供更廣闊的平臺(tái)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)與SVM相結(jié)合發(fā)現(xiàn)早期心臟毒性生物標(biāo)記物，能夠在心 臟組織受到病理性損傷之前對(duì)其毒性做出快速預(yù)警，使毒性發(fā)現(xiàn)時(shí)間早于現(xiàn)有生化檢測(cè)指 標(biāo)，更加靈敏地對(duì)藥物毒性和疾病做出判斷，為臨床心臟毒性的早發(fā)現(xiàn)、早治療提供了更為 充裕的時(shí)間。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)方案： 內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測(cè)早期心臟毒性方面的應(yīng)用，特別是在快速判斷心 臟是否受到損傷方面的應(yīng)用。其中所述的內(nèi)源性小分子物質(zhì)指早期心臟毒性生物標(biāo) 記物，它們是基于代謝組學(xué)技術(shù)篩選出來(lái)的，包括L-肉堿（L- carnitine)、L-色氨 酸（L- tryptophan)、L-棕櫚酰肉堿（L-palmitoyl carnitine)、19-輕基脫氧皮質(zhì) 酮（19-Hydroxydeoxycorticosterone)、膽酸（Cholic acid)、溶血憐脂醜膽喊（14:0)
[LPC (14:0)]、溶血磷脂酰膽堿（22:6) [LPC (22:6)]、溶血磷脂酰膽堿（20:2) [LPC (20:2)]、 溶血磷脂酰膽堿（16:0) [LPC (16:0)]，它們能夠快速檢測(cè)心臟毒性。在早期心臟毒性生物標(biāo) 記物的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)SVM驗(yàn)證與優(yōu)化的內(nèi)源性小分子物質(zhì)指早期心臟毒性專(zhuān)屬生物標(biāo)記物， 包括 L-肉喊（L- carnitine)、19-輕基脫氧皮質(zhì)酮（19-Hydroxydeoxycorticosterone)、 溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LPC(14:0)]、溶血磷脂酰膽堿（20:2) [LPC(20:2)]，它們能 夠快速判斷心臟是否受到損傷。由于體內(nèi)內(nèi)源性小分子物質(zhì)在心臟受到毒性或者損 傷作用時(shí)代謝發(fā)生變化，我們研究表明L-肉堿（L- carnitine)、19-羥基脫氧皮質(zhì)酮 (19-Hydroxydeoxycorticosterone)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LPC(14:0)]、溶血磷脂酰膽 堿（20:2) [LPC(20:2)]專(zhuān)屬性最好。所以更具體地說(shuō)是內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測(cè)早期 心臟毒性以及心臟疾病方面的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了基于代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合SVM的心臟毒性早期生物標(biāo)志物的 篩選方法，包括樣品前處理、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理(多元統(tǒng)計(jì)分析)、生物標(biāo)記物的專(zhuān)屬性考 察、專(zhuān)屬生物標(biāo)記物的驗(yàn)證與優(yōu)化等步驟。其特征在于：在數(shù)據(jù)采集中使用梯度洗脫的條 件：0-0· 5 min，A: 99%-99% ;0· 5-2 min，A: 99%-50% ;2-9 min，A: 50%-1% ;9-10 min，A: 1%-1% ;10-10· 5 min，Α: 1%-99% ;10· 5-12 min，A: 99%-99%，其中流動(dòng)相 A 指 0· 1% 甲酸的 水，流動(dòng)相B指0. 1 %甲酸的乙腈；在專(zhuān)屬生物標(biāo)記物的驗(yàn)證與優(yōu)化中使用MATLAB R2010a 軟件（USA)基于心臟毒性早期生物標(biāo)記物建立SVM預(yù)測(cè)模型，該過(guò)程如下：將生物標(biāo)記物在 生理鹽水組和各個(gè)藥物組中的峰面積作為輸入變量，隨機(jī)選擇數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集和測(cè)試集建 立預(yù)測(cè)模型，通過(guò)優(yōu)化找到最優(yōu)的懲罰參數(shù)（c)和核函數(shù)（g)，然后以逐一排除一個(gè)生物標(biāo) 志物為基礎(chǔ)，利用SVM進(jìn)行分類(lèi)預(yù)測(cè)，得到相應(yīng)的模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，分析準(zhǔn)確度，對(duì)其是否 與早期心臟毒性密切相關(guān)進(jìn)行區(qū)分。
[0006] 我們經(jīng)過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)篩選出早期心臟毒性生物標(biāo)志物，具體是L-肉堿（L-carnitine)、L-色氨酸（L- tryptophan)、L-掠櫚酉先肉喊（L-palmitoyl carnitine)、 19-輕基脫氧皮質(zhì)酮（19-Hydroxydeoxycorticosterone)、膽酸（Cholic acid)、溶血憐 脂酰膽堿（14:0) [LPC(14:0)]、溶血磷脂酰膽堿（22:6) [LPC(22:6)]、溶血磷脂酰膽堿 (20:2)[1^(：(20:2)]、溶血磷脂酰膽堿（16 :0)[^^(16:0)]。早期心臟毒性生物標(biāo)志物經(jīng) 過(guò)專(zhuān)屬性考察、驗(yàn)證與和優(yōu)化后得到早期心臟毒性專(zhuān)屬生物標(biāo)記物，具體是L-肉堿江-carnitine)、19-輕基脫氧皮質(zhì)酮（19-Hydroxydeoxycorticosterone)、溶血憐脂醜膽喊 (14:0) [LPC (14:0)]、溶血磷脂酰膽堿（20:2) [LPC(20:2)]。
[0007] 本發(fā)明更加詳細(xì)的技術(shù)方案如下： 1、樣品前處理：樣品處理前將血漿在室溫下解凍。然后，將300 μ L乙腈加入到100 μ L 血漿中，并渦旋混合1分鐘。接著將混合物在冰水浴中超聲10分鐘，然后以13000轉(zhuǎn)在4°C 下離心15分鐘。收集上清液用于UPLC/Q-T0F-MS分析。
[0008] 2、數(shù)據(jù)采集：使用UPLC/Q-T0F-MS系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司）對(duì)大鼠血漿樣品進(jìn)行 信息采集。色譜柱用 ACQUITY UPLC HSS C18(2.1X100 mm，L7ym，美國(guó) Waters 公司），柱 溫為40°C，流速為0. 3mL/min，進(jìn)樣量為5 μ L。UPLC分離系統(tǒng)包括二元溶劑系統(tǒng)，用流動(dòng)相 A (0.1%甲酸的水)和流動(dòng)相Β (0.1%甲酸的乙腈)。采用梯度洗脫，具體洗脫條件：0-0.5 min，A: 99%-99%;0. 5-2 min, A: 99%-50%;2-9 min, A: 50%-1%;9-10 min, A: 1%-1%; 10-10.5 min，A: 1%-99%;10· 5-12 min，A: 99%-99%。質(zhì)譜采用電噴霧電離（ESI)源，在 正離子電離模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。MS參數(shù)如下：干燥氣流速為10mL/min，干燥氣體溫度為 325°C，霧化氣氣壓為350 psi，脫溶劑氣流量600L/h，毛細(xì)管電離電壓3. 5 kV，四極桿掃描 范圍m/z50-1000。蒸發(fā)氣體和輔助氣體是高純度氮。用（[M+H]+ = 556. 2771，[M-H]-= 554. 26)作為參考離子來(lái)確保光譜采集過(guò)程中的精度。為了確保代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集的可靠 性，我們從每個(gè)樣品中吸取等量的血漿混合成為QC樣品，用它們對(duì)儀器的穩(wěn)定性、方法精 密度進(jìn)行監(jiān)控，直到整個(gè)系統(tǒng)在一個(gè)良好穩(wěn)定的狀態(tài)下才能開(kāi)始樣品信息采集。同時(shí)在24 小時(shí)之內(nèi)，QC樣品每4個(gè)小時(shí)檢測(cè)一次，用來(lái)監(jiān)測(cè)整個(gè)采集過(guò)程中樣品與系統(tǒng)的穩(wěn)定性。 [0009] 3、數(shù)據(jù)處理： (1)早期生物標(biāo)記物的篩選及鑒定：對(duì)照組和模型組的血漿樣本采用MarkerLynx Version 4.1 (Waters Corp·，Manchester, UK)進(jìn)行峰發(fā)現(xiàn)、峰對(duì)齊和原始數(shù)據(jù)的峰值濾 過(guò)，以找出潛在的判別變量。采用SMCA-P +1L5軟件（Umetrics AB，Umea，Sweden)進(jìn)行 多元數(shù)據(jù)分析，主成分分析（PCA)和偏最小二乘-判別分析（PLS-DA)，通常用于廣泛的應(yīng)用 中代謝研究的數(shù)據(jù)處理方法。PCA用于區(qū)分樣本的相似性，確定離群樣本。PLS-DA用于確 定不同群體之間的顯著改變血漿代謝產(chǎn)物。得分圖被用于可視化建立的模型。與此同時(shí)， 使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)以確定是否代謝物從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度具有顯著改 變。這些物質(zhì)將作為潛在的早期心臟毒性生物標(biāo)記物，采用維恩圖譜（http://bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index. html)表示不同藥物影響生物標(biāo)記物的相關(guān)性，找到共 有的早期心臟毒性生物標(biāo)記物。隨后，我們對(duì)這些生物標(biāo)記物進(jìn)行物質(zhì)鑒定，代謝物通過(guò) 標(biāo)準(zhǔn)品、MS/MS 分析以及代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)，如：HMDB (http://www. hmdb. ca/) ;KEGG (http:// www. genome. jp/kegg/)〇
[0010] (2)早期毒性標(biāo)記物的驗(yàn)證及優(yōu)化：本發(fā)明結(jié)合肝、腎毒性的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，針對(duì) 篩選出的共有早期心臟毒性生物標(biāo)記物進(jìn)行專(zhuān)屬性驗(yàn)證。此外，借助SVM技術(shù)對(duì)獲得的心 臟毒性潛在生物標(biāo)記物進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)我們以生物標(biāo)記物的峰面積作為SVM的輸入變量， 對(duì)潛在標(biāo)記物的準(zhǔn)確性和特異性做以驗(yàn)證及優(yōu)化。SVM模型采用MATLAB (USA)建立，通過(guò) 交叉驗(yàn)證的方法確定用于從低維空間向高維空間映射的核函數(shù)K以及用于確定特征子空 間中調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)及其置信范圍和經(jīng)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)比例的誤差懲罰參數(shù)C。最終采用訓(xùn)練集和測(cè)試集 對(duì)該模型進(jìn)行機(jī)械訓(xùn)練以及預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率的判斷。
[0011] 本發(fā)明公開(kāi)的有益效果在于： 目前臨床中常應(yīng)用心肌酶譜的檢測(cè)方法作為心臟病變的輔助檢測(cè)指標(biāo)，但這種指標(biāo) 常在心臟組織出現(xiàn)病理性損傷之后才發(fā)生顯著性變化，這顯示出其毒性暴露具有相對(duì)滯后 性，同時(shí)涉及的某些酶缺乏敏感性和特異性。相比較下，早期心臟毒性生物標(biāo)記物可以在 心臟組織學(xué)尚未出現(xiàn)損傷的情況下表現(xiàn)出顯著性差異，即毒性發(fā)現(xiàn)時(shí)間早于現(xiàn)有生化檢測(cè) 指標(biāo)。通過(guò)篩選、驗(yàn)證、優(yōu)化獲得的早期心臟毒性生物標(biāo)記物能夠在心臟毒性的早期階段， 即可對(duì)藥物的心臟毒性作用作出預(yù)警，從而為心臟毒性藥物的篩選提供更為有利可靠的依 據(jù)，也為臨床心臟毒性的早發(fā)現(xiàn)、早治療提供了更為充裕的時(shí)間。
[0012]

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】： 圖1 :整個(gè)實(shí)驗(yàn)的總體流程圖； 圖2 :心臟毒性各藥物組不同時(shí)間點(diǎn)多元統(tǒng)計(jì)分析的PLS-DA得分圖； 圖3 :用維恩圖顯示整合化分析篩選得到的與早期心臟毒性有關(guān)的39個(gè)離子； 圖4 (包括圖4-1，圖4-2):與早期心臟毒性有關(guān)的39個(gè)離子的具體信息； 圖5 :支持向量機(jī)模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率； 圖6 :各個(gè)組的心臟毒性生化指標(biāo)LDH、CK和CK-MB的含量變化。
[0013]

【具體實(shí)施方式】： 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)和【具體實(shí)施方式】對(duì)做進(jìn)一步說(shuō)明。整個(gè)實(shí)驗(yàn)的總體流程圖見(jiàn)圖1。但 本實(shí)施例并不用于限制本發(fā)明，凡是采用本發(fā)明的相似變化，均應(yīng)列入本發(fā)明的保護(hù)范圍。 本發(fā)明所用到的試劑、藥品均有市售。
[0014] 實(shí)施例1 1、試劑：乙腈購(gòu)自O(shè)ceanpak (瑞典哥德堡)，甲酸購(gòu)自R0E (美國(guó))，均為分析純。純凈水 購(gòu)自娃哈哈公司（中國(guó)杭州）。生理鹽水購(gòu)自齊都藥業(yè)有限公司（中國(guó)山東）。阿霉素（D0X)， 異丙腎上腺素（IS0)，5-氟尿嘧啶（5-FU)，慶大霉素，依替米星，柴胡和四氯化碳購(gòu)自士蘭 科技有限公司（中國(guó)天津)，分別用生理鹽水溶解。
[0015] 2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所（中國(guó)天津）進(jìn)行。 140只雄性Wistar大鼠（200±20克）保持在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。大鼠購(gòu)入后置12小時(shí)晝夜更 替，環(huán)境溫度為25 ± 1 °C，環(huán)境濕度為50 ± 5 %的控制環(huán)境條件下飼養(yǎng)。經(jīng)過(guò)一周的適應(yīng)后， 將大鼠隨機(jī)分為14組，分別為空白（NS)組、阿霉素6h組、阿霉素12h組、阿霉素 Id組、異 丙腎上腺素12h組、異丙腎上腺素 Id組、異丙腎上腺素3d組、5-氟尿嘧啶Id組、5-氟尿嘧 啶2d組、5-氟尿嘧啶3d組、慶大霉素組、依替米星組、柴胡組和四氯化碳組。
[0016] 3、樣品收集：樣品收集之前，所有動(dòng)物禁食12小時(shí)。大鼠輕微麻醉后從腹主動(dòng)脈 搜集血液。一部分血樣置肝素化試管中，3500轉(zhuǎn)離心15分鐘，分離血漿，置-80°C冰箱中儲(chǔ) 存，用于代謝組學(xué)研究。另一部分血樣置于普通炮彈管中，500轉(zhuǎn)離心15分鐘，分離血清， 置-80°C冰箱中儲(chǔ)存，用于臨床生化檢測(cè)。
[0017] 4、我們將上述血漿樣品按照本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行分析研究。多元統(tǒng)計(jì)分析中 PCA首先用于剔除離群樣本，之后采用PLS-DA確定不同組的差異代謝物，見(jiàn)圖2。我們?cè)?PLS-DA模型基礎(chǔ)上，選取VIP>1的生物標(biāo)記物作為不同組間具有差異性潛在的生物標(biāo)記 物。與此同時(shí)，設(shè)定P〈〇.〇5作為代謝物具有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。為了尋找相對(duì)穩(wěn)定且變化規(guī) 律一致的生物標(biāo)記物，我們采用維恩圖譜分別對(duì)阿霉素，異丙腎上腺素和5-氟尿嘧啶的不 同時(shí)間點(diǎn)下的離子信息進(jìn)行整合，分別找到的共同離子為1〇6、77、69個(gè)。進(jìn)一步我們針對(duì) 不同藥物共同離子信息做整合化分析，見(jiàn)圖3。最終我們初步篩選出與早期心臟毒性有關(guān) 的39個(gè)離子信息，詳細(xì)信息見(jiàn)圖4。隨后我們將這些離子信息進(jìn)行物質(zhì)鑒定，得到9個(gè)確 定的代謝物。與此同時(shí)，我們將這39個(gè)離子在肝腎毒性組中進(jìn)行專(zhuān)屬性驗(yàn)證，最后篩選 出10個(gè)具有較強(qiáng)心臟毒性專(zhuān)屬性的離子認(rèn)為是心臟毒性潛在的早期生物標(biāo)記物。最后利 用SVM對(duì)獲得的10個(gè)潛在生物標(biāo)記物進(jìn)行分類(lèi)預(yù)測(cè)。我們采用58個(gè)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)作為 訓(xùn)練集，30個(gè)作為測(cè)試集。然后以去掉任意一個(gè)潛在生物標(biāo)記物的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)， 分別建立預(yù)測(cè)模型，從而得到相應(yīng)的模型準(zhǔn)確度與預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率，見(jiàn)圖5。以潛在的早期心臟 毒性生物標(biāo)記物建立的模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為90% (27/30)。值得注意的是，在去掉任意一個(gè) 潛在生物標(biāo)記物后其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率存在一定的不同。左旋肉堿（L-Carnitine)、19-羥孕酮 (19-Hydroxydeoxycorticosterone)、LPC (14:0)、LPC(20:2)剔除后較剔除前模型預(yù)測(cè)準(zhǔn) 確率降低，說(shuō)明這些生物標(biāo)記物對(duì)模型貢獻(xiàn)度影響為正影響，具有較強(qiáng)早期心臟毒性特異 性。
[0018] 5、我們經(jīng)過(guò)物質(zhì)鑒定得到的9個(gè)與早期心臟毒性相關(guān)的代謝物的生物學(xué)意義： (1)溶血磷脂通過(guò)作用于溶血磷脂受體（LPL-R)來(lái)完成脂質(zhì)信號(hào)傳遞[HMDB]。LPL-R是 作為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，在機(jī)體生命活動(dòng)中起到信使作用。當(dāng)心臟毒性作用發(fā) 生后，溶血磷脂產(chǎn)生變化，這可能影響第二信使的正常功能，進(jìn)一步的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。 另一方面，溶血磷脂屬于甘油磷脂類(lèi)代謝產(chǎn)物，這類(lèi)物質(zhì)作為生物膜重要組成部分，與細(xì)胞 膜有重要聯(lián)系。當(dāng)心臟受到損傷時(shí)，心肌細(xì)胞膜發(fā)生變化，磷脂酶A2被激活并進(jìn)一步影響 LPC類(lèi)物質(zhì)，使其含量降低。
[0019] (2)脂肪酸的β氧化作為心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體功能的重要途徑，與心肌細(xì)胞的凋亡密 切相關(guān)。當(dāng)心臟發(fā)生毒性反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致心肌耗氧量增加，進(jìn)一步加重脂肪酸β氧化，相對(duì) 應(yīng)的3-羥基十四烷酸、硬脂酸這類(lèi)提供能量的脂肪酸類(lèi)成分含量降低，而作為轉(zhuǎn)運(yùn)工具的 L-肉堿含量升高。
[0020] (3)甘氨膽酸是類(lèi)固醇代謝中間產(chǎn)物，可能通過(guò)心肌細(xì)胞過(guò)氧化脂質(zhì)化以及心內(nèi) 膜內(nèi)皮細(xì)胞受損影響心臟正常的生理功能。氨基酸類(lèi)物質(zhì)作為機(jī)體生命運(yùn)動(dòng)的重要基本物 質(zhì)，參與各種的能量與物質(zhì)代謝，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，色氨酸在心臟毒性發(fā)展過(guò)程中含量發(fā)生改 變，可能在這過(guò)程中參與了酶類(lèi)物質(zhì)或信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。
[0021] 實(shí)施例2 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了基于代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合SVM的心臟毒性早期生物標(biāo)志物的篩 選方法，包括樣品前處理、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理(多元統(tǒng)計(jì)分析)、生物標(biāo)記物的專(zhuān)屬性考 察、專(zhuān)屬生物標(biāo)記物的驗(yàn)證與優(yōu)化等步驟。其特征在于：在數(shù)據(jù)采集中使用梯度洗脫的條 件：0-0· 5 min，Α: 99%-99% ;0· 5-2 min，A: 99%-50% ;2-9 min，A: 50%-1% ;9-10 min，Α: 1%-1% ;10-10· 5 min，Α: 1%-99% ;10· 5-12 min，A: 99%-99%，其中流動(dòng)相 A 指 0· 1% 甲酸的 水，流動(dòng)相B指0. 1 %甲酸的乙腈；在專(zhuān)屬生物標(biāo)記物的驗(yàn)證與優(yōu)化中使用MATLAB R2010a 軟件（USA)基于心臟毒性早期生物標(biāo)記物建立SVM預(yù)測(cè)模型，該過(guò)程如下：將生物標(biāo)記物在 生理鹽水組和各個(gè)藥物組中的峰面積作為輸入變量，隨機(jī)選擇數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集和測(cè)試集建 立預(yù)測(cè)模型，通過(guò)優(yōu)化找到最優(yōu)的懲罰參數(shù)（c)和核函數(shù)（g)，然后以逐一排除一個(gè)生物標(biāo) 志物為基礎(chǔ)，利用SVM進(jìn)行分類(lèi)預(yù)測(cè)，得到相應(yīng)的模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，分析準(zhǔn)確度，對(duì)其是否 與早期心臟毒性密切相關(guān)進(jìn)行區(qū)分。
[0022] 實(shí)施例3 實(shí)際應(yīng)用： 我們將收集起來(lái)的血清在室溫下解凍，用于檢測(cè)血清中的乳酸脫氫酶（LDH)、肌酸激酶 (CK)和肌酸激酶同工酶（CK-MB)。結(jié)果顯示D0X給藥Id后、ISO給藥3d后、5-FU給藥3d后 的結(jié)果與空白組相比，均具有顯著性升高（P〈〇. 05)，而其他各組沒(méi)有顯著性升高，見(jiàn)圖6。 分析結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)D0X給藥1天、ISO給藥3天、5-FU給藥3天后機(jī)體均暴露出心臟毒性， 相對(duì)而言D0X給藥6h、12h、ISO給藥12h、ld以及5-FU給藥ld、2d心臟毒性尚未暴露。我 們認(rèn)為D0X給藥1天、ISO給藥3天、5-FU給藥3天為毒性暴露期。此外，如D0X給藥6h、 ISO給藥12h、5-FU給藥Id組這類(lèi)毒性作用正在發(fā)生但現(xiàn)有檢測(cè)手段尚未能夠給予毒性暴 露的情況我們定義為心臟毒性反應(yīng)的早期階段。相比較之下，我們通過(guò)代謝組學(xué)結(jié)合SVM 發(fā)現(xiàn)的早期心臟毒性生物標(biāo)記物已經(jīng)表現(xiàn)出顯著的差異，即毒性發(fā)現(xiàn)時(shí)間早于現(xiàn)有生化檢 測(cè)指標(biāo)。
[0023] 具體的數(shù)據(jù)比較如下：

【權(quán)利要求】
1. 內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測(cè)早期心臟毒性方面的應(yīng)用；其中所述的內(nèi)源性小 分子物質(zhì)指9個(gè)早期心臟毒性生物標(biāo)記物，它們是基于代謝組學(xué)技術(shù)篩選出來(lái)的，包 括 L-肉堿（L- carnitine)、L-色氨酸（L- tryptophan)、L-棕櫚酰肉堿（L-palmitoyl carnitine)、19_ 輕基脫氧皮質(zhì)酮（19-Hydroxydeoxycorticosterone)、膽酸（Cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LPC(14:0)]、溶血磷脂酰膽堿（22:6) [LPC(22:6)]、溶血磷 脂酰膽堿（20:2) [LPC (20:2)]、溶血磷脂酰膽堿（16:0) [LPC (16:0)]。
2. 內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速判斷心臟是否受到損傷方面的應(yīng)用；其中所述的內(nèi) 源性小分子物質(zhì)指的是指4個(gè)早期心臟毒性專(zhuān)屬生物標(biāo)記物，它們是經(jīng)過(guò)專(zhuān)屬性考察 和SVM驗(yàn)證與與優(yōu)化篩選出來(lái)的，包括L-肉堿（L- carnitine)、19-羥基脫氧皮質(zhì)酮 (19-Hydroxydeoxycorticosterone)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LPC(14:0)]、溶血磷脂酰膽 堿（20:2) [LPC(20:2)]。
3. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中基于代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合SVM的早期心臟毒性 生物標(biāo)記物的篩選方法，包括樣品前處理、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理(多元統(tǒng)計(jì)分析)、生物標(biāo)記 物的專(zhuān)屬性考察、專(zhuān)屬生物標(biāo)記物的驗(yàn)證與優(yōu)化步驟；其特征在于：在數(shù)據(jù)采集中使用梯 度洗脫的條件：0-0.5 min，A: 99%-99%;0· 5-2 min，A: 99%-50%;2-9min，A: 50%-1%;9-10 min，A: l%-l%;10-10.5min，A: l%-99%;10.5-12min，A: 99%-99%，其中流動(dòng)相A指0.1% 甲酸的水，流動(dòng)相B指0. 1%甲酸的乙腈；在專(zhuān)屬生物標(biāo)記物的驗(yàn)證與優(yōu)化中使用MATLAB R2010a軟件（USA)基于心臟毒性早期生物標(biāo)記物建立SVM預(yù)測(cè)模型，該過(guò)程如下：將生物標(biāo) 記物在生理鹽水組和各個(gè)藥物組中的峰面積作為輸入變量，隨機(jī)選擇數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集和測(cè) 試集建立預(yù)測(cè)模型，通過(guò)優(yōu)化找到最優(yōu)的懲罰參數(shù)（c)和核函數(shù)（g)，然后以逐一排除一個(gè) 生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)，利用SVM進(jìn)行分類(lèi)預(yù)測(cè)，得到相應(yīng)的模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，分析準(zhǔn)確度，對(duì) 其是否與早期心臟毒性密切相關(guān)進(jìn)行區(qū)分。
【文檔編號(hào)】G01N33/15GK104297442SQ201410607895
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】李遇伯, 張艷軍, 局亮 申請(qǐng)人:天津中醫(yī)藥大學(xué)