一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測新鮮煙葉中脫落酸和茉莉酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法LC-MS/MS檢測新鮮煙葉中脫落酸和茉莉酸的分析方法，包括以下步驟：1）配制提取溶劑；2）新鮮煙葉液氮速凍，冷凍干燥并粉碎；3）粉碎好的樣品加入提取溶劑，低溫超聲提取；4）冷凍離心，取上清液并過濾；5）LC-MS/MS進行檢測。其優(yōu)點在于：前處理方法簡單，只需超聲并過濾，無需固相萃取柱純化處理，與現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明中所采用的LC-MS/MS法，靈敏度高，精密度好，加標(biāo)回收率高，100個樣品前處理耗時小于2小時，而現(xiàn)有文獻中所述方法前處理繁瑣費時，100個樣品處理約需3天。因此，本發(fā)明方法能有效地提高分析效率，適合復(fù)雜基質(zhì)中低含量目標(biāo)物的分析。
【專利說明】一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測新鮮煙葉中脫落酸和茉莉 酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及煙草代謝組學(xué)新鮮煙葉樣品中激素的研究，具體是一種液相色譜-串 聯(lián)質(zhì)譜法檢測新鮮煙葉中脫落酸和茉莉酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 脫落酸和茉莉酸是植物體內(nèi)兩種重要的生理活性物質(zhì)，在煙草植物的次級代謝、 脅迫耐受和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中行使功能，從而影響煙草的生長發(fā)育和煙葉的品質(zhì)。因此，精確可靠 地對痕量的脫落酸和茉莉酸進行定性、定量分析具有重要的意義。
[0003] 已有文獻報道采用固相萃取-液相色譜/質(zhì)譜法同時測定新鮮植物葉片中的脫落 酸和茉莉酸。（1)50 mg植物樣品在液氮中研磨成粉末，加入1 mL 80%甲醇提取溶劑；（2) 超聲提取30 min，10000 rpm冷凍離心10 min，取出上清液；（3)向上清液加入600 μ L三 次水，渦旋混勻；（4)將混合液通過一裝填有200 mg鍵合硅膠的小柱進行SPE萃取、富集。 具體步驟如下：①活化吸附劑：按照先后順序分別用5 mL甲醇，5 mL 20%甲醇活化吸附劑； ②上樣：將混合液倒入活化后的SPE小柱，抽真空，調(diào)整真空度，使混合液以1滴/s的速度 通過SPE小柱；③清洗：依次用2 mL 50 mM甲酸銨溶液、3 mL三次水、2 mL 20%甲醇清洗 SPE小柱；④解吸：用5 mL含2%甲酸的乙腈將目標(biāo)物從SPE小柱上解吸下來，用10 mL離 心管在出口端收集。解吸液于35 °C下氮氣吹干后，用5%乙腈定容至800 μ L，取720 μ L 注入RPLC-MS/MS系統(tǒng)進行分析。此方法樣品前處理十分繁瑣，耗時長，不利于分析效率的 提高。因此，建立一種快速、靈敏的檢測新鮮植物葉片中的脫落酸和茉莉酸的檢測方法十分 必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的正是針對現(xiàn)有技術(shù)中脫落酸和茉莉酸的測定方法前處理繁瑣費時 的問題，提供一種簡便的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測新鮮煙葉中脫落酸和茉莉酸的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下方式技術(shù)方案來實現(xiàn)的：本發(fā)明的檢測方法采用提取 溶劑低溫超聲萃取，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀實現(xiàn)新鮮煙葉中脫落酸和茉莉酸的測 定，其具體步驟如下： 1) 配制提取溶劑：甲醇/水，80/20，ν/ν ; 2) 新鮮煙葉液氮速凍，冷凍干燥，粉碎機打碎； 3) 粉碎好的樣品加入提取溶劑和氘代內(nèi)標(biāo)，0-10°C低溫超聲提??； 4) 提取完的樣品冷凍離心，取上清液過0.22 μ m微孔濾膜； 5) LC-MS/MS對待測樣品中脫落酸和茉莉酸進行檢測，其液相色譜、質(zhì)譜條件如下： Agilent 公司 SB-C18 超高壓柱，規(guī)格 2.1 mmXlOO mm i.d·，1.8 μπι;柱溫 50 °C;流 動相為：A :含0. 001%甲酸的水，B :乙腈；流速：0. 2 mL mirf1 ;梯度洗脫：0 min :80%A+20% 8,0.1?8 11^11:10〇從+90%8,8.1?10 11^11:10〇從+90%8，10.1?12 11^11:80〇從+20%8;進樣量：5 μ L〇
[0006] 離子源：電噴霧離子源；負離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣溫度：180°C，干燥氣流 量：11 L mirT1，霧化器壓力：20 psi ;鞘氣溫度：400°C，鞘氣流量：12 L mirT1，毛細管電壓： 2000 V，噴嘴電壓：2000 V，駐留時間：50 ms。
[0007] 表1各化合物的定量離子對、定性離子對、保留時間及碰撞能量

【權(quán)利要求】
1. 一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測新鮮煙葉中脫落酸和茉莉酸的方法，其特征在于： 是采用提取溶劑低溫超聲萃取，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用實現(xiàn)新鮮煙葉中脫落酸和茉 莉酸的測定，具體步驟如下： 1) 配制提取溶劑：甲醇/水=80/20, v/v ; 2) 新鮮煙葉液氮速凍，冷凍干燥，粉碎機打碎； 3) 粉碎好的樣品加入提取溶劑和氘代內(nèi)標(biāo)，0-10°C低溫超聲提??； 4) 提取完的樣品冷凍離心，取上清液過0.22 μ m微孔濾膜； 5. LC-MS/MS對待測樣品中脫落酸和茉莉酸進行檢測，其液相色譜、質(zhì)譜條件如下： Agilent 公司 SB-C18 超高壓柱，規(guī)格 2.1 mmXlOO mm i.d·，1.8 μπι;柱溫 50 °C;流 動相為：A :含0. 001%甲酸的水，B :乙腈；流速：0. 2 mL mirT1 ;梯度洗脫：0 min :80%A+20% 8,0.1?8 11^11:10〇從+90%8,8.1?10 11^11:10〇從+90%8，10.1?12 11^11:80〇從+20%8;進樣量：5 μ L ； 離子源：電噴霧離子源；負離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣溫度：180°C，干燥氣流量：11 L mirT1，霧化器壓力：20 psi;鞘氣溫度：400°C，鞘氣流量：12 L mirT1，毛細管電壓：2000 V，噴嘴電壓：2000 V，駐留時間：50 ms。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測新鮮煙葉中脫落酸和茉莉酸的方 法，其特征在于：所述的氘代內(nèi)標(biāo)為ABA-d6。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測新鮮煙葉中脫落酸和茉莉酸的方 法，其特征在于：所述的超聲提取時間為30 min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測新鮮煙葉中脫落酸和茉莉酸的方 法，其特征在于：在步驟4)離心過程，離心機轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)，離心時間為5 min。
【文檔編號】G01N30/06GK104297410SQ201410613361
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】陳霞, 周會娜, 劉萍萍, 陳千思, 金立鋒, 翟妞, 鄭慶霞, 盧鵬, 王燃, 林福呈 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院