一種檢測(cè)血漿免疫標(biāo)志物-vegfr1自身抗體的抗原多肽及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环NVEGFR1抗原多肽，其包含H-DEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDKSNLE-OH、H-DLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSI-OH和H-ESGLSDVSRPSFCHSSCGHVSEGKRRFTYDHAEL-OH三種多肽，及其用于檢測(cè)血漿免疫標(biāo)志物-VEGFR1自身抗體的應(yīng)用。還提供了一種利用本申請(qǐng)所述的VEGFR1抗原多肽檢測(cè)血漿免疫標(biāo)志物-VEGFR1自身抗體的方法，以及包含所述VEGFR1抗原多肽的測(cè)試盒。
【專利說(shuō)明】-種檢測(cè)血漿免疫標(biāo)志物-VEGFR1自身抗體的抗原多肽及 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種VEGFRl抗原多肽。應(yīng)用該抗原多肽可制備 檢測(cè)人血漿中VEGFRl抗體水平的特異試劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)的研究表明，發(fā)現(xiàn)和測(cè)定健康人群血液中的腫瘤相關(guān)抗體具有指導(dǎo)靶向治 療價(jià)值。如已在臨床廣泛應(yīng)用的曲妥株單抗（Trastuzumab)和貝伐株單抗（Bevacizumab) 就是以上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子二型受體01ER2)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)為標(biāo)靶，成 為臨床治療晚期腫瘤的重要手段。然而，由于副作用太大，這兩種單克隆抗體只能做為三線 治療藥物。因此，發(fā)展可用于防止腫瘤局部治療后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、且低副作用的新型手段是目 前亟待解決的問(wèn)題。而在免疫治療領(lǐng)域探索解決這個(gè)難題的前置技術(shù)障礙是找到一種創(chuàng)新 性的標(biāo)靶技術(shù)實(shí)用方案，然后才能進(jìn)一步發(fā)展全新的腫瘤免疫治療方案。
[0003] VEGFRl也被稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子一型受體，已被公認(rèn)為是癌細(xì)胞表達(dá)的特 異性蛋白之一。經(jīng)大量的研究發(fā)現(xiàn)，許多人類實(shí)體腫瘤可大量表達(dá)VEGFR1，如肝癌，肺癌，腎 癌，腸癌及乳腺癌等。因?yàn)閂EGFRl抗原表位多肽主要位于腫瘤細(xì)胞表面，可直接作為相應(yīng) 抗體殺傷腫瘤的靶點(diǎn)，因此學(xué)界公認(rèn)VEGFRl相應(yīng)抗體的臨床應(yīng)用極有可能成為最快實(shí)現(xiàn) 的、低副作用的全新抗癌治療手段。目前生物【技術(shù)領(lǐng)域】?jī)H有的方法，是以重組蛋白為抗原實(shí) 施VEGFRl相應(yīng)抗體的檢測(cè)和篩選，其過(guò)程要經(jīng)過(guò)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、表達(dá)、篩選、純化等繁瑣 的過(guò)程，但由于蛋白空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，線性抗原表位不易暴露，因而以重組蛋白檢測(cè)出的抗 體特異性差，有相當(dāng)比例無(wú)法與腫瘤細(xì)胞膜表面的抗原靶點(diǎn)結(jié)合，因而僅能進(jìn)行低標(biāo)準(zhǔn)的 定性檢測(cè)手段，無(wú)法據(jù)此發(fā)展用于防治腫瘤的實(shí)用手段。同時(shí)，ELISA法的高度靈敏性對(duì)蛋 白純化技術(shù)的穩(wěn)定性要求極高，因此符合檢測(cè)要求的重組蛋白成本昂貴。國(guó)內(nèi)外至今尚無(wú) 有關(guān)VEGFRl相應(yīng)抗體檢測(cè)和篩選的有效手段。
[0004] 本發(fā)明針對(duì)性設(shè)計(jì)的線性VEGFRl抗原表位多肽能有效解決上述技術(shù)難題，能制 備特異性極高的檢測(cè)試劑，按設(shè)定的流程規(guī)范檢測(cè)免疫標(biāo)志物-VEGFRl抗體在健康獻(xiàn)血者 血漿中的濃度指標(biāo)值，可獲得精度高、操作簡(jiǎn)易、成本適中的VEGFRl抗體檢測(cè)、甄別、定性 和定量應(yīng)用的一攬子解決方案。因而本發(fā)明技術(shù)能為利用健康人體內(nèi)天然VEGFRl抗體發(fā) 展全新的、低副作用的腫瘤免疫治療方案奠定了現(xiàn)實(shí)基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)VEGFRl自身抗體的線性抗原多肽，由此制備檢測(cè) VEGFRl自身抗體的特異試劑，并設(shè)計(jì)了相應(yīng)的實(shí)施優(yōu)選操作流程方案。本發(fā)明共設(shè)計(jì)三種 VEGFRl線性抗原多肽，其氨基酸序列見表1
[0006] 表I. VEGFRl抗原多肽序列
[0007] ......弱.....VEGFRl..............h：DEGvyHCKATNQKGSVESSAYLTV〇GTSDKSNLE-OH^- 1 卜 I) L K. LS(.:T V N K F1,Y R D VT W n.丄 RT V \ N KR H - FSG I... SD VS RPS FCH SSCG H VSHG KRRI-TYOH A F I..-OH
[0008] 眾所周知，由于抗原抗體的結(jié)合實(shí)際上只發(fā)生在抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)之 間，兩者在空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)型上越接近完全互補(bǔ)，則抗原抗體的結(jié)合就越穩(wěn)定，特異性就越 強(qiáng)，結(jié)合效率就越高。由于目標(biāo)抗體及其結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)是先決因素，因此根據(jù)抗原決定簇 即可決定整個(gè)蛋白抗原與抗體結(jié)合狀態(tài)和親和特性。
[0009] 因此，本發(fā)明根據(jù)VEFGRl蛋白的生物學(xué)特性，針對(duì)多個(gè)表位進(jìn)行免疫信息學(xué)預(yù)測(cè) 和模擬，經(jīng)分析與抗原性相關(guān)的各種參數(shù)，設(shè)計(jì)了上述三種在空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)型上與目標(biāo)抗 體完全互補(bǔ)的線性多肽抗原的氨基酸序列。
[0010] 大量的研究資料證實(shí)，VEGFRl是一種腫瘤相關(guān)抗原，在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)。故 抗VEGFRl抗體可以認(rèn)為是一種天然抗腫瘤抗體。在人體內(nèi)執(zhí)行免疫監(jiān)視功能，防止腫瘤的 形成與發(fā)展。本發(fā)明的技術(shù)正是填補(bǔ)了定量檢測(cè)這種天然抗腫瘤抗體的空白，為血漿生物 制品公司研發(fā)新產(chǎn)品和臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展防治腫瘤的新措施提供了重要工具。例如，血漿生物 制品公司可利用本發(fā)明技術(shù)篩選血漿，以制備富含VEGFRl抗體的丙種球蛋白，用于臨床防 治腫瘤；臨床也可以直接給早期腫瘤病人局部治療后（如手術(shù)或放療后）輸入利用本發(fā)明 技術(shù)篩選的富含VEGFRl抗體的血漿，提高其免疫監(jiān)視功能，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。這是 本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值所在。
[0011] 表1中所列三種抗原多肽在ELISA法檢測(cè)血漿VEFGRl自身抗體應(yīng)用中應(yīng)以高純 度制品實(shí)施，建議使用純度不低于95%的制品。以下用本領(lǐng)域通用的"夾心對(duì)比檢驗(yàn)?zāi)Ｊ? 進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)證說(shuō)明本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)的技術(shù)效果。
[0012] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N利用表1中所列的三種抗原多肽檢測(cè)血漿免疫標(biāo)志物VEFGRl 自身抗體的方法，其包括如下具體步驟：
[0013] 1、操作前，每種抗原多肽用65 %?70%乙酸溶解為5mg/ml儲(chǔ)存液，然后等體積 混合并放置_20°C (誤差2°C以內(nèi)）冰箱中保存；
[0014] 2、操作開始時(shí)，首先將表1中所列三種抗原多肽的等比混合液用包被液稀釋為 10?50微克/ml，該包被液為0. IM磷酸鹽緩沖液含0. 15M氯化鈉和IOmM EDTA，酸堿度 (pH)為7. 0?7. 4之間；
[0015] 3、然后包被馬來(lái)酰亞胺（Maleimide)活化的96孔檢測(cè)板（Thermo Scientific,美 國(guó)），4°C過(guò)夜孵育后，用洗液洗板3遍，所述洗液為0. IM磷酸鹽緩沖液含0. 15M氯化鈉和 0? 1 % TWEEN-20,酸堿度（pH)為 7. 0 ?7. 4 之間；
[0016] 4、然后分步加樣分析如下：
[0017] a、待測(cè)血漿樣本設(shè)雙復(fù)孔，另設(shè)2個(gè)陰性對(duì)照孔（NC，參照物為不含血漿VEFGRl抗 體的陰性對(duì)照液，藉此可獲得表1所述的本發(fā)明三種抗原多肽在不含VEFGRl自身抗體的陰 性環(huán)境下的指標(biāo)值，目的是證明本發(fā)明組合物在不含VEFGRl自身抗體的情形下不會(huì)顯示 陽(yáng)性結(jié)果）和2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔（PC，參照物為含VEFGRl抗體標(biāo)準(zhǔn)品的陽(yáng)性對(duì)照液，藉此可獲 得表1所述的本發(fā)明三種抗原多肽在VEFGRl抗體標(biāo)準(zhǔn)品基準(zhǔn)含量水平上的指標(biāo)值，目的是 證明本發(fā)明組合物在含有VEFGRl自身抗體的環(huán)境下能顯示陽(yáng)性結(jié)果，并可進(jìn)一步作為基 準(zhǔn)值用于比較待測(cè)血漿樣本指標(biāo)值）；
[0018] b、用分析液將待測(cè)血漿樣本1:200稀釋，所述分析液與抗原包被液相同，即0. IM 磷酸鹽緩沖液含0.15M氯化鈉和IOmM EDTA，酸堿度（pH)為7.0?7. 4之間，每孔加 100 iil，25°C孵育1-2小時(shí)，然后洗板3遍；
[0019] C、用所述分析液按照上述b步驟（即0. IM磷酸鹽緩沖液含0. 15M氯化鈉和IOmM EDTA，酸堿度為7. 0?7. 4之間）操作后，稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG (用以驗(yàn) 證血槳中被檢測(cè)的物質(zhì)是否是特異性抗體），抗體工作范圍為1:10000?1:50000,每孔加 100iil，25°C孵育 1-2 小時(shí)；
[0020] d、以前述洗液（即0. IM磷酸鹽緩沖液含0. 15M氯化鈉和0. 1 % TWEEN-20,酸堿度 PH值為7. 0?7. 4之間）洗板3遍后，每孔加100 ill 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)及 過(guò)氧化物酶混合液，室溫避光20?30分鐘；
[0021] e、每孔加50 ill終止液10%硫酸溶液（10% H2SO4)，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度 (OD)值，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm，參考波長(zhǎng)為630nm。檢測(cè)過(guò)程應(yīng)在加入終止液后10分鐘內(nèi)完 成,據(jù)此可定量分析個(gè)體血漿VEGFRl自身抗體水平。
[0022] 5、在進(jìn)行群體隨機(jī)抽樣分析時(shí)，可針對(duì)每一個(gè)體檢測(cè)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用陽(yáng) 性樣品比值（Positive sample ratio，PSR)判定血漿中VEGFRl自身抗體的相對(duì)水平。PSR 計(jì)算方法如下：PSR= [VEGFR10D值-NC OD值]/[PC OD值-NC OD值]。然后應(yīng)用正態(tài) 四分法（Q-Q)作圖。
[0023] 表1中所列三種多肽抗原多肽在實(shí)際應(yīng)用中可制備成簡(jiǎn)單易用的便捷測(cè)試盒套 裝，可以非金屬材料真空密封包裝，4度（4°C )環(huán)境下可保存不低于六個(gè)月。因此，本申請(qǐng) 還提供了一種包含表1中所列三種抗原多肽的測(cè)試盒。簡(jiǎn)言之，將三種抗原多肽混合液包 被的馬來(lái)酰亞胺（Maleimide)活化96孔檢測(cè)板在45度（45°C)烤箱中干燥后，用非金屬包 裝材料真空密封包裝，由各一件試劑組合為一個(gè)便捷測(cè)試盒套裝。建議三種抗原多肽均為 純度不低于95%的制品。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1血漿VEGFRl抗體濃度的四分位數(shù)分布圖。圖中橫坐標(biāo)為以PSR值表示的血 漿VEGFRl抗體濃度，縱坐標(biāo)為血漿VEGFRl抗體濃度四分位數(shù)分布范圍，0點(diǎn)水平所對(duì)應(yīng)的 PSR值為中位數(shù)。 具體實(shí)施例
[0025] 1.樣本收集：收集121份正常成年人血漿樣品，包括65例男性和56例女性。所 述血樣提供者均為經(jīng)臨床體檢確定不存在已患有任何一類腫瘤的個(gè)體。操作前所有血楽樣 品均在負(fù)80度（-80°C)條件下保存，經(jīng)核實(shí)保存時(shí)間未超過(guò)兩年，沒有反復(fù)凍融（次數(shù)不 超過(guò)3次）的血漿樣品。
[0026] 2.樣本檢測(cè)：在4°C環(huán)境下解凍血漿樣品，本實(shí)驗(yàn)所采用的表1中所列三種抗原 多肽由英國(guó)SEVERN BIOTECH有限公司合成，純度為95%，具體進(jìn)行如下操作步驟：
[0027] (1)操作前，每種抗原多肽用67%乙酸溶解為5. 7mg/ml儲(chǔ)存液，然后等體積混合 并放置-20°C冰箱中保存；
[0028] (2)操作開始時(shí)，首先將三種抗原多肽混合液用包被液稀釋為28. 5微克/ml，該包 被液為〇. IM磷酸鹽緩沖液含0. 15M氯化鈉和IOmM EDTA，測(cè)得酸堿度（pH值）為7. 2 ;
[0029] (3)然后包被馬來(lái)酰亞胺（Maleimide)活化的96孔檢測(cè)板（Thermo Scientific, 美國(guó)），4°C過(guò)夜16. 5小時(shí)孵育后，用洗液洗板3遍，所述洗液為0. IM磷酸鹽緩沖液含 〇? 15M氯化鈉和0? 1 % TWEEN-20,測(cè)得酸堿度pH值為7. 3 ;
[0030] (4)然后分步加樣分析如下：
[0031] a、待測(cè)血漿樣本設(shè)雙復(fù)孔，另設(shè)2個(gè)陰性對(duì)照孔（NC，參照物為Sigma-Aldrich公 司提供的不含VEFGRl抗體的人血漿陰性對(duì)照液）和2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔（PC，參照物同樣為 Sigma-Aldrich公司提供的人血楽VEFGRl抗體標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性對(duì)照液）；
[0032] b、用分析液將血漿1:200稀釋，所述分析液與抗原包被液相同，為0. IM磷酸鹽緩 沖液含〇. 15M氯化鈉和IOmM EDTA，測(cè)得酸堿度（pH)為7. 2,每孔加100 iil，25°C孵育1. 5 小時(shí)；
[0033] c、以前述洗液（即0. IM磷酸鹽緩沖液含0. 15M氯化鈉和0. 1 % TWEEN-20， 測(cè)得酸堿度為7. 2)洗板3遍后，用分析液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG(由 Sigma-Aldrich公司提供），抗體工作環(huán)境為1:28500,每孔加100 iil，25°C孵育1.5小時(shí)；
[0034] d、以前述洗液（即0? IM磷酸鹽緩沖液含0? 15M氯化鈉和0? 1 % TWEEN-20，測(cè)酸 堿度PH值為7. 2之間）洗板3遍后，每孔加100 ill 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)及過(guò) 氧化物酶混合液（由Life Technologies公司提供），室溫避光25分鐘；
[0035] e、每孔加50 ill終止液10%硫酸溶液（10% H2SO4,)，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度 (OD)值，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm，參考波長(zhǎng)為630nm，加入終止液后10分鐘內(nèi)檢測(cè)完畢。
[0036] 3.結(jié)果分析：以下進(jìn)一步依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果針對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象人群進(jìn)行VEGFRl自身抗 體的分布對(duì)比分析。針對(duì)前述檢測(cè)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，采用陽(yáng)性樣品比值（Positive sample ratio, PSR)判定血漿中VEGFRl自身抗體水平，PSR計(jì)算公式為：PSR= [VEGFR10D 值-NC OD值]/[PC OD值-NC OD值]，并以正態(tài)四分法（Q-Q)作圖獲得下圖。圖中橫坐 標(biāo)為以PSR值表示的血漿VEGFRl抗體濃度，縱坐標(biāo)為血漿VEGFRl抗體濃度四分位數(shù)分布 范圍，〇點(diǎn)水平所對(duì)應(yīng)的PSR值為中位數(shù)。
[0037] 如圖1所示，血漿VEGFRl抗體濃度的中位數(shù)為PSR = 1. 53,偏態(tài)系數(shù)S = 1. 65， 峰度系數(shù)K = 4. 63,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)呈高度顯著（w = 0. 89, p〈0. 0001)。以正態(tài)分布擬合曲線 上向右側(cè)拐點(diǎn)的最高值為閾值（cut-off = 3. 8)，即在121份正常成年人血漿樣品中有8份 富含VEGFRl自身抗體，本實(shí)施例中檢出該閾值以上的人數(shù)占比為6. 6%。根據(jù)本實(shí)施例可 知，隨機(jī)抽取的正常成年人群的血漿VEGFRl抗體含量狀況呈偏態(tài)分布，其中8例血漿樣品 屬于頗具臨床應(yīng)用價(jià)值的富含天然VEGFRl自身抗體的寶貴血源。
[0038] 本實(shí)施例中，在同步陰性對(duì)比試驗(yàn)證明本發(fā)明不存在誤報(bào)結(jié)果的同時(shí)，上圖橫坐 標(biāo)體現(xiàn)的是以Sigma-Aldrich公司提供的人血漿VEFGRl抗體標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性對(duì)照液為參照的 每一個(gè)體血樣PSR計(jì)算值，并據(jù)此標(biāo)注得到上圖。為了便于理解，從另一個(gè)角度看，我們可 將VEGFRl自身抗體濃度（PSR值）分布為4個(gè)區(qū)間，以下表顯示本實(shí)施例中落入每個(gè)抗體 濃度區(qū)間的人數(shù)比例。
[0039] 附表.121份正常成年人血漿樣品中VEGFRl自身抗體分布
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)VEGFR1自身抗體的組合物，其包括如下3種抗原多肽： H-DEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDKSNLE-OH ； H-DLKLSCTVNKFLYRDVTffILLRTVNNRTMHYSI-0H ； H-ESGLSDVSRPSFCHSSCGHVSEGKRRFTYDHAEL-OH。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于：組合物中各抗原多肽的比例為1:1:1。
3. -種檢測(cè)個(gè)體中的VEGFR1自身抗體的方法，其包括將權(quán)利要求1中所述的3種抗原 多肽等比混合，然后包被馬來(lái)酰亞胺（Maleimide)活化的96孔檢測(cè)板，4°C過(guò)夜孵育，洗板， 再進(jìn)行分步加樣分析。
4. 權(quán)利要求4所述的方法，其中分步加樣分析包括將待測(cè)血漿樣本設(shè)雙復(fù)孔，同時(shí)設(shè) 2個(gè)陰性對(duì)照孔和2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔，用分析液將血漿稀釋，并稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊 抗人IgG，洗板，每孔加100 U13, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)及過(guò)氧化物酶混合液，室溫 避光20?30分鐘，每孔添加50 yl終止液10 %硫酸溶液（10% H2S04)，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè) 光密度（OD)值，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm，參考波長(zhǎng)為630nm。
5. 權(quán)利要求1或2所述的組合物用于檢測(cè)VEGFR1自身抗體的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述組合物制成的測(cè)試盒套裝，其特征在于：三種抗原多肽分 別以非金屬醫(yī)用包裝材料真空獨(dú)立封裝后，各取一件組合為一個(gè)測(cè)試盒套裝備用。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104356226SQ201410615968
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】尉軍, 王偉力 申請(qǐng)人:深圳市海蘭深生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司