一種克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉及其制備方法與應用。所述動物尿液干粉包括獨立包裝的陰性和陽性尿液干粉。所述制備包括：采集新鮮尿液，離心處理，收集上清液；真空室溫干燥得到陰性尿液干粉；采集新鮮尿液，離心處理，收集上清液；加入克倫特羅標準品，混勻；真空室溫干燥，得到陽性尿液干粉。所述動物尿液干粉可用作克倫特羅酶聯(lián)免疫試紙卡和試劑盒使用中的質控樣品。本發(fā)明提供的動物尿液干粉能夠在常溫下密封長期保存，在向干粉中加入適量純水后，干粉溶解形成的溶液與利用新鮮動物尿液配制的克倫特羅酶聯(lián)免疫試紙卡和試劑盒質控樣品在應用上無差異，可以替代新鮮動物尿液配制而成的克倫特羅檢測質控樣品。
【專利說明】一種克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉及其制備方法與應 用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測領域，具體涉及一種克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉 及其制備方法與應用。

【背景技術】
[0002] 克倫特羅是最主要的一種"瘦肉精"類物質，在國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)生多起食用動物源性 食品導致克倫特羅中毒的事件，我國政府明令禁止在動物生產(chǎn)中使用克倫特羅。但是，由于 克倫特羅具有提高動物生長速度和瘦肉率的作用，仍有少數(shù)不法分子鋌而走險，非法制造、 銷售和使用克倫特羅，導致克倫特羅在動物生產(chǎn)中禁而不絕，造成的食品安全事件屢有發(fā) 生。由于克倫特羅主要在動物養(yǎng)殖階段使用，并且大部分以原型藥物的形式從尿液中排出。 因此，動物養(yǎng)殖環(huán)節(jié)是各級管理部門和食品企業(yè)克倫特羅監(jiān)測的重點，其方法主要是采用 酶聯(lián)免疫試紙卡或試劑盒對養(yǎng)殖動物的尿液進行克倫特羅篩查檢測。但是，酶聯(lián)免疫試紙 卡或試劑盒本身具有假陽性和假陰性的誤判風險，易受環(huán)境等因素影響導致失效，對操作 環(huán)境和人員水平有一定要求，加之市售產(chǎn)品質量參差不齊，一般用戶缺乏專業(yè)的實驗室條 件進行質量評價，從而難以對此類產(chǎn)品的質量做出合理的判斷，導致了檢測結果可靠性差。 使用陰性和陽性質控樣品對檢測產(chǎn)品進行驗證是提高檢測準確度和可靠性的重要手段。然 而，由于動物尿液不便于保存、運輸和現(xiàn)場操作，質控樣品只能現(xiàn)用現(xiàn)配，所以在酶聯(lián)免疫 試紙卡和試劑盒中的應用很少。因此，開發(fā)出易于保存、運輸和便于現(xiàn)場操作的質控用動物 尿液樣品對于提高克倫特羅檢測產(chǎn)品結果可靠性十分必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的之一是提供一種制備克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉的方法。
[0004] 本發(fā)明所提供的制備克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉的方法，包括下述a)和 b)：
[0005] 所述a)為陰性樣品的制備，具體步驟如下：采集新鮮尿液，立即進行離心處理，收 集上清液，得到離心凈化后的尿液；接著將所述離心凈化后的尿液干燥，得到陰性尿液干 粉；
[0006] 所述b)為陽性樣品的制備，具體步驟如下：采集新鮮尿液，立即進行離心處理，收 集上清液，得到離心凈化后的尿液；接著向所述離心凈化后的尿液中加入克倫特羅標準品， 混勻，得到含克倫特羅標準品的尿液；最后將所述含克倫特羅標準品的尿液干燥，得到陽性 尿液干粉。
[0007] 上述方法步驟a)中，所述新鮮尿液來源于已知來源并確定從未食用過克倫特羅 的動物；其中，所述動物具體可為豬、牛、羊等。
[0008] 所述尿液的采集時間與動物的排尿時間間隔不超過10分鐘，以保證尿液的新鮮 程度。
[0009] 所述離心處理的條件為：1500 Xg離心5?15分鐘。
[0010] 所述干燥為在真空濃縮儀中進行的室溫干燥；所述干燥的時間為4-6小時。
[0011] 所述干燥的具體操作如下：將所述離心凈化后的尿液置于樣品瓶中，將所述含有 尿液的樣品瓶置于真空濃縮儀內(nèi)進行室溫干燥，得到尿液干粉，立即對盛有尿液干粉的樣 品瓶加蓋密封，得到所述陰性尿液干粉。
[0012] 所得陰性尿液干粉用ImL純水溶解后形成的克倫特羅陰性動物尿液復原液中，克 倫特羅的含量小于0. Ing/mL。
[0013] 當需要制備大量的陰性尿液干粉時，上述方法步驟1)的具體操作如下：將每次排 尿后的新鮮尿液收集，立即進行離心處理，收集上清液，隨后將所述上清液于2?6°C下暫 存不超過24小時；將多次排出的經(jīng)離心凈化后暫存的尿液混合，于-18°C以下的溫度下凍 存；在所凍存的尿液的總量達到要求后，將所述凍存后的尿液回溫至室溫，震蕩混勻，得到 均勻一致的尿液；最后將所述均勻一致的尿液干燥，得到所述陰性尿液干粉。
[0014] 上述方法步驟b)中，所述新鮮尿液的來源與步驟1)中新鮮尿液的來源相同，同樣 來源于已知來源并確定從未食用過克倫特羅的動物；所述動物具體可為豬、牛、羊等。
[0015] 所述尿液的采集時間與動物的排尿時間間隔不超過10分鐘，以保證尿液的新鮮 程度。
[0016] 所述離心處理的條件為：1500 Xg離心5?15分鐘。
[0017] 所述干燥為在真空濃縮儀中進行的室溫干燥；所述干燥的時間為4-6小時。
[0018] 所述干燥的具體操作如下：將所述含克倫特羅標準品的尿液置于樣品瓶中，將所 述含有尿液的樣品瓶置于真空濃縮儀內(nèi)進行室溫干燥，得到尿液干粉，立即對盛有尿液干 粉的樣品瓶加蓋密封，得到所述陽性尿液干粉。
[0019] 所得陽性尿液干粉用與濃縮前尿液體積相同的純水溶解后得到的克倫特羅陽性 動物尿液復原液中，克倫特羅的含量與配置濃度比值介于80-120%。
[0020] 當需要制備大量的陽性尿液干粉時，上述方法步驟1)的具體操作如下：將每次排 尿后的新鮮尿液收集，立即進行離心處理，收集上清液，隨后將所述上清液于2?6°C下暫 存不超過24小時；將多次排出的經(jīng)離心凈化后暫存的尿液混合，于-18°C以下的溫度下凍 存；在所凍存的尿液的總量達到要求后，將所述凍存后的尿液回溫至室溫，震蕩混勻，得到 均勻一致的尿液；接著向所述均勻一致的尿液中加入克倫特羅標準品，混勻后得到含克倫 特羅標準品的尿液；最后將所述含克倫特羅標準品的尿液干燥，得到所述陽性尿液干粉。
[0021] 由上述方法制備得到的克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉也屬于本發(fā)明的保護 范圍。
[0022] 所述克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉包括獨立包裝的陰性尿液干粉和陽性尿 液干粉。
[0023] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉的用途。
[0024] 本發(fā)明所提供的克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉的用途是將所述動物尿液干 粉用作克倫特羅酶聯(lián)免疫試紙卡和試劑盒使用中的質控樣品。
[0025] 具體使用方法為：分別向所述陰性尿液干粉和陽性尿液干粉中加入與濃縮前尿液 體積相同的純水；充分震蕩，使尿液干粉全部溶解；按照克倫特羅酶聯(lián)免疫試紙卡或試劑 盒的操作步驟分別對所述陰性和陽性樣品進行驗證檢測，根據(jù)驗證結果的符合性對試紙卡 或試劑盒產(chǎn)品進行現(xiàn)場使用過程中的質量控制。
[0026] 實驗證明，本發(fā)明提供的克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉，能夠在常溫下密封 長期保存，克倫特羅能夠長期穩(wěn)定存在，不會發(fā)生降解。并且，在向干粉中加入適量純水后， 干粉溶解形成的溶液與利用新鮮動物尿液配制的克倫特羅酶聯(lián)免疫試紙卡和試劑盒質控 樣品在應用上無差異，可以替代新鮮動物尿液配制而成的克倫特羅檢測質控樣品。本發(fā)明 可以方便地用于克倫特羅酶聯(lián)免疫試紙卡和試劑盒現(xiàn)場質控，而且生產(chǎn)過程簡單，易于保 存、運輸和使用，克服了一般質控樣品配制中動物尿液不好保存、運輸，需要專業(yè)實驗室條 件等不足。

【具體實施方式】
[0027] 下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。
[0028] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所 用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029] 下述實施例中所采用的克倫特羅標準品為德國Dr. Ehrensorfer公司產(chǎn)品，其CAS 號：21898-19-1，純度 >98. 5%。
[0030] 下述實施例中所采用的克倫特羅膠體金快速檢測試紙卡（豬尿）為北京勤邦生物 技術有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號：B001，檢測限：3ng/ml(ppb)。
[0031] 下述實施例中所采用的克倫特羅ELISA檢測試劑盒為北京勤邦生物技術有限公 司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號：A041，檢測限：0? lng/ml (ppb)。
[0032] 實施例1、克倫特羅檢測質控用陰性豬尿液干粉的制備
[0033] -、豬尿液的采集
[0034] 1、在試驗豬場選擇健康狀態(tài)良好、未食用過克倫特羅的生長豬（杜長大三元雜交 豬），置于代謝籠中預飼7天使其適應環(huán)境；
[0035] 2、預飼期過后，收集豬在自然狀態(tài)下排出的新鮮尿液，收集豬尿的時間和豬排尿 時間間隔不超過10分鐘，以保證尿液新鮮。將收集的新鮮尿液，立即置于離心機中1500Xg 離心15分鐘，收集上清液置于2?6°C冰箱中暫存；
[0036] 3、每天將收集并經(jīng)離心凈化的尿液混合在一起，用IOOOmL塑料瓶分裝，置于冰柜 中，-18°C以下凍存。
[0037] 二、陰性豬尿干粉的制備
[0038] 1、將豬尿液從冰柜中取出，回溫至室溫，并置于震蕩器上進行旋轉震蕩，使尿液均 勻一致；
[0039] 2、用連續(xù)分液器從混合均勻的豬尿中依次取出ImL分別置于I. 5mL壓蓋樣品瓶 中；
[0040] 3、將盛好豬尿的樣品瓶置于真空濃縮儀內(nèi)旋轉架上，室溫下真空離心干燥6小 時，待液體完全揮發(fā)后，取出樣品瓶，并立即壓蓋密封，制成陰性豬尿干粉。
[0041 ] 二、廣品檢驗
[0042] 對陰性豬尿液干粉進行克倫特羅陰性確認的抽樣檢測，每批次生產(chǎn)的產(chǎn)品中隨機 抽取2個樣品。將ImL純水用注射器注入尿液干粉瓶中，充分震蕩，使干粉全部溶解，形成 克倫特羅陰性豬尿復原液。根據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《動物尿液中11種3 _受體激動劑的檢測 液相色譜-串聯(lián)質譜法》（農(nóng)業(yè)部1063號公告-3-2008)的方法步驟，采用液相色譜-串聯(lián) 質譜儀對尿液干粉復溶液進行克倫特羅確證檢測，檢測結果均為未檢出（低于方法檢出限 0. Ippb)〇
[0043] 實施例2、克倫特羅檢測質控用陽性豬尿液干粉的制備 [0044] 一、豬尿液的采集
[0045] 1、在試驗豬場選擇健康狀態(tài)良好、未食用過克倫特羅的生長豬（杜長大三元雜交 豬），置于代謝籠中預飼7天使其適應環(huán)境；
[0046] 2、預飼期過后，收集豬在自然狀態(tài)下排出的新鮮尿液，收集豬尿的時間和豬排尿 時間間隔不超過10分鐘。每次豬排尿后收集的尿液，立即置于離心機中1500Xg離心15 分鐘，收集上清液置于2?6°C冰箱中暫存；
[0047] 3、每天將收集并經(jīng)離心凈化的尿液混合在一起，用IOOOmL塑料瓶分裝，置于冰柜 中，-18°C以下凍存。
[0048] 二、陽性豬尿干粉的制備
[0049] 1、將豬尿液從冰柜中取出，回溫至室溫，并置于震蕩器上進行旋轉震蕩，使尿液均 勻一致。
[0050] 2、精確稱量克倫特羅標準品10. Omg，置于IOOml玻璃容量瓶中，向其中加入豬尿 至刻度，充分震蕩使克倫特羅標準品完全溶解，并混合均勻，即得濃度為100 U g/mL的克倫 特羅陽性尿液儲備液；
[0051] 3、用移液管準確移取ImL上述克倫特羅陽性尿液儲備液于IOOml玻璃容量瓶中， 向其中加入空白豬尿至刻度，充分震蕩，混合均勻，即得濃度為I U g/mL的克倫特羅陽性尿 液稀釋液；
[0052] 4、用移液管準確移取5mL上述克倫特羅陽性尿液稀釋液于IOOOml玻璃容量瓶中， 向其中加入空白豬尿至刻度，充分震蕩，混合均勻，即得濃度為5ng/mL的克倫特羅陽性尿 液應用液；
[0053] 2、將上述克倫特羅陽性尿液應用液倒入廣口瓶中，用液用連續(xù)分液器從中依次取 出ImL分別置于I. 5mL壓蓋樣品瓶中；
[0054] 3、將盛好豬尿的樣品瓶置于真空濃縮儀內(nèi)的旋轉架上，室溫下真空離心干燥6小 時，待液體完全揮發(fā)后，取出樣品瓶，并立即壓蓋密封，制成陽性豬尿干粉，理論上，每瓶陽 性豬尿干粉用ImL純水溶解后形成的陽性豬尿復原液中克倫特羅的濃度為5ng/mL(5ppb)。
[0055] 三、產(chǎn)品檢驗
[0056] 對所述陽性豬尿液干粉進行克倫特羅陰性確認的抽樣檢測，每批次生產(chǎn)的產(chǎn)品中 隨機抽取2個樣品。將ImL純水用注射器注入尿液干粉瓶中，充分震蕩，使干粉全部溶解， 形成克倫特羅陽性豬尿復原液。根據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《動物尿液中11種3 _受體激動劑的檢 測液相色譜-串聯(lián)質譜法》（農(nóng)業(yè)部1063號公告-3-2008)的方法步驟，采用液相色譜-串 聯(lián)質譜儀對尿液干粉復溶液進行克倫特羅確證檢測，檢測結果分別為5. Ong/mL和5. Ing/ mL〇
[0057] 實施例3、克倫特羅檢測質控用豬尿液干粉在膠體金試紙條上的應用
[0058] 一、豬尿干粉復原液的配制
[0059] 取陰性豬尿干粉和陽性豬尿干粉各1支，將ImL純水用注射器分別注入2個尿液 干粉瓶中，充分震蕩，使干粉全部溶解，形成克倫特羅陰性和陽性豬尿復原液。
[0060] 二、試紙條的抽樣檢驗
[0061] 在克倫特羅膠體金快速檢測試紙卡（豬尿）開封使用前，從一盒（50個/盒）中 隨機取出2個試紙卡。按照試紙卡操作說明書要求的條件及操作步驟，用移液管吸取陰性 和陽性豬尿復原液分別滴入2個試紙卡進樣槽內(nèi)，靜置5分鐘后讀取結果。結果顯示，滴入 陰性豬尿復原液的試紙卡顯示為陰性，滴入陽性豬尿復原液的試紙卡顯示為陽性。檢驗結 果滿意，說明該批（盒）試紙卡通過現(xiàn)場質控樣品檢驗，可用于動物尿液樣品篩查。
[0062] 實施例4、克倫特羅檢測質控用豬尿液干粉在酶聯(lián)免疫試劑盒上的應用
[0063] 一、豬尿干粉復原液的配制
[0064] 取陰性豬尿干粉和陽性豬尿干粉各1支，將ImL純水用注射器分別注入2個尿液 干粉瓶中，充分震蕩，使干粉全部溶解，形成克倫特羅陰性和陽性豬尿復原液。
[0065] 二、試劑盒檢測過程的質控
[0066] 在克倫特羅酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣品時，按照試劑盒操作說明書要求的條件及操 作步驟，將陰性和陽性豬尿復原液作為質控樣品與其他檢測樣品同時檢測。結果顯示：陰性 質控樣品檢測值為<〇? Ippb ;陽性質控樣品檢測值為5. 5ppb，結果位于標準值5. Oppb的 80%?120% (4.0?6. Oppb)之間。檢驗結果滿意，說明本次試劑盒檢測通過現(xiàn)場質控樣 品檢驗，可用于動物尿液樣品篩查。
[0067] 實施例5、克倫特羅質控用動物尿液干粉樣品的穩(wěn)定性考察 [0068] 作為一種能夠長期儲存、即配即用的質控樣品，最主要的性能指標就是穩(wěn)定性。由 于動物尿液中干物質成分以尿素、尿酸和無機鹽為主，占干物質含量的99%以上。因此，動 物尿液真空濃縮干燥形成的尿液干粉，主要是尿素、尿酸和無機鹽，這類物質在干燥狀態(tài)下 非常穩(wěn)定。而且，克倫特羅具有很高的穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明涉及的克倫特羅質控用動物尿 液干粉樣品性質穩(wěn)定，具有較強理論基礎。
[0069] 按照所述克倫特羅檢測質控用陰性豬尿液干粉和陽性豬尿液干粉的制備方法，分 別制備600瓶陰性和陽性豬尿（5ppb)干粉。從制備當天開始（第0天），每隔60天，隨機 分別取出6瓶陰性和陽性尿液干粉，連續(xù)8次抽樣，持續(xù)時間420天。按照所述豬尿干粉復 原液的配制方法，制成陰性和陽性尿液干粉復原液。采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《動物尿液中11種 3 _受體激動劑的檢測液相色譜_串聯(lián)質譜法》（農(nóng)業(yè)部1063號公告-3-2008)的方法步 驟，采用液相色譜-串聯(lián)質譜儀對陰性和陽性尿液干粉復溶液進行克倫特羅確證檢測，檢 測結果見表1。由表可見，420天內(nèi)，陰性樣品始終是克倫特羅未檢出；陽性樣品檢測平均值 為4. 99,連續(xù)8次測定結果無顯著差異，且結果位于標準值5. Oppb的80%?120% (4. 0? 6. Oppb)之間。結果表明，本發(fā)明涉及的克倫特羅質控用動物尿液干粉在設定保質期1年 (365天）內(nèi)，克倫特羅含量穩(wěn)定。
[0070] 表1陰性和陽性尿液干粉復溶液克倫特羅確證檢測結果
[0071]

【權利要求】
1. 一種制備克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉的方法，包括下述a)和b): 所述a)為陰性樣品的制備，具體步驟如下：采集新鮮尿液，離心處理，收集上清液，得 到離心凈化后的尿液；接著將所述離心凈化后的尿液干燥，得到陰性尿液干粉； 所述b)為陽性樣品的制備，具體步驟如下：采集新鮮尿液，離心處理，收集上清液，得 到離心凈化后的尿液；接著向所述離心凈化后的尿液中加入克倫特羅標準品，混勻，得到含 克倫特羅標準品的尿液；最后將所述含克倫特羅標準品的尿液干燥，得到陽性尿液干粉。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟a)中，所述新鮮尿液來源于已知來 源并確定從未食用過克倫特羅的動物； 所述動物為豬、?；蜓?； 所述尿液的采集時間與動物的排尿時間間隔不超過10分鐘； 所述離心處理的條件為：1500 Xg離心5?15分鐘； 所述干燥為在真空濃縮儀中進行的室溫干燥；所述干燥的時間為4-6小時。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟b)中，所述新鮮尿液的來源于 已知來源并確定從未食用過克倫特羅的動物； 所述動物為豬、?；蜓?； 所述尿液的采集時間與動物的排尿時間間隔不超過10分鐘； 所述離心處理的條件為：1500Xg離心5?15分鐘； 所述干燥為在真空濃縮儀中進行的室溫干燥； 所述干燥的時間為4-6小時。
4. 由權利要求1-3中任一項所述的方法制備得到的克倫特羅檢測質控用動物尿液干 粉。
5. 根據(jù)權利要求4所述的克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉，其特征在于：所述克倫 特羅檢測質控用動物尿液干粉包括獨立包裝的陰性尿液干粉和陽性尿液干粉。
6. 權利要求4或5所述的克倫特羅檢測質控用動物尿液干粉用作質控樣品在克倫特羅 酶聯(lián)免疫試紙卡和試劑盒使用中的應用。
【文檔編號】G01N33/531GK104360052SQ201410635259
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月5日 優(yōu)先權日:2014年11月5日
【發(fā)明者】蘇曉鷗, 王瑞國, 程劼, 王培龍, 樊霞, 李陽, 張維 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所