大瀧六線魚卵黃原蛋白免疫印跡試劑盒及其制備方法、檢測方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒及其制備方法、檢測方法及應用。該試劑盒含有大瀧六線魚卵黃原蛋白純品與兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體。制備時，首先利用硫酸銨沉淀與SephadexG-200過濾層析從17β-雌二醇誘導的大瀧六線魚血漿中純化出卵黃原蛋白，然后免疫新西蘭大白兔制備兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗血清，并利用HitrapProteinG層析，純化獲得兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體。本發(fā)明的試劑盒可以用于海洋環(huán)境雌激素類物質的篩選，能夠靈敏、方便的定性檢測大瀧六線魚血液、體表粘液、肝臟組織及肝細胞培養(yǎng)液中的卵黃原蛋白，最低檢測限為50ngmL-1，為我國近岸海域內分泌干擾物的檢測提供了重要工具。
【專利說明】大瀧六線魚卵黃原蛋白免疫印跡試劑盒及其制備方法、檢測方法及應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生態(tài)檢測領域，具體涉及一種檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒及其制備方法和應用。

【背景技術】
[0002]持久性有機污染物((Persistent Organic Pollutants, POPs),是指在環(huán)境中難以分解，能夠在環(huán)境中長期存在，可以通過各種傳輸途徑而進行全球尺度的遷移擴散，通過食物鏈在生物體內累積放大，對人體和環(huán)境產生毒性影響的一類有機污染物。這些污染物并不是自然界本身就存在的，而是人類工業(yè)革命帶來的產物.持久性有機污染物給人類和環(huán)境帶來的危害已經成為全球性問題。為了解決這一問題，聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署(UNEP)和瑞典政府于2001年5月23日在瑞典的斯德哥爾摩聯(lián)合主持召開全權代表會議，簽署了旨在禁止和/或限制使用12類持久性有機污染物的《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》。POPs具有下列四個重要的特性:(I)能夠在環(huán)境中持久地存在；(2)能夠經過長距離遷移到達偏遠的極低地區(qū)。(3)在一定的濃度下會對接觸該物質的生物造成有害或有毒影響，POPs大都具有“三致(致癌、致畸、致突變)”效應；(4)能蓄積在食物鏈中，對有較高營養(yǎng)等級的生物造成影響。由于POPs具有低水溶性、高脂溶性的特點，導致POPs從周圍媒介中富集到生物體內，并通過食物鏈的生物放大作用達到中毒濃度。
[0003]POPs在海洋環(huán)境中難降解、分布廣、易在生物體內富集，對生態(tài)環(huán)境的危害性很大，POPs不僅影響到海洋生物的棲息與繁殖，通過食物鏈的傳遞，也給人類自身生存和生活造成威脅。各項研究顯示POPs濃度水平并不很高，但是由于其生物富集性可通過食物鏈傳遞富集，使得處于食物鏈越高的生物受到的威脅越大。在海洋環(huán)境和其他水生生態(tài)系統(tǒng)中，POPs的傳播鏈是:空氣中的POPs最初是被微生物吸收一較大生物吃微小生物一小魚食用較大生物一大魚吃小魚一有時是鳥類或人類食用大魚。食肉類物種體內的POPS含量將會達到其捕食對象體內POPs平均含量的10倍之多。這導致了在最高端食肉物種體內極高的POPs含量。根據(jù)環(huán)境加拿大(Environment Canada)組織的報告,食用魚類的鳥蛋中POPs污染物達到魚類本身生活的水中POPs含量的2500萬倍。而位于生物鏈頂端的人類，則又把這些毒性放大了 7萬倍。
[0004]當前急需全面提升海洋POPs實時監(jiān)測、預警能力，對海水養(yǎng)殖的污染源進行研究，探討魚類飼料、人類活動及環(huán)境因素等對水產品質量的影響，為海水養(yǎng)殖產品的質量監(jiān)控和海域環(huán)境的管理提供科學依據(jù)。因此建立起快速、高效、大通量針對POPs特別是新增加種類污染物的有效檢測方法是加強和完善對環(huán)境中POPs的檢測及風險控制管理的前提和基礎。研究表明，大多數(shù)POPs具有環(huán)境雌激素效應，是環(huán)境雌激素類似物，因此可以將環(huán)境雌激素生物檢測方法用于POPs的生物檢測。
[0005]美國、歐盟和日本相繼建立起以魚類為模式生物的環(huán)境雌激素篩選評價體系，其中卵黃原蛋白(Vitellogenin, Vtg)作為重要的生物篩選指標，已經得到廣泛應用。魚類卵黃原蛋白是卵黃蛋白的前體，是一種大分子量的脂磷聚糖蛋白。卵黃形成期，在雌激素的刺激下卵黃原蛋白由肝臟合成，并通過血液運輸?shù)桨l(fā)育的卵巢中，被卵巢吸收；通常，卵黃原蛋白只能在卵黃形成期的雌魚體內檢測到，但是，雄魚和幼魚體內也含有卵黃原蛋白基因，在環(huán)境雌激素的誘導下，也能合成和分泌卵黃原蛋白。因此，卵黃原蛋白是環(huán)境雌激素篩選的特異性生物標志物，通過檢測雄魚體內卵黃原蛋白水平可以評價環(huán)境化學物的雌激素活性。然而，至今我國還未見海洋環(huán)境POPs生物監(jiān)測技術的研發(fā)。
[0006]大沈六線魚{Hexagrammosotakii Jordan et Starks )又名歐式六線魚，俗稱黃魚，隸屬于鈾形目(Scorpaeniformes)、六線魚科(Hexagrammidae)、六線魚屬Qlexagrammos)。大瀧六線魚屬冷溫性近海底層魚類，在我國主要分布于黃海和渤海沿岸多巖礁海區(qū)，在青島等近海水域中容易捕獲。以黃渤海常見魚種大瀧六線魚為實驗生物，建立其卵黃原蛋白的檢測技術，有助于開展我國近岸海域POPs生物監(jiān)測工作。


【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術問題是在于提供一種檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒及其制備方法，以滿足現(xiàn)有技術的上述需求。
[0008]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下:
本發(fā)明提供的一種檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒，包括一個盒體，該盒體內裝有:1)PVDF膜2張；2)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗I支；3)封閉液、洗滌液、顯色液各I支，所述的洗滌液為TBST ;封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST ;顯色液為含0.06%(m/V) 3’ - 二氨基聯(lián)苯胺的1mM Tris-HCl ;其特征在于該盒體還裝有:4)大瀧六線魚卵黃原蛋白純品I支(10 μ g/ml) ；5)兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體I支。
[0009]本發(fā)明還提供了上述檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒制備方法，包括以下步驟:1)制備大瀧六線魚卵黃原蛋白純品；2)利用步驟I)得到的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品制備兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體；3)將步驟I)得到的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品I支、步驟2)得到的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體I支、PVDF膜2張，以及封閉液、洗滌液、顯色液和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗I支共同裝入盒體，得到檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒。
[0010]所述的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品的制備方法如下:
采用肌肉注射17盧-雌二醇(17/?-estrad1l，E2)的方式誘導大瀧六線魚產生卵黃原蛋白；注射一周后取血，4°C，5000 g離心10分鐘，收集上清液；向上清中加入等體積的飽和硫酸銨溶液，冰浴條件下?lián)u晃2小時后離心，向沉淀中加入pH 7.5的25mM Tris_HCl，使沉淀重新溶解；進一步的純化采用1.5' 20 cm的Sephadex G-200層析柱,加入I ml上述溶液，用pH 7.5的25mM Tris-HCl洗層析柱，收集第一個洗脫峰，即為大瀧六線魚卵黃原蛋白。
[0011]所述的大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備方法如下:
取600 μ g純化的大瀧六線魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后對新西蘭大白兔進行背部皮下多點注射，每點注射0.1 ml，兩周后再次加強免疫，免疫劑量為600 μ g/只，用弗氏不完全佐劑充分乳化后進行背部皮下注射。此后，每隔7天按以上方法進行加強免疫。于每5次注射5天后從心臟取血，6000 r/min離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗血清?？贵w的純化分為以下幾步，上樣前向多克隆抗血漿中加入1/3左右的對照陰性樣品(雄魚勻漿液)，低溫振蕩2h，4°C過夜，次日離心取上清；向上清中加入等體積的0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4);在冰浴條件下加入硫酸銨，至50%飽和度，(TC震蕩2h后，低溫離心(8000 rpm, 15min)，棄上清，沉淀用10 ml0.02 mol/L磷酸緩沖液溶解;以0.02 mol/L磷酸緩沖液透析24 h，其間換液4次；用0.45微米孔徑的濾膜過濾后，上Hitrap Protein G柱,隨后以0.02mol/L磷酸緩沖液洗脫10個柱體積，然后以0.1M甘氨酸(pH 2.7)洗脫抗體，即獲得兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體。
[0012]上述檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒在海洋內分泌擾亂化學物質調查與篩選中的應用。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明的試劑盒利用抗原抗體之間的特異性結合能力，可靈敏、準確、方便地檢測大瀧六線魚血漿、體表粘液、肝臟組織及肝細胞培養(yǎng)液中的卵黃原蛋白，最低檢出限可達50 ng/ml，為內分泌擾亂化學物質篩選、檢測和生態(tài)環(huán)境風險評價提供了一個有效的手段。
[0014]目前，已經純化了多種魚類的卵黃原蛋白，并且制備成抗體用于環(huán)境雌激素的檢測。魚類的卵黃原蛋白的純化多采用兩步層析法，該方法不僅操作復雜，費時費力，還容易造成卵黃原蛋白的降解。本發(fā)明首次建立了六線魚卵黃原蛋白的純化方案，采用硫酸銨沉淀預處理血衆(zhòng)，可明顯提高卵黃原蛋白的濃度與純度，然后再采用價格低廉的SephadexG-200層析柱直接純化獲得了大瀧六線魚卵黃原蛋白，較其它魚類卵黃原蛋白的純化方案更加省時、操作簡便，還極大提高了純化蛋白的濃度，本發(fā)現(xiàn)的試劑盒利用抗原抗體之間的特異性結合能力，能夠靈敏、方便地定性檢測大瀧六線魚在不同污染物暴露下體內卵黃原蛋白的生成水平，為評價我國近岸海域的環(huán)境雌激素效應提供了重要的手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明的大瀧六線魚卵黃原蛋白的純化圖譜；
圖2為本發(fā)明的大瀧六線魚卵黃原蛋白的鑒定結果；(泳道I為糖蛋白染色結果；泳道2為磷蛋白染色結果；泳道3為脂蛋白染色結果)
圖3為本發(fā)明大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體對雄性、雌性大瀧六線魚血漿與卵黃原蛋白純品的檢測結果(泳道I為雄性大瀧六線魚血漿；泳道2為雌性大瀧六線魚血漿；泳道3為純化的卵黃原蛋白)；
【具體實施方式】:
實施例1
一種檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒，包括一個盒體，該盒體內裝有:1)PVDF膜2張；2)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗I支；3)封閉液、洗滌液、顯色液各I支，所述的洗滌液為TBST ;封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST ;顯色液為含0.06%(m/V) 3’- 二氨基聯(lián)苯胺的1mM Tris-HCl ;其特征在于該盒體還裝有:4)大瀧六線魚卵黃原蛋白純品I支；5)大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體I支。
[0016]上述試劑盒的制備方法包括以下兩部分:
(I)大瀧六線魚卵黃原蛋白純品的制備方法采用肌肉注射17盧-雌二醇(17/?-eStrad1l，E2)的方式誘導大瀧六線魚產生卵黃原蛋白。注射一周后取血，4°C，5000 g離心10分鐘，收集上清液；向上清中加入等體積的飽和硫酸銨溶液，冰浴條件下?lián)u晃2小時后5000 g離心10分鐘，向沉淀中加入25mM Tris-HCl(pH 7.5),使沉淀重新溶解。進一步的純化采用Sephadex G-200層析柱(1.5' 20 cm),力口入I ml上述溶液，用25mM Tris-HCl (pH 7.5)以流速0.3 ml/min沖洗層析柱，收集第一個洗脫峰，即為大瀧六線魚卵黃原蛋白。
[0017](2)大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備
取600 μ g純化的大瀧六線魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后對新西蘭大白兔進行背部皮下多點注射，每點注射0.1 ml，兩周后再次加強免疫，免疫劑量為600 μ g/只，用弗氏不完全佐劑充分乳化后進行背部皮下注射。此后，每隔7天按以上方法進行加強免疫。于每5次注射5天后從心臟取血，6000 r/min離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗血清?？贵w的純化分為以下幾步，上樣前向多克隆抗血漿中加入1/3左右的對照陰性樣品(雄魚勻漿液)，低溫振蕩2h，4°C過夜，次日離心取上清；向上清中加入等體積的0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4);在冰浴條件下加入硫酸銨，至50%飽和度，(TC震蕩2h后，低溫離心(8000 rpm, 15min)，棄上清，沉淀用10 ml
0.02 mol/L磷酸緩沖液溶解;以0.02 mol/L磷酸緩沖液透析24 h，其間換液4次；用0.45微米孔徑的濾膜過濾后，上Hitrap Protein G柱,隨后以0.02mol/L磷酸緩沖液洗脫10個柱體積，然后以0.1M甘氨酸(pH 2.7)洗脫抗體，即獲得兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體。
[0018]經過以上操作，得到的檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒具體組成如下:
1)PVDF 膜 2 張；
2)大瀧六線魚卵黃原蛋白純品I支，使用前用PBS稀釋至Iμ g/ml ；
3)兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體I支，使用前用封閉液按I: 1000的體積比稀釋；
4)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗I支，使用前用封閉液按1:500的體積比稀釋；
5)封閉液、洗滌液、顯色液各I支，所述的洗滌液為TBST(100mMTris-HClU50mMNaCU0.05% Tween-20, ρΗ7.5);封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST ;顯色液為含0.06%(m/V)3’ - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)的1mM Tris-HCl，使用前向顯色液中加入0.05% (v/v)雙氧水。
[0019]本發(fā)明的試劑盒可用于大瀧六線魚卵黃原蛋白的定性檢測。
[0020]實施例2
利用本發(fā)明的試劑盒定性檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的方法，具體包括以下步驟:
1)將試劑盒中的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品和待測的樣品稀釋后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，所述的待測的樣品包括大瀧六線魚血漿、體表粘液、肝臟組織及肝細胞培養(yǎng)液；
2)把電泳凝膠上的蛋白轉印到PVDF膜；
3)用封閉液封閉PVDF膜的非特異性結合位點，4°C孵育過夜，棄去封閉液；
4)加入用封閉液稀釋的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體(1:1000)，室溫下震蕩孵育，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜5次； 5)加入用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1:2000)，室溫下震蕩孵育，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜5次；
6)加入顯色液，待蛋白質條帶清晰后，棄去顯色液，用蒸餾水終止顯色反應，PVDF膜拍照后于避光處保存；
7)在雄性大瀧六線魚樣品中發(fā)現(xiàn)有顯色條帶，表明該魚體內產生了卵黃原蛋白，其生活的水環(huán)境受到了環(huán)境雌激素類物質的污染。
【權利要求】
1.一種檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒，包括一個盒體，該盒體內裝有:1)PVDF膜2張；2)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗I支；3)封閉液、洗滌液、顯色液各I支，所述的洗滌液為TBST ;封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST ;顯色液為含0.06%(m/V) 3’-二氨基聯(lián)苯胺的1mM Tris-HCl ;其特征在于該盒體還裝有:4)大瀧六線魚卵黃原蛋白純品I支，5)兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體I支。
2.制備權利要求1所述的檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒，其特征在于，包括下列步驟: 1)制備大瀧六線魚卵黃原蛋白純品； 2)利用步驟I)得到的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品制備兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體； 3)將步驟I)得到的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品I支、步驟2)得到的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體I支、PVDF膜2張，以及封閉液、洗滌液、顯色液和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗I支共同裝入盒體，得到檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒。
3.如權利要求2所述的檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于所述的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品的制備方法如下: 采用肌肉注射17盧-雌二醇(17/?-eStrad1l，E2)的方式誘導大瀧六線魚產生卵黃原蛋白；注射一周后取血，4°C，5000 g離心10分鐘，收集上清液；向上清中加入等體積的飽和硫酸銨溶液，冰浴條件下?lián)u晃2小時后離心，向沉淀中加入pH 7.5的25mM Tris_HCl，使沉淀重新溶解；進一步的純化采用1.5' 20 cm的Sephadex G-200層析柱,加入I ml上述溶液，用pH 7.5的25mM Tris-HCl洗層析柱，收集第一個洗脫峰，即為大瀧六線魚卵黃原蛋白。
4.如權利要求2所述的檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于所述的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備方法如下: 取600 μ g純化的大瀧六線魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，對大白兔進行背部皮下多點注射，兩周后再次加強免疫，免疫劑量為600 μ g/只，用弗氏不完全佐劑充分乳化后進行背部皮下注射；此后，每隔10天按以上方法進行加強免疫；于每5次注射5天后從心臟取血，6000 g離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗血清；向抗血清中加入等體積的0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4);在冰浴條件下加入硫酸銨，至50%飽和度，(TC震蕩2h后，低溫離心(8000 g, 15min)，棄上清，沉淀用1ml0.02mol/L磷酸緩沖液溶解；以0.02mol/L磷酸緩沖液透析24h，其間換液4次；用0.45微米孔徑的濾膜過濾后，上Hitrap Protein G柱,隨后以0.02 mol/L磷酸緩沖液洗脫10個柱體積，然后以0.1M甘氨酸(pH2.7)洗脫抗體，即獲得兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體。
5.權利要求1所述的檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的免疫印跡試劑盒，在海洋環(huán)境雌激素類物質篩選與內分泌擾亂化學物質研究中的應用。
6.一種利用權利要求1所述的試劑盒定性檢測大瀧六線魚卵黃原蛋白的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: I)將試劑盒中的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品和待測的樣品稀釋后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，所述的待測的樣品包括大瀧六線魚血漿、體表粘液、肝臟組織及肝細胞培養(yǎng)液； 2)把電泳凝膠上的蛋白轉印到PVDF膜； 3)用封閉液封閉PVDF膜的非特異性結合位點，4°C孵育過夜，棄去封閉液； 4)加入用封閉液稀釋1000倍的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體，室溫下震蕩孵育，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜5次； 5)加入用封閉液稀釋2000倍的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫下震蕩孵育，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜5次； 6)加入顯色液，待蛋白質條帶清晰后，棄去顯色液，用蒸餾水終止顯色反應，PVDF膜拍照后于避光處保存； 7)如果在雄性大瀧六線魚樣品中發(fā)現(xiàn)有顯色條帶，表明該魚體內產生了卵黃原蛋白，其生活的水環(huán)境受到了環(huán)境雌激素類物質的污染。
【文檔編號】G01N33/531GK104316706SQ201410644566
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權日:2014年11月14日
【發(fā)明者】王駿, 王松, 張鐵軍, 冷凱良, 苗鈞魁, 姜勇, 羅忻, 吳振興 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心