一種南瓜果實(shí)肌醇類和單、雙糖類物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種南瓜果實(shí)肌醇類和單、雙糖類物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)方法，包括：南瓜果實(shí)的前處理：甲醇溶液提取南瓜果實(shí)中的肌醇和單糖、雙糖物質(zhì)；硅烷化處理：GC-MS檢測(cè)等步驟。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單高效、成本低、GC-MS的進(jìn)樣時(shí)間短、出峰完全，可同時(shí)分析多個(gè)物質(zhì)，應(yīng)用性強(qiáng)，可以為南瓜品質(zhì)育種提供有效可靠的數(shù)據(jù)。
【專利說(shuō)明】-種南瓜果實(shí)肌醇類和單、雙糖類物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種南瓜果實(shí)中同時(shí)檢測(cè)肌醇和單糖、雙糖 的檢測(cè)方法，具體涉及一種利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS)對(duì)南瓜果實(shí)中的兩種肌 醇(肌-肌醇和D-手性肌醇）和單糖、雙糖(葡萄糖、半乳糖、果糖及蔗糖）同時(shí)的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 南瓜屬葫蘆科植物，可藥食兩用的蔬菜，含有一些其它蔬菜不具有的代謝物如多 糖、肌醇、甘露醇、生物堿、葫蘆巴堿等營(yíng)養(yǎng)成分。目前，南瓜正在作為特效保健食品和功能 蔬菜進(jìn)行開(kāi)發(fā)，而且開(kāi)發(fā)前景可觀。南瓜的一些成分對(duì)糖尿病具有良好食療效果如多糖和 肌醇。肌醇包括肌_肌醇和D-手性-肌醇，它們?cè)谝葝u素作用的信號(hào)傳遞中起重要作用。 研究發(fā)現(xiàn)正常人血液及尿液中含有一定濃度的肌醇，而II型糖尿病人中則幾乎檢測(cè)不到， 其中，D-手性肌醇對(duì)II型糖尿病具有更加顯著療效，而肌-肌醇除其降糖功能，也是動(dòng)物 重要的生長(zhǎng)因子，是國(guó)際嬰兒配方奶粉的添加物之一，同時(shí)也廣泛應(yīng)用于飼料、醫(yī)藥和化妝 品等行業(yè)。
[0003] 南瓜含有大量的肌醇類分子，雖然早年已建立了相關(guān)方法（Xia et al.，2006)， 但南瓜的還原糖和蔗糖含量豐富，其中蔗糖和葡萄糖的攝入將增加人體血糖含量，因此從 降低血糖角度，篩選低糖和高肌醇南瓜品種是一種需求，能為血糖高的病人提供一種更好 的食療材料。目前對(duì)南瓜不同品種的各降糖成分的含量尚不清楚，研發(fā)快速測(cè)定的方法有 利于降糖品種的開(kāi)發(fā)選育，而同時(shí)檢測(cè)這兩大類物質(zhì)的方法仍未見(jiàn)有報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于一種南瓜果實(shí)中肌醇類和單、雙糖類物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種南瓜果實(shí)中肌醇類和單、雙糖類物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)方法，包括如下步驟： (1) 南瓜果實(shí)的前處理：將南瓜果實(shí)切開(kāi)去除皮、果瓤和種子部分，粉碎、冷凍干燥后研 磨； (2) 肌醇和單糖、雙糖的提取：將研磨后的南瓜果實(shí)樣品溶于60%_70%甲醇溶液中，力口 入標(biāo)準(zhǔn)品松醇〇. 〇lg/L，50°C -70°C下水浴至少lh，離心，取上清真空干燥； (3) 硅烷化處理：步驟（2)真空干燥后的樣品中加入硅烷化試劑，于80°C水浴下反應(yīng)至 少I h，并于室溫冷卻，娃燒化后的樣品加入等體積的己燒； (4) GC-MS檢測(cè)：GC-MS檢測(cè)時(shí)采用氣相毛細(xì)色譜柱，設(shè)置分流比為80:1，兩種掃描方式 包括全掃描模式和選擇離子掃描，選擇離子的特征離子為265和318,檢測(cè)時(shí)間為32min。
[0006] 作為優(yōu)選的，步驟（2)將研磨后的南瓜果實(shí)樣品溶于60%甲醇溶液中，70°C下水浴 Ih0
[0007] 作為優(yōu)選的，步驟（2)取上清干燥后，再次溶解于水中，再次真空干燥。
[0008] 步驟（2)所述離心是指在12000 r/min下離心10 min。
[0009] 步驟（4)中氣相毛細(xì)色譜柱的規(guī)格為：30mX0. 25mm，0. liim。
[0010] 以上所述的方法在瓜類育種中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明利用GC-MS開(kāi)發(fā)出可同時(shí)檢測(cè)與糖尿病相關(guān)的兩大物質(zhì)，綜合淀粉、另一降糖 成分多糖等參數(shù)用于開(kāi)發(fā)高附加值的南瓜育種材料以及雜交品種的篩選，并為近一步對(duì)品 質(zhì)相關(guān)QTL定位提供方法，該方法也可用于瓜類蔬菜作物的肌醇和單、雙糖檢測(cè)，為瓜類品 質(zhì)育種提供技術(shù)支持。
[0012] 本發(fā)明方法中的提取步驟簡(jiǎn)單快速、提取率高、成本低；GC-MS的進(jìn)樣時(shí)間短，出 峰完全，可同時(shí)分析多個(gè)物質(zhì)，重復(fù)性好，結(jié)果精確穩(wěn)定。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為南瓜果實(shí)氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS)全掃描圖，其中，1為果糖，2為D-松醇， 3為半乳糖，4為葡萄糖，5為D-手性-肌醇，6為肌-肌醇，7為蔗糖； 圖2為樣品中果糖峰離子解析譜與譜庫(kù)中的對(duì)比； 圖3為樣品中D-松醇峰離子解析譜與譜庫(kù)中的對(duì)比； 圖4為樣品中半乳糖峰離子解析譜與譜庫(kù)中的對(duì)比； 圖5為樣品中葡萄糖峰離子解析譜與譜庫(kù)中的對(duì)比； 圖6為樣品中D-手性-肌醇峰離子解析譜與譜庫(kù)中的對(duì)比； 圖7為樣品中肌-肌醇峰離子解析譜與譜庫(kù)中的對(duì)比； 圖8為樣品中蔗糖峰離子解析譜與譜庫(kù)中的對(duì)比。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0015] 實(shí)施例1 南瓜果實(shí)樣品檢測(cè) 本實(shí)施例研究了不同提取物濃度、不同提取溫度，以及其后是否需要DTT或者水處理 對(duì)南瓜果實(shí)中肌醇類和單、雙糖類提取效率的影響，為南瓜果實(shí)的肌醇類和單、雙糖類物質(zhì) 的測(cè)定提供了一種快速、高效的測(cè)定方法。步驟如下： (1)南瓜果實(shí)的前處理：香蜜小南瓜的成熟果實(shí)，置于榨汁機(jī)中粉碎，經(jīng)冷凍干燥后，研 磨完全。
[0016] (2)肌醇和單糖、雙糖的提取：試驗(yàn)組設(shè)計(jì)如下： 肌醇類和單、雙糖類物質(zhì)的提?。簩⒎鬯楹髽悠愤M(jìn)行研磨至無(wú)顆粒物質(zhì)，按20g干物質(zhì) 加IL溶劑的比例，用水、70%乙醇溶液、60%甲醇溶液或者70%甲醇溶液進(jìn)行提取，加入標(biāo)準(zhǔn) 品松醇〇? 01 g/L，其中： ① 抽取3組60%甲醇溶液和3組70%甲醇溶液處理的提取物分別于溫度為50°C、60°C 和70°C的水浴處理I h，樣品經(jīng)充分提取后12000 r/min離心10 min，取100 ill上清液置 于真空干燥儀中，12000 r/min干燥完全后樣品直接進(jìn)行硅烷化處理； ② 另抽取水、70%乙醇溶液、60%甲醇溶液提取物各一組置于70°C水浴中處理I h，中間 進(jìn)行若干次混勻；樣品經(jīng)充分提取后12000 r/min離心10 min，取100 上清液置于真 空干燥儀中12000 r/min干燥完全后重新溶解于水中，再次干燥后進(jìn)行硅烷化處理； ③另抽取水、70%乙醇溶液、60%甲醇溶液提取物各一組置于70°C水浴中處理I h，中間 進(jìn)行若干次混勻；樣品經(jīng)充分提取后12000 r/min離心10 min，取100 上清液置于真 空干燥儀中12000 r/min干燥完全，后重新溶解于水中，再次干燥后經(jīng)DTT處理，再進(jìn)行硅 烷化處理。
[0017] (3)硅烷化處理：干燥后的樣品加入硅烷化試劑（批啶：BSTFA+1%三甲基氯硅烷， 1:1)，于80°C水浴下反應(yīng)至少I h，并于室溫冷卻，硅烷化后的樣品加入等體積的己烷。
[0018] (4) GC-MS檢測(cè)：樣品經(jīng)0. 2 y m有機(jī)溶劑濾膜過(guò)濾后置于進(jìn)樣瓶中，所用的GC為 Agilent Technologies 7890A，用 HP-5MS 毛細(xì)管柱（30mX0.25mm，0.1 um)為固定相。升 溫程序?yàn)槌跏紲囟?0°C，以6. 5°C /min升至274°C;進(jìn)樣口溫度為250°C;以氦氣作為載氣， 流速設(shè)為9. I psi ;進(jìn)樣量為liU，設(shè)置分流比為80:1 ;質(zhì)譜測(cè)定中采用全掃描模式和選擇 離子掃描，選擇離子的特征離子為265和318,采集質(zhì)量數(shù)范圍為40-800 ;樣品中物質(zhì)經(jīng)過(guò) 電噴射離子化后用Agilent Technologies 5975C MS;每個(gè)峰與Agilent譜庫(kù)中比較結(jié)合 標(biāo)準(zhǔn)品確定峰物質(zhì)，化合物樣品峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積計(jì)算各化合物的濃度。
[0019] 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：每個(gè)樣品重復(fù)3次，用SPSS16.0軟件進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，并比較不同 提取條件對(duì)肌醇類和單、雙糖類的含量影響。
[0020] 用不同的提取方法、提取溶劑和提取步驟提取南瓜果實(shí)的肌醇類和單、雙糖類物 質(zhì)，其結(jié)果見(jiàn)表1。
[0021] 表1不同提取條件下各個(gè)肌醇類和單、雙糖類物質(zhì)的含量

【權(quán)利要求】
1. 一種南瓜果實(shí)中肌醇類和單、雙糖類物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)方法，包括如下步驟： (1) 南瓜果實(shí)的前處理：將南瓜果實(shí)切開(kāi)去除皮、果瓤和種子部分，粉碎、冷凍干燥后研 磨； (2) 肌醇和單糖、雙糖的提取：將研磨后的南瓜果實(shí)樣品溶于60%-70%甲醇溶液中，力口 入標(biāo)準(zhǔn)品松醇〇. 〇lg/L，50°C -70°C下水浴至少lh，離心，取上清真空干燥； (3) 硅烷化處理：步驟（2)真空干燥后的樣品中加入硅烷化試劑，于80°C水浴下反應(yīng)至 少1 h，并于室溫冷卻，娃燒化后的樣品加入等體積的己燒； (4) GC-MS檢測(cè)：GC-MS檢測(cè)時(shí)采用氣相毛細(xì)色譜柱，設(shè)置分流比為80:1，兩種掃描方式 包括全掃描模式和選擇離子掃描，選擇離子的特征離子為265和318,檢測(cè)時(shí)間為32min。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（2)將研磨后的南瓜果實(shí)樣品溶 于60%甲醇溶液中，70°C下水浴lh。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（2)取上清干燥后，再次溶解于 水中，再次真空干燥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（2)所述離心是指在12000 r/ min下離心10 min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（4)中氣相毛細(xì)色譜柱的規(guī)格 為：30mX 0? 25mm, 0? 1 u m。
6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法在瓜類育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104374845SQ201410665850
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】鐘玉娟, 吳廷全, 黃河勛, 李玉丹, 王瑞, 羅少波, 何曉明, 孫保娟, 徐曉美, 金慶敏 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所