用標記基因預測外源基因表達量及篩選轉基因生物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用標記基因預測外源基因表達量及篩選轉基因生物的方法。采用分子生物學技術構建包含有標記基因和外源基因兩個相鄰且轉錄方向相同的表達框的轉基因表達質粒；采用顯微注射法將轉基因質粒與輔助質粒一起導入到生物的基因組內，培育成外源基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達的轉基因生物；根據(jù)轉基因生物中標記基因表達量的信息預測外源基因表達量，并篩選獲得該外源基因表達量對應的生物個體或品種。本發(fā)明可簡單、快捷、省力地從大量的轉基因生物中篩選出高效表達外源基因的轉基因生物個體或品種，為建立高效的生物反應器提供了理想的篩選手段。
【專利說明】用標記基因預測外源基因表達量及篩選轉基因生物的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及轉基因生物領域中的一種預測及篩選的方法，尤其是涉及一種用標記基因預測外源基因表達量及篩選轉基因生物的方法。

【背景技術】
[0002]利用分子生物學技術將外源基因插入到生物體基因組內，使外源基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達，這種技術稱為轉基因技術，對應的生物稱為轉基因生物。如果外源基因的表達產物是蛋白質，而且是在一個封閉的系統(tǒng)，如乳腺、膀胱、絲腺等系統(tǒng)中表達，這種轉基因生物稱為生物反應器。
[0003]在大多數(shù)的轉基因研究中，外源基因一般都是隨機的插入到宿主基因組中，分布在基因間隔區(qū)、基因內含子、基因外顯子等區(qū)域。不同插入位點的外源基因其表達量會有差異，這種現(xiàn)象被稱為位置效應。因此，要想篩選、獲得外源基因大量表達的轉基因生物，就必須對大量的轉基因個體進行qRT-PCR、Western等分子生物學鑒定，以確定優(yōu)秀個體，篩選的工作量大，耗時長，這已成了開發(fā)和利用轉基因生物的制約環(huán)節(jié)。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用標記基因預測外源基因表達量及篩選轉基因生物的方法，利用兩個緊密相鄰的、表達框同向的外源基因表達量具有顯著相關性的特點，根據(jù)標記基因表達量預測外源基因表達量并進一步篩選轉基因生物，簡單有效，這可以快速地從大量的轉基因個體中篩選出高效表達外源基因的轉基因個體或品種，為加快構建高效的生物反應器奠定基礎。
[0005]為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案的步驟如下:
1)采用分子生物學技術構建包含有標記基因和外源基因兩個表達框的轉基因表達質粒，標記基因和外源基因兩個表達框的相鄰間隔小于30bp且轉錄方向相同；
2)采用顯微注射法將步驟I)得到的轉基因質粒與為轉基因質粒中轉座子提供轉座酶的輔助質粒一起導入到生物的基因組內，培育成外源基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達的轉基因生物；
3)得到的轉基因生物中的標記基因表達量和外源基因表達量具有顯著相關性，根據(jù)轉基因生物中標記基因表達量的信息進行預測和篩選，預測外源基因表達量，并篩選獲得該外源基因表達量對應的生物個體或品種。
[0006]優(yōu)選地，所述的轉基因表達質粒中標記基因和外源基因兩個表達框的前后次序任
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[0007]優(yōu)選地,所述的標記基因采用EGFP標記基因。
[0008]優(yōu)選地，所述的外源基因采用螢火蟲熒光素酶基因(Fluc)或海腎熒光素酶(Rluc)基因。
[0009]優(yōu)選地，所述的宿主采用家蠶。
[0010]優(yōu)選地，所述的轉基因質粒與輔助質粒的混合比例為1:0.5?1:1。
[0011]本發(fā)明具有的有益效果是:
本發(fā)明利用兩個緊密相鄰的、表達框同向的外源基因表達量具有顯著相關性的特點，可用標記基因的表達水平來預測與之相鄰的外源基因表達水平。這種方法相比傳統(tǒng)的轉基因生物外源基因表達水平檢測，具有簡便、省時、省錢的優(yōu)勢。因為標記基因的檢測手法多，技術成熟，所以它可以快速、高效的從大量的轉基因個體中篩選出高效表達外源基因的轉基因生物，提高轉基因生物篩選效率，為建立高效的生物反應器提供了理想的篩選手段。

【具體實施方式】
[0012]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0013]本發(fā)明的實施例如下:
實施例1:
本實施例構建了一個外源基因在前、標記基因在后，且以轉座子為基礎的轉基因質粒pBSerlFluc-A3EGFP，轉基因質粒中，由家蠶中部絲腺特異性表達的膠蛋白I基因(Serl)啟動子啟動螢火蟲熒光素酶(Fluc)外源基因的表達框，由肌動蛋白A3啟動子啟動綠色熒光蛋白(EGFP)標記基因的表達框，其中家蠶中部絲腺特異性表達的絲膠蛋白I基因(Serl)啟動子截取了 575bp長度的近端啟動子，螢火蟲熒光素酶(Fluc)外源基因表達框和綠色熒光蛋白(EGFP)標記基因表達框的相鄰間隔為25bp。
[0014]將pBSerlFluc-A3EGFP轉基因質粒與為piggyBac轉座子提供轉座酶的輔助質粒一起溶解在PH7.6磷酸緩沖液中，磷酸緩沖液中pBSerlFluc-A3EGFP質粒和輔助質粒按1:0.5比率混合，兩種質粒的注射總濃度為0.4Pg/^l。
[0015]然后采用顯微注射法將混合質粒導入家蠶產卵后8小時內的受精卵內，注射總體積為1nl左右。注射后的蠶卵在25°C溫度、85%濕度、12h光照的條件下飼養(yǎng)至成蟲，自交得到Gl代。在Gl代小蠶期，利用日本Olympus SZX12熒光顯微鏡，篩選出表達EGFP標記基因的陽性家蠶，突光顯微鏡的激發(fā)波長為460nm?490nm,發(fā)射波長為510 nm?550 nm。Gl代轉基因家蠶飼養(yǎng)至五齡第三天時，共取7個轉基因家蠶蛾區(qū)，由于轉座子插入基因組的隨機性，7個轉基因家蠶蛾區(qū)被鑒定證明具有不同插入位點，每個蛾區(qū)取3條蠶的中部絲腺作為3個生物學重復。
[0016]采用熒光定量PCR技術，以Rp49為內參基因檢測2個順序排列表達框中的外源基因Fluc和標記基因EGFP的轉錄水平，相關性統(tǒng)計分析結果表明7個轉基因家蠶品種的Fluc和EGFP轉錄水平的相關關系達到極顯著水平，具體結果為:決定系數(shù)R2=0.8382，相關系數(shù)r=0.9155，概率值P < 0.01。該數(shù)據(jù)證明轉基因生物中2個緊密相鄰的、表達框同向的外源基因表達量具有顯著相關性，即使外源基因插入位點不同，因為標記基因和外源基因兩個表達框緊密相鄰，所以外源基因Fluc的轉錄水平依然與標記基因EGFP的轉錄水平存在極顯著相關。
[0017]實施例最后對轉基因蠶根據(jù)EGFP熒光強弱進行檢測，以此判斷EGFP標志基因表達量，預測Fluc外源基因表達量，篩選獲得了 Fluc外源基因表達量對應的家蠶個體。
[0018]實施例進一步對另一次相同的轉基因實驗的8個G2代轉基因家系，根據(jù)EGFP熒光強弱進行檢測，以此判斷了 EGFP標志基因表達量，預測了 Fluc外源基因表達量。首先確定了標記基因EGFP轉錄水平最高的品種為ZY153，實驗再用8個G2代轉基因家系的其他個體，實際檢測了 F Iuc標志基因表達水平，結果比較證明這個品種的外源基因F Iuc的轉錄水平確是最高的，即使采用高水平表達的Rp49為內參基因，其相對轉錄水平仍達到3.3%。實施例證明可以利用標記基因EGFP表達量預測外源基因F Iuc表達量，并進一步篩選得到外源基因F Iuc表達量最聞的轉基因豕香品種。
[0019]雖然從mRNA到蛋白質有一個轉錄后修飾的過程，但因為同一基因的轉錄后修飾過程是一樣的，所以對同一基因而言，選擇了轉錄水平最高的品種，也就是選擇了蛋白表達水平最聞的品種。
[0020]實施例2:
本實施例構建了一個外源基因在前、標記基因在后，且以轉座子為基礎的轉基因質粒pBSerlFluc-A3EGFP，轉基因質粒中，由家蠶中部絲腺特異性表達的膠蛋白I基因(Serl)啟動子啟動螢火蟲熒光素酶(Fluc)外源基因的表達框，由肌動蛋白A3啟動子啟動綠色熒光蛋白(EGFP)標記基因的表達框，其中家蠶中部絲腺特異性表達的絲膠蛋白I基因(Serl)啟動子截取了 4000bp長度的近端啟動子，外源基因表達框和標記基因表達框的相鄰間隔為25bp。
[0021]將pBSerlFluc-A3EGFP轉基因質粒與為piggyBac轉座子提供轉座酶的輔助質粒一起溶解在PH7.6磷酸緩沖液中，磷酸緩沖液中pBSerlFluc-A3EGFP質粒和輔助質粒按1:0.6比率混合，兩種質粒的注射總濃度為0.4Pg/^l。
[0022]然后采用顯微注射法將混合質粒導入家蠶產卵后8小時內的受精卵內，注射總體積為1nl左右。注射后的蠶卵在25°C、85%濕度、12h光照的條件下飼養(yǎng)至成蟲，自交得到Gl代。在Gl代小蠶期，利用日本Olympus SZX12熒光顯微鏡，篩選出表達EGFP標記基因的陽性家蠶，突光顯微鏡的激發(fā)波長為460nm?490nm,發(fā)射波長為510 nm?550 nm。Gl代轉基因家蠶飼養(yǎng)至五齡第三天時，共取5個轉基因家蠶蛾區(qū)，由于轉座子插入基因組的隨機性，5個轉基因家蠶蛾區(qū)被鑒定證實具有不同插入位點，每個蛾區(qū)取3條蠶的中部絲腺作為3個生物學重復。采用熒光定量PCR技術，以Rp49為內參基因檢測2個順序排列表達框中的外源基因Fluc和標記基因EGFP的轉錄水平，相關性統(tǒng)計分析結果表明5個轉基因家蠶品種的Fluc和EGFP轉錄水平的相關關系達到極顯著水平，具體結果為:決定系數(shù)R2=0.9871，相關系數(shù)r=0.9935，顯著性值P < 0.01。該數(shù)據(jù)同實施例1相同，再次證明了轉基因生物中2個緊密相鄰的、表達框同向的外源基因表達量具有顯著相關性，SP使外源基因插入位點不同，因為標記基因和外源基因兩個表達框緊密相鄰，所以外源基因Fluc的轉錄水平依然與標記基因EGFP的轉錄水平存在極顯著相關。
[0023]實施例最后對轉基因蠶根據(jù)EGFP熒光強弱進行檢測，以此判斷EGFP標志基因表達量，預測Fluc外源基因表達量，篩選獲得了 Fluc外源基因表達量對應的家蠶個體。
[0024]實施例進一步對另一次相同的轉基因實驗的6個G2代轉基因家系，根據(jù)EGFP熒光強弱進行檢測，以此判斷了 EGFP標志基因表達量，預測了 Fluc外源基因表達量。首先確定了標記基因EGFP轉錄水平最高的品種為ZY148，實驗再用6個G2代轉基因家系的其他個體，實際檢測了 F Iuc標志基因表達水平，結果比較證明這個品種的外源基因F Iuc的轉錄水平確是最聞的，以Rp49為內參基因，其相對轉錄水平達到2.1%。實施例證明可以利用標記基因EGFP表達量預測外源基因F Iuc表達量，并進一步篩選得到外源基因F Iuc表達量最聞的轉基因家香品種。
[0025]本實施例的原理同實施例1。
[0026]實施例3:
本實施例構建了一個外源基因在后、標記基因在前，且以轉座子為基礎的轉基因質粒pBA3EGFP-Fib-L-Rluc，轉基因質粒中，由家蠶后部絲腺特異性表達的絲素蛋白輕鏈(Fib-L)啟動子啟動海腎熒光素酶(Rluc)外源基因的表達框，由肌動蛋白A3啟動子啟動綠色熒光蛋白(EGFP)標記基因的表達框，其中家蠶后部絲腺特異性表達的絲素蛋白輕鏈(Fib-L)啟動子截取了 690bp長度的近端啟動子，外源基因表達框和標記基因表達框的相鄰間隔為30bp。
[0027]將pBA3EGFP-Fib-L-Rluc轉基因質粒與為piggyBeic轉座子提供轉座酶的輔助質粒一起溶解在PH7.6磷酸緩沖液中，磷酸緩沖液中pBA3EGFP-Fib-L-Rluc質粒和輔助質粒按1:1比率混合,兩種質粒的注射總濃度為0.4μδ/μ1 ?
[0028]然后采用顯微注射法將混合質粒導入家蠶產卵后8小時內的受精卵內，注射總體積為1nl左右。注射后的蠶卵在25°C、85%濕度、12h光照的條件下飼養(yǎng)至成蟲，自交得到Gl代。在Gl代小蠶期，利用日本Olympus SZX12熒光顯微鏡，篩選出表達EGFP標記基因的陽性家蠶，突光顯微鏡的激發(fā)波長為460nm?490nm,發(fā)射波長為510 nm?550 nm。Gl代轉基因家蠶飼養(yǎng)至五齡第三天時，共取6個轉基因家蠶蛾區(qū)，由于轉座子插入基因組的隨機性，6個轉基因家蠶蛾區(qū)被鑒定證明具有不同插入位點，每個蛾區(qū)取3條蠶的后部絲腺作為3個生物學重復，采用熒光定量PCR技術，以GAPDH為內參基因檢測2個順序排列表達框中的外源基因Rluc和標記基因EGFP的轉錄水平，相關性統(tǒng)計分析結果表明6個轉基因家蠶品種的Rluc和EGFP轉錄水平的相關關系達到極顯著水平，具體結果為:具體結果為R2=0.8161,r=0.9034，P < 0.01。該數(shù)據(jù)進一步證明，即使外源基因改成Rluc，但轉基因生物中2個緊密相鄰的、表達框同向的外源基因表達量具有顯著相關性這個特性沒有變化，即使外源基因插入位點不同，因為標記基因和外源基因兩個表達框緊密相鄰，所以外源基因Rluc的轉錄水平依然與標記基因EGFP的轉錄水平存在極顯著相關。
[0029]實施例最后對轉基因蠶根據(jù)EGFP熒光強弱進行檢測，以此判斷EGFP標志基因表達量，預測Fluc外源基因表達量，篩選獲得了 Fluc外源基因表達量對應的家蠶個體。
[0030]實施例進一步對另一次相同的轉基因實驗的9個G2代轉基因家系，根據(jù)EGFP熒光強弱進行檢測，以此判斷了 EGFP標志基因表達量，預測了 Rluc外源基因表達量。首先確定了標記基因EGFP轉錄水平最高的品種為ZWB8，實驗再用9個G2代轉基因家系的其他個體，實際檢測了 Rluc標志基因表達水平，結果比較證明這個品種的外源基因Rluc的轉錄水平確是最高的，以GAPDH為內參基因其相對轉錄水平達到5%。實施例證明可以利用標記基因EGFP表達量預測外源基因F Iuc表達量，并進一步篩選得到外源基因Rluc表達量最高的轉基因家蠶品種。
[0031]本實施例的原理同實施例1。
[0032]綜上所述，本發(fā)明的結果證明了即使外源基因插入位點不同，在標記基因和外源基因兩個表達框緊密相鄰的條件下，外源基因Fluc或Rluc的轉錄水平與標記基因EGFP的轉錄存在極顯著相關。因此，可以利用標記基因來預測外源基因的轉錄水平，從而簡化了從大量轉基因品種中篩選高效表達外源基因品種的程序，具有簡便、省時、省錢的優(yōu)勢，為建立高效的生物反應器提供了理想的篩選手段。
[0033]在所有轉基因生物中，基因表達模式是相同的，都是在啟動子作用下被轉錄表達，具有共同性。本實驗證明外源基因不論是Fluc基因，還是Rluc基因，其轉錄水平都與標記基因EGFP的轉錄水平存在極顯著相關性?？梢灶A見只要是外源基因與標記基因處于鄰近且同向的狀態(tài)，兩者的基因表達水平一定也存在極顯著相關性；而且這種相關性在采用紅色熒光蛋白基因(DsRed)、氯霉素乙酰轉移酶基因(cat)、β -葡萄糖苷酸酶基因(gus)等其他標記基因時也一定存在。
[0034]實施例中的沿(PB)轉座子首次在鱗翅目昆蟲粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細胞系TN-368中發(fā)現(xiàn)。之后，在地中海果蜆(Ceratitis capitata)、黑腹果蜆(Dro-sophila melanogaster)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和家香(Bombyx mori L.)等昆蟲中利用PB轉座系統(tǒng)均取得了轉基因實驗的成功。研究還證明PB轉座子是一個廣譜的轉座系統(tǒng)，已經在酵母(Schizosaccharomyces pombe)、真潤蟲(Girardia tigrina)、斑馬魚(Dan1rer1)、雞、牛、豬、水稻和人細胞等，從無脊椎動物到有脊椎動物等多種生物中成功實現(xiàn)轉基因。由此可見，雖然實施例采用的物種是家蠶，但本發(fā)明也同樣適用于其他物種，具有顯著的技術效果。
[0035]上述【具體實施方式】用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權利要求的保護范圍內，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種用標記基因預測外源基因表達量及篩選轉基因生物的方法，其特征在于該方法的步驟如下: 1)采用分子生物學技術構建包含有標記基因和外源基因兩個表達框的轉基因表達質粒，標記基因和外源基因兩個表達框的相鄰間隔小于30bp且轉錄方向相同； 2)采用顯微注射法將步驟I)得到的轉基因質粒與為轉基因質粒中轉座子提供轉座酶的輔助質粒一起導入到生物的基因組內，培育成外源基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達的轉基因生物； 3)得到的轉基因生物中的標記基因表達量和外源基因表達量具有顯著相關性，根據(jù)轉基因生物中標記基因表達量的信息進行預測和篩選，預測外源基因表達量，并篩選獲得該外源基因表達量對應的生物個體或品種。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種用標記基因預測外源基因表達量及篩選轉基因生物的方法，其特征在于:所述的轉基因表達質粒中標記基因和外源基因兩個表達框的前后次序任意。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種用標記基因預測外源基因表達量及篩選轉基因生物的方法，其特征在于:所述的標記基因采用EGFP標記基因。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種用標記基因預測外源基因表達量及篩選轉基因生物的方法，其特征在于:所述的外源基因采用螢火蟲熒光素酶基因或海腎熒光素酶基因。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種用標記基因預測外源基因表達量及篩選轉基因生物的方法，其特征在于:所述的宿主采用家蠶。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種用標記基因預測外源基因表達量及篩選轉基因生物的方法，其特征在于:所述的轉基因質粒與輔助質粒的混合比例為1:0.5?1:1。
【文檔編號】G01N21/64GK104404072SQ201410678673
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權日:2014年11月24日
【發(fā)明者】鐘伯雄, 葉露鵬, 錢秋杰, 張玉玉, 尤征英, 王少華, 車佳倩, 宋佳 申請人:浙江大學