一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中l(wèi)-谷氨酰胺含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法，包括以下步驟：步驟一、取谷氨酰胺的生產(chǎn)菌株，活化培養(yǎng)，然后移種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；步驟二、將發(fā)酵液振蕩、離心得到待測(cè)液；步驟三、配制展開劑、顯色劑和洗脫液；步驟四、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；步驟五、取步驟二得到的待測(cè)液在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，展開、顯色、洗脫，取樣，用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，在步驟四得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線中取得對(duì)應(yīng)值，即得到發(fā)酵液中L-谷氨酰胺的含量。本發(fā)明的方法能夠快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量，準(zhǔn)確度高，快速簡(jiǎn)單，成本低，時(shí)效性好。
【專利說明】一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]L-谷氨酰胺為人和動(dòng)物的非必需氨基酸，但具有諸多特有的生理功能，如能提高人體免疫力，對(duì)腦機(jī)能和胃腸道功能的發(fā)揮有明顯促進(jìn)作用等特殊功效。目前在食品保健、飼料添加劑、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域有較廣泛的應(yīng)用和良好的發(fā)展前景。目前國內(nèi)外主要采用發(fā)酵法生產(chǎn)來L-谷氨酰胺，較常用的發(fā)酵液中谷氨酰胺檢測(cè)方法主要有氨基酸自動(dòng)分析儀法，酸水解測(cè)氨法，高效液相色譜法、紙層析法等。氨基酸自動(dòng)分析儀法重現(xiàn)性差，酸水解測(cè)氨法易受發(fā)酵液中銨根離子干擾，高效液相色譜法成本較高，一般需進(jìn)行柱前衍生，操作較為復(fù)雜。紙層析法操作簡(jiǎn)單，成本較低，但是層析時(shí)間較長(zhǎng)，定量測(cè)定不夠精確，難于時(shí)效的指導(dǎo)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法不精準(zhǔn)、操作復(fù)雜、成本較高等技術(shù)問題，提供一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法，該方法能夠快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量，準(zhǔn)確度高，快速簡(jiǎn)單，成本低，時(shí)效性好。
[0004]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的采用的技術(shù)方案是:一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法，包括以下步驟:
步驟一、取谷氨酰胺的生產(chǎn)菌株，活化后接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，然后以10%的接種量移種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，備用；
步驟二、取步驟一得到的發(fā)酵液，先置于渦旋振蕩器中振蕩2-4min，振蕩結(jié)束后取1.5mL置于離心管中在1000rpm條件下離心3_5min,得到待測(cè)液,備用；
步驟三、按照3:1:0.2-0.5的體積比取正丙醇、氨水和甲醇，混合均勻，得到展開劑，備用；配制質(zhì)量濃度為0.2-0.5%的茚三酮丙酮溶液，得到顯色劑，備用；按照2:25:7-10的體積比為取質(zhì)量濃度為0.1%的CuSO4溶液、乙醇溶液和質(zhì)量濃度為10%的乙酸溶液，混合均勻，得到洗脫液，備用；
步驟四、配制 0.5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L 和10g/L谷氨酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，先在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL，然后置于層析缸中展開，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干3-5min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110-120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，再將刻下的硅膠于試管中用1mL洗脫液洗脫25-30min，然后用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，備用；
步驟五、取步驟二得到的待測(cè)液在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL，然后置于層析缸中展開45min，層析缸中盛放有步驟三得到的展開劑，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干3-5min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110-120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，得到含酸硅膠，備用；
將上述得到的含酸硅膠置于1ml步驟三得到的洗脫液中，洗脫25-30min后，取樣，用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，每個(gè)樣品測(cè)定三次，然后在步驟四得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線中取得對(duì)應(yīng)值，即得到發(fā)酵液中L-谷氨酰胺的含量。
[0005]步驟一所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)以下營養(yǎng)成分的含量分別為葡萄糖
3-7%、玉米漿 1-3%、NH4Cl 2-4%、KH2PO4 0.2-0.4%、MgSO4 0.08-0.2%、KCl 0.1-0.2% ;按照每升計(jì)，以下營養(yǎng)成分的添加量分別為酵母粉1-1.5g/L、FeSO4 10_20mg/L、CuSO4 2-lOmg/L、硫胺素l-10mg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1-0.2%的抑制劑檸檬酸，以及由MnCl2和ZnSO4組成的谷氨酰胺合成酶的激活劑，且添加量分別為MnCl250-150mg/L和 ZnSO4 10_80mg/L。
[0006]步驟二所述置于渦旋振蕩器中進(jìn)行振蕩的發(fā)酵液的溫度為50°C。
[0007]本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供的的方法首次將先薄層層析與洗脫、后測(cè)定物質(zhì)吸光值來分析物質(zhì)含量應(yīng)用到谷氨酰胺發(fā)酵液中L-谷氨酰胺的快速檢測(cè)領(lǐng)域，該方法能夠快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量，準(zhǔn)確度高，快速簡(jiǎn)單，成本低，時(shí)效性好，克服了現(xiàn)有的測(cè)定方法不精準(zhǔn)、操作復(fù)雜、成本較高等技術(shù)難題。
[0008]本發(fā)明選用的展開劑使谷氨酸與谷氨酰胺樣點(diǎn)明顯分開且無拖尾現(xiàn)象，薄層層析完畢后，先進(jìn)行烘干操作，再顯色最后烘干可使樣點(diǎn)清晰可見，有效提高精確度，相對(duì)于其它常規(guī)的檢測(cè)方法具有快速、準(zhǔn)確、易于操作的優(yōu)勢(shì)，用HPLC復(fù)測(cè)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該方法準(zhǔn)確率在99%以上。

【具體實(shí)施方式】
[0009]一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法，包括以下步驟:
步驟一、取谷氨酰胺的生產(chǎn)菌株，活化后接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，然后以10%的接種量移種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，備用；
步驟二、取步驟一得到的發(fā)酵液，先置于渦旋振蕩器中振蕩2-4min，振蕩結(jié)束后取
1.5mL置于離心管中在1000rpm條件下離心3_5min,得到待測(cè)液,備用；
步驟三、按照3:1:0.2-0.5的體積比取正丙醇、氨水和甲醇，混合均勻，得到展開劑，備用；配制質(zhì)量濃度為0.2-0.5%的茚三酮丙酮溶液，得到顯色劑，備用；按照2:25:7-10的體積比為取質(zhì)量濃度為0.1%的CuSO4溶液、乙醇溶液和質(zhì)量濃度為10%的乙酸溶液，混合均勻，得到洗脫液，備用；
步驟四、配制 0.5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L 和10g/L谷氨酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，先在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL，然后置于層析缸中展開，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干3-5min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110-120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，再將刻下的硅膠于試管中用1mL洗脫液洗脫25-30min，然后用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，備用； 步驟五、取步驟二得到的待測(cè)液在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL，然后置于層析缸中展開45min，層析缸中盛放有步驟三得到的展開劑，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干3-5min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110-120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，得到含酸硅膠，備用；
將上述得到的含酸硅膠置于1ml步驟三得到的洗脫液中，洗脫25-30min后，取樣，用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，每個(gè)樣品測(cè)定三次，然后在步驟四得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線中取得對(duì)應(yīng)值，即得到發(fā)酵液中L-谷氨酰胺的含量。
[0010]步驟一所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)以下營養(yǎng)成分的含量分別為葡萄糖
3-7%、玉米漿 1-3%、NH4Cl 2-4%、KH2PO4 0.2-0.4%、MgSO4 0.08-0.2%、KCl 0.1-0.2% ;按照每升計(jì)，以下營養(yǎng)成分的添加量分別為酵母粉1-1.5g/L、FeSO4 10_20mg/L、CuSO4 2-lOmg/L、硫胺素l-10mg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1-0.2%的抑制劑檸檬酸，以及由MnCl2和ZnSO4組成的谷氨酰胺合成酶的激活劑，且添加量分別為MnCl250-150mg/L和 ZnSO4 10_80mg/L。
[0011]步驟二所述置于渦旋振蕩器中進(jìn)行振蕩的發(fā)酵液的溫度為50°C。
[0012]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明:
實(shí)施例1:
一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法，包括以下步驟:
步驟一、取谷氨酰胺的生產(chǎn)菌株，活化后接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，然后以10%的接種量移種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，備用；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)以下營養(yǎng)成分的含量分別為葡萄糖7%、玉米漿1%、NH4Cl 2%, KH2PO4 0.2%, MgSO4 0.08%、KCl 0.1% ;按照每升計(jì)，以下營養(yǎng)成分的添加量分別為酵母粉1.5g/L、FeSO4 10mg/L、CuSO42mg/L、硫胺素lmg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1%的抑制劑檸檬酸，以及由MnCl2和ZnSO4組成的谷氨酰胺合成酶的激活劑，且添加量分別為MnCl2 50mg/L和ZnSO4 80mg/L ；
步驟二、取步驟一得到的發(fā)酵液，先置于渦旋振蕩器中振蕩2min，進(jìn)行振蕩的發(fā)酵液的溫度為50°C，振蕩結(jié)束后取1.5mL置于離心管中在1000rpm條件下離心3min，得到待測(cè)液，備用；
步驟三、按照3:1:0.2的體積比取正丙醇、氨水和甲醇，混合均勻，得到展開劑，備用；配制質(zhì)量濃度為0.2%的茚三酮丙酮溶液，得到顯色劑，備用；按照2:25:7的體積比為取質(zhì)量濃度為0.1%的CuSO4溶液、乙醇溶液和質(zhì)量濃度為10%的乙酸溶液，混合均勻，得到洗脫液，備用；
步驟四、配制 0.5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L 和10g/L谷氨酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，先在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL，然后置于層析缸中展開，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干3min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110-120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，再將刻下的硅膠于試管中用1mL洗脫液洗脫25min，然后用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，備用；
步驟五、取步驟二得到的待測(cè)液在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL，然后置于層析缸中展開45min，層析缸中盛放有步驟三得到的展開劑，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干3min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110-120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，得到含酸硅膠，備用;
將上述得到的含酸硅膠置于1ml步驟三得到的洗脫液中，洗脫25min后，取樣，用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，每個(gè)樣品測(cè)定三次，然后在步驟四得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線中取得對(duì)應(yīng)值，即得到發(fā)酵液中L-谷氨酰胺的含量。
[0013]采用本實(shí)施例測(cè)得發(fā)酵液的酸含量分別為15.62 g/L、15.68 g/L和15.64g/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.0249。采用HPLC法進(jìn)行復(fù)測(cè)驗(yàn)證，取發(fā)酵液離心后將上清過濾，然后進(jìn)行OPA衍生，上樣梯度洗脫，分析結(jié)果為15.58g/L。
[0014]實(shí)施例2:
一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法，包括以下步驟:
步驟一、取谷氨酰胺的生產(chǎn)菌株，活化后接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，然后以10%的接種量移種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，備用；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)以下營養(yǎng)成分的含量分別為葡萄糖3%、玉米漿3%、NH4Cl 4%, KH2PO4 0.4%, MgSO4 0.2%、KC10.2% ;按照每升計(jì)，以下營養(yǎng)成分的添加量分別為酵母粉lg/L、FeS0420mg/L、CuSO410mg/L、硫胺素10mg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.2%的抑制劑檸檬酸，以及由MnCl2和ZnSO4組成的谷氨酰胺合成酶的激活劑，且添加量分別為MnCl2150mg/L 和 ZnSO4 10mg/L ；
步驟二、取步驟一得到的發(fā)酵液，先置于渦旋振蕩器中振蕩4min，進(jìn)行振蕩的發(fā)酵液的溫度為50°C，振蕩結(jié)束后取1.5mL置于離心管中在1000rpm條件下離心5min，得到待測(cè)液，備用；
步驟三、按照3:1:0.5的體積比取正丙醇、氨水和甲醇，混合均勻，得到展開劑，備用；配制質(zhì)量濃度為0.5%的茚三酮丙酮溶液，得到顯色劑，備用；按照2:25:10的體積比為取質(zhì)量濃度為0.1%的CuSO4溶液、乙醇溶液和質(zhì)量濃度為10%的乙酸溶液，混合均勻，得到洗脫液，備用；
步驟四、配制 0.5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L 和10g/L谷氨酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，先在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL，然后置于層析缸中展開，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干5min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110-120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，再將刻下的硅膠于試管中用1mL洗脫液洗脫30min，然后用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，備用；
步驟五、取步驟二得到的待測(cè)液在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL，然后置于層析缸中展開45min，層析缸中盛放有步驟三得到的展開劑，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干5min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110-120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，得到含酸硅膠，備用;
將上述得到的含酸硅膠置于1ml步驟三得到的洗脫液中，洗脫30min后，取樣，用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，每個(gè)樣品測(cè)定三次，然后在步驟四得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線中取得對(duì)應(yīng)值，即得到發(fā)酵液中L-谷氨酰胺的含量。
[0015]采用本實(shí)施例測(cè)得發(fā)酵液的酸含量分別為30.65 g/L、30.75 g/L和30.64g/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.0411。采用HPLC法進(jìn)行復(fù)測(cè)驗(yàn)證，取發(fā)酵液離心后將上清過濾，然后進(jìn)行OPA衍生，上樣梯度洗脫，分析結(jié)果為30.48g/L。
[0016]實(shí)施例3:
一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法，包括以下步驟:
步驟一、取谷氨酰胺的生產(chǎn)菌株，活化后接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，然后以10%的接種量移種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，備用；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)以下營養(yǎng)成分的含量分別為葡萄糖5%、玉米漿2%、NH4Cl 3%、KH2PO40.3%、MgSO40.1%、KCl0.15% ;按照每升計(jì)，以下營養(yǎng)成分的添加量分別為酵母粉1.2g/L、FeSO4 15mg/L、CuSO46mg/L、硫胺素6mg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.15%的抑制劑檸檬酸，以及由MnCl2和ZnSO4組成的谷氨酰胺合成酶的激活劑，且添加量分別為MnCl2 100mg/L和 ZnSO4 45mg/L ；
步驟二、取步驟一得到的發(fā)酵液，先置于渦旋振蕩器中振蕩3min，進(jìn)行振蕩的發(fā)酵液的溫度為50°C，振蕩結(jié)束后取1.5mL置于離心管中在1000rpm條件下離心4min，得到待測(cè)液，備用；
步驟三、按照3:1:0.4的體積比取正丙醇、氨水和甲醇，混合均勻，得到展開劑，備用；配制質(zhì)量濃度為0.4%的茚三酮丙酮溶液，得到顯色劑，備用；按照2:25:9的體積比為取質(zhì)量濃度為0.1%的CuSO4溶液、乙醇溶液和質(zhì)量濃度為10%的乙酸溶液，混合均勻，得到洗脫液，備用；
步驟四、配制 0.5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L 和lOg/L谷氨酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，先在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL,然后置于層析缸中展開，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干4min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110-120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，再將刻下的硅膠于試管中用1mL洗脫液洗脫28min，然后用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，備用；
步驟五、取步驟二得到的待測(cè)液在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL，然后置于層析缸中展開45min，層析缸中盛放有步驟三得到的展開劑，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干4min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110-120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，得到含酸硅膠，備用;
將上述得到的含酸硅膠置于1ml步驟三得到的洗脫液中，洗脫28min后，取樣，用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，每個(gè)樣品測(cè)定三次，然后在步驟四得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線中取得對(duì)應(yīng)值，即得到發(fā)酵液中L-谷氨酰胺的含量。
[0017]采用本實(shí)施例測(cè)得發(fā)酵液的酸含量分別為31.62 g/L、31.68 g/L和31.64g/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.0206。采用HPLC法進(jìn)行復(fù)測(cè)驗(yàn)證，取發(fā)酵液離心后將上清過濾，然后進(jìn)行OPA衍生，上樣梯度洗脫，分析結(jié)果為31.64g/L。
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟一、取谷氨酰胺的生產(chǎn)菌株，活化后接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，然后以10%的接種量移種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，備用； 步驟二、取步驟一得到的發(fā)酵液，先置于渦旋振蕩器中振蕩2-4min，振蕩結(jié)束后取1.5mL置于離心管中在1000rpm條件下離心3_5min,得到待測(cè)液,備用； 步驟三、按照3:1:0.2-0.5的體積比取正丙醇、氨水和甲醇，混合均勻，得到展開劑，備用；配制質(zhì)量濃度為0.2-0.5%的茚三酮丙酮溶液，得到顯色劑，備用；按照2:25:7-10的體積比為取質(zhì)量濃度為0.1%的CuSO4溶液、乙醇溶液和質(zhì)量濃度為10%的乙酸溶液，混合均勻，得到洗脫液，備用； 步驟四、配制 0.5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L 和10g/L谷氨酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，先在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL，然后置于層析缸中展開，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干3-5min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110-120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，再將刻下的硅膠于試管中用1mL洗脫液洗脫25-30min，然后用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，備用； 步驟五、取步驟二得到的待測(cè)液在薄層硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)0.2uL，然后置于層析缸中展開45min，層析缸中盛放有步驟三得到的展開劑，展開完成后置于烘箱中在105°C條件下烘干3-5min，烘干完成后噴灑步驟三得到的顯色劑進(jìn)行顯色，然后再將薄層硅膠板置于烘箱中在110_120°C條件下烘干2min，烘干結(jié)束后用刀將顯色斑點(diǎn)刻下，得到含酸硅膠，備用； 將上述得到的含酸硅膠置于1ml步驟三得到的洗脫液中，洗脫25-30min后，取樣，用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在515nm處的吸光值，每個(gè)樣品測(cè)定三次，然后在步驟四得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線中取得對(duì)應(yīng)值，即得到發(fā)酵液中L-谷氨酰胺的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法，其特征在于:步驟一所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)以下營養(yǎng)成分的含量分別為葡萄糖3-7%、玉米漿 1_3%、NH4Cl 2-4%、KH2PO4 0.2-0.4%、MgSO4 0.08-0.2%、KCl 0.1-0.2% ;按照每升計(jì)，以下營養(yǎng)成分的添加量分別為酵母粉1-1.5g/L、FeSO4 10_20mg/L、CuSO4 2-lOmg/L、硫胺素l-10mg/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1-0.2%的抑制劑檸檬酸，以及由MnCl2和ZnSO4組成的谷氨酰胺合成酶的激活劑，且添加量分別為MnCl2 50_150mg/L和ZnSO4 10_80mg/L。
3.如權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的方法，其特征在于:步驟二所述置于渦旋振蕩器中進(jìn)行振蕩的發(fā)酵液的溫度為50°C。
【文檔編號(hào)】G01N30/90GK104407093SQ201410678781
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】岳貴龍, 孫朝陽, 徐曉鵬 申請(qǐng)人:河南巨龍生物工程股份有限公司