一種用于100個以內(nèi)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組自動化分析系統(tǒng)及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物分析與檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種用于100個以內(nèi)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組自動化分析系統(tǒng)及方法。本發(fā)明以一個可切換的十通閥為中心，與注射泵、多元梯度泵、質(zhì)譜儀、上樣泵、毛細(xì)管道連接組成系統(tǒng)切換流路。使用時將細(xì)胞直接注入切換系統(tǒng)的微反應(yīng)通道中，經(jīng)過酶解將肽段切換富集在捕集柱上，除鹽純化，再經(jīng)切換，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析。由于使用了在線系統(tǒng)，細(xì)胞的引入、酶解、捕集、除鹽等步驟可自動完成，大大降低了微量樣品的損失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該自動化分析系統(tǒng)對微量細(xì)胞的樣品能夠鑒定到較多種類的蛋白。本發(fā)明簡單實(shí)用，靈敏度高，具有推廣應(yīng)用前景。
【專利說明】一種用于100個以內(nèi)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組自動化分析系統(tǒng)及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分析與檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種酶解微量細(xì)胞用于蛋白質(zhì)組自動化分析系統(tǒng)及方法。

【背景技術(shù)】
[0002]在最近幾年，蛋白質(zhì)組學(xué)有了長足的發(fā)展，其重要性也日益為人所了解。在通常情況下，待分析樣品(不管是細(xì)胞，還是組織或者體液)的分量都是充足的，但是在一些特殊情況下，微量細(xì)胞的分析變得十分重要。第一，生物體有一些特定的細(xì)胞亞群，比方說，Mann等就分析了單個胰島的蛋白質(zhì)組，僅包含2000到4000個細(xì)胞，結(jié)果顯示，單個胰島的蛋白組，不論是在蛋白種類方面，還是在蛋白含量方面，都與周圍的胰腺組織有顯著不同。第二，在臨床環(huán)境中，收集某類細(xì)胞并非易事，比方說利用激光捕獲微切割術(shù)分離腫瘤組織中的變異細(xì)胞就是一個耗時的工作，要收集1000個細(xì)胞可能需要兩個小時。第三，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)具有重要的生物學(xué)意義，但是血液中的含量很低，據(jù)一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從1mL癌癥血清中收集到500個循環(huán)腫瘤細(xì)胞的概率僅為62%。
[0003]此外，單細(xì)胞分析一直是一個研宄熱點(diǎn)，因?yàn)橄啾扔诙嗉?xì)胞分析，單細(xì)胞分析對于揭示生命活動的機(jī)理能夠提供更多的信息。Dovichi等使用各種不同的CE-LIF模式來表征單細(xì)胞的蛋白質(zhì)組。然而利用質(zhì)譜來分析單細(xì)胞將是一個更吸引人的目標(biāo)，因?yàn)橘|(zhì)譜能夠揭示蛋白的種類信息。為實(shí)現(xiàn)這個目標(biāo)，必須先滿足兩個條件。第一是質(zhì)譜有極高的靈敏度，事實(shí)上，最新的質(zhì)譜儀器已經(jīng)可以檢測單細(xì)胞水平的蛋白分子；第二是在把細(xì)胞轉(zhuǎn)換成質(zhì)譜可鑒定的肽段時必須減少樣品損失。常規(guī)的樣品處理流程包括細(xì)胞破膜、蛋白提取、蛋白純化、巰基的還原烷基化、酶解等步驟，其中還往往涉及到緩沖鹽的置換、ziptip除鹽等操作步驟。其系統(tǒng)復(fù)雜，操作麻煩。
[0004]為此，我們簡化這些步驟，設(shè)計(jì)了自動化分析系統(tǒng)，在一個微小的密閉體積內(nèi)使用直接酶解法完成對完整細(xì)胞樣品的處理，盡可能降低了樣品的損失，完成了對微量細(xì)胞的蛋白質(zhì)組高靈敏度分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡單、操作方便的用于100個以內(nèi)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組自動化分析系統(tǒng)及方法。
[0006]本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)組自動化分析系統(tǒng)，以一個可切換的十通閥為中心，與注射泵、多元梯度泵、質(zhì)譜儀、上樣泵、毛細(xì)管道連接組成；十通閥的內(nèi)部通道直徑為50-250微米；其中，十通閥的第一位置與注射針及注射泵連接，第二位置與毛細(xì)管連接作為完整細(xì)胞與酶混合溶液的進(jìn)液口，第三位置和第十位置之間連接體積為1-5微升的毛細(xì)管，作為細(xì)胞的酶解樣品環(huán)；第位置四和第位置七之間連接肽段的捕集柱；第位置五連接液相色譜的多元梯度泵；第位置六連接質(zhì)譜儀；第位置八連接廢液出口 ；第位置九連接上樣泵。
[0007]使用上述蛋白質(zhì)組自動化分析系統(tǒng)，可進(jìn)行蛋白質(zhì)組的自動化分析，即將完整細(xì)胞與酶的混合溶液注入連接在十通閥上的樣品環(huán)內(nèi)，經(jīng)過特定時間(約兩小時)的“一步法”酶解，隨后通過閥的切換，將酶解后的混合物通過泵富集到捕集柱上，對肽段進(jìn)行富集純化后，再次切換閥，將捕集柱與液相色譜納流泵連接進(jìn)行液相色譜分離和質(zhì)譜系統(tǒng)檢測，具體步驟如下:
(1)把細(xì)胞培養(yǎng)收集之后，用PBS稀釋成10-100個/^L的濃度，加入碳酸氫銨、鹽酸胍和胰蛋白酶后配制成細(xì)胞酶解液，精確計(jì)數(shù)，并且根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果確定進(jìn)樣體積；
(2)使用注射泵將細(xì)胞酶解液吸入十通閥上的樣品環(huán)內(nèi)，切換十通閥的位置，使樣品環(huán)兩端封閉，置于柱溫箱或水浴中，37°C?50°C的溫度下保持1-4小時；期間對樣品環(huán)超聲振蕩若干次，完成酶解；
(3)切換十通閥的位置，使樣品環(huán)一端與上樣泵相連，一端與捕集柱相連，通過上樣泵的推動，將肽段富集在捕集柱上，并進(jìn)行除鹽純化；
(4)切換十通閥的位置，利用多元梯度泵的梯度將肽段逐步洗脫，在毛細(xì)管反相色譜柱上分離，并且使用質(zhì)譜儀完成對肽段的檢測。
[0008]本發(fā)明中，所述的肽段捕集柱的結(jié)構(gòu)為:在5-20cm長、20-75微米內(nèi)徑的毛細(xì)管中采用溶膠-凝膠法制作雙柱塞，雙柱塞中間填入3-10毫米長的C8或C18填料。
[0009]本發(fā)明中，所述細(xì)胞酶解液配方為:在分散于PBS緩沖液中的細(xì)胞液內(nèi)加入20-100mM的碳酸氫銨，50-500mM的鹽酸胍，l_10ng/^L的胰蛋白酶。
[0010]本發(fā)明采用十通閥構(gòu)建系統(tǒng)切換流路，將細(xì)胞直接注入切換系統(tǒng)的微反應(yīng)通道中，經(jīng)過酶解將肽段切換富集在捕集柱上，除鹽純化，再經(jīng)切換，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析。由于使用了在線系統(tǒng)，細(xì)胞的引入、酶解、捕集、除鹽等步驟可自動完成，大大降低了微量樣品的損失。
[0011]本發(fā)明自動化分析系統(tǒng)對少量細(xì)胞的樣品能夠鑒定到較多種類的蛋白，對揭示某些低含量細(xì)胞(如循環(huán)腫瘤細(xì)胞)的蛋白質(zhì)組信息具有重要作用，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。例如本發(fā)明的自動化系統(tǒng)用于對100個DLD-1結(jié)腸癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)組檢測，單次平均鑒定到446個蛋白，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)共鑒定到714個蛋白，其中包括腫瘤特異性蛋白和17%左右的膜蛋白。本發(fā)明對于揭示微量細(xì)胞的蛋白質(zhì)組信息具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為自動化分析系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖(為閥的一種切換方式)。
[0013]圖2為自動化分析系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖(為閥的另一種切換方式)。
[0014]圖3為酶解反應(yīng)進(jìn)行程度的考察圖。通道I是沒有加trypsin的細(xì)胞樣品，通道2到5依次代表酶解0.5h，lh, 2h和4h的細(xì)胞樣品，樣品跑SDS-PAGE膠并進(jìn)行銀染，如果在蛋白相應(yīng)分子量區(qū)域看到條帶，表示有蛋白質(zhì)存在。由圖可以判斷2小時細(xì)胞得到完全酶解。
[0015]圖中標(biāo)號:I為十通閥第一位置，2為十通閥第二位置，3為十通閥第三位置，4為十通閥第四位置，5為十通閥第五位置，6為十通閥第六位置，7為十通閥第七位置，8為十通閥第八位置，9為十通閥第九位置，10為十通閥第十位置。

【具體實(shí)施方式】
[0016]通過實(shí)施例對本發(fā)明提供的自動化分析系統(tǒng)在微量癌細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析中的應(yīng)用作出進(jìn)一步說明。
[0017]實(shí)施例1自動化分析系統(tǒng)的構(gòu)建
裝置中的十通閥第一位置I與20yL的注射針相連，并且由可以精切控制推或拉的體積的注射泵控制。第二位置2與一根1cm長、250 μ m內(nèi)徑的毛細(xì)管相連，作為細(xì)胞與酶混合溶液的進(jìn)口。第三位置3和第十位置10之間連著一根16cm長、250 μ m內(nèi)徑的毛細(xì)管，作為細(xì)胞的酶解樣品環(huán)，體積為8 μ Lo第四位置4和第七位置7之間連著一根C18捕集柱，制作方法簡要地說，在一根1cm長、75 μ m內(nèi)徑的毛細(xì)管一端用溶膠_凝膠法制作柱塞，然后填入Icm長的C18填料并活化。第五位置5與超高壓二元液相泵相連。第六位置6與15cm長、75 μπι內(nèi)徑的毛細(xì)管反相柱(5 μπι, ΙΟΟΑ)相連，并進(jìn)而連接到Q-Exactive質(zhì)譜儀。第八位置8與通向廢液的出口相連。第九位置9與液相泵系統(tǒng)中的上樣泵相連。
[0018]實(shí)施例2細(xì)胞與酶混合溶液的配制
把人結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1培養(yǎng)收集之后，用PBS稀釋成40個/^L的濃度，加入50mM碳酸氫銨、200mM鹽酸胍和5ng/^L胰蛋白酶后配制成細(xì)胞酶解液，精確計(jì)數(shù)，并且根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果確定進(jìn)樣體積。
[0019]實(shí)施例3細(xì)胞的在線酶解
使用注射泵將細(xì)胞酶解液吸入十通閥上的樣品環(huán)內(nèi)，切換閥的位置，使樣品環(huán)兩端封閉，置于50°C的柱溫箱2小時，期間對樣品環(huán)超聲振蕩若干次，完成酶解。
[0020]實(shí)施例4肽段的捕集與除鹽
切換閥的位置，樣品環(huán)一端與泵相連，一端與捕集柱相連，通過泵的推動，將肽段富集在C18捕集柱上，并進(jìn)行除鹽純化。
[0021]實(shí)施例5液相色譜-質(zhì)譜分析
切換閥的位置，使用液相泵的梯度將肽段逐步洗脫，在15cm長、75微米內(nèi)徑的毛細(xì)管反相色譜柱上分離，并且使用Q-Exactive質(zhì)譜儀檢測，使用MaxQuant軟件檢索蛋白質(zhì)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于100個以內(nèi)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組自動化分析系統(tǒng)，其特征在于，以一個可切換的十通閥為中心，與注射泵、多元梯度泵、質(zhì)譜儀、上樣泵、毛細(xì)管道連接組成；十通閥的內(nèi)部通道直徑為50-250微米；其中，十通閥的第一位置與注射針及注射泵連接，第二位置與毛細(xì)管連接作為完整細(xì)胞與酶混合溶液的進(jìn)液口，第三位置和第十位置之間連接體積為1-5微升的毛細(xì)管，作為細(xì)胞的酶解樣品環(huán)；第位置四和第位置七之間連接肽段的捕集柱；第位置五連接液相色譜的多元梯度泵；第位置六連接質(zhì)譜儀；第位置八連接廢液出口 ；第位置九連接上樣泵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)組自動化分析系統(tǒng)，其特征在于，所述的肽段捕集柱的結(jié)構(gòu)為:在5-20cm長、20-75微米內(nèi)徑的毛細(xì)管中采用溶膠-凝膠法制作雙柱塞，雙柱塞中間填入3-10毫米長的C8或C18填料。
3.一種基于權(quán)利要求1或2所述自動化分析系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組分析方法，其特征在于具體步驟如下: (1)把細(xì)胞培養(yǎng)收集之后，用PBS稀釋成10-100個/^L的濃度，加入碳酸氫銨、鹽酸胍和胰蛋白酶后配制成細(xì)胞酶解液，精確計(jì)數(shù)，并且根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果確定進(jìn)樣體積； (2)使用注射泵將細(xì)胞酶解液吸入十通閥上的樣品環(huán)內(nèi)，切換十通閥的位置，使樣品環(huán)兩端封閉，置于柱溫箱或水浴中，37°C?50°C的溫度下保持I?4小時；期間對樣品環(huán)超聲振蕩若干次，完成酶解； (3)切換十通閥的位置，使樣品環(huán)一端與上樣泵相連，一端與捕集柱相連，通過上樣泵的推動，將肽段富集在捕集柱上，并進(jìn)行除鹽純化； (4)切換十通閥的位置，利用多元梯度泵的梯度將肽段逐步洗脫，在毛細(xì)管反相色譜柱上分離，并且使用質(zhì)譜儀完成對肽段的檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)組分析方法，其特征在于所述細(xì)胞酶解液配方為:在分散于PBS緩沖液中的細(xì)胞液內(nèi)加入20-100mM的碳酸氫銨，50-500mM的鹽酸胍，l_10ng/^L的胰蛋白酶。
【文檔編號】G01N30/89GK104483434SQ201410702227
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月29日
【發(fā)明者】張祥民, 陳奇, 晏國全 申請人:復(fù)旦大學(xué)