一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法，它是聯(lián)合胞內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解牛皮明膠，采用HPLC-LTQOrbitrapMS鑒定牛皮明膠的特征性質(zhì)譜峰，通過(guò)胰蛋白酶催化H218O對(duì)牛皮明膠酶解多肽進(jìn)行標(biāo)記，借助HPLC-LTQOrbitrapMS檢測(cè)18O標(biāo)記前后的特征峰峰面積，準(zhǔn)確計(jì)算牛皮明膠添加量。本發(fā)明的有益效果：1、聯(lián)合胞內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解牛皮明膠，可有效增強(qiáng)酶解效果，提高牛皮明膠特征峰的檢出率；2、LTQOrbitrapMS具有非常高的分辨率，可保證定量檢測(cè)的誤差低于10%；3、利用胰蛋白酶催化18O標(biāo)記和HPLC-LTQOrbitrapMS檢測(cè)，能準(zhǔn)確定量檢測(cè)食品中的牛皮明膠添加量，可為相關(guān)部門(mén)監(jiān)控食品提供依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)牛皮明膠的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 明膠具有凝膠性、乳化性、起泡性、成膜性等多種功能特性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī) 藥、照相等領(lǐng)域。目前，商業(yè)上大約95%的明膠來(lái)源于哺乳動(dòng)物，如豬皮、牛皮。然而，瘋牛 病的傳播使得消費(fèi)者對(duì)購(gòu)買(mǎi)牛皮明膠的相關(guān)商品產(chǎn)生了一定顧慮，而且印度教徒不食用與 牛相關(guān)的食物，因此，需要尋找一種能夠定量檢測(cè)牛皮明膠的方法。
[0003] 本發(fā)明聯(lián)合胞內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解牛皮明膠，采用高效液相色譜-LTQ Orbitrap質(zhì)譜（HPLC-LTQ Orbitrap MS)鑒定牛皮明膠的特征性質(zhì)譜峰，通過(guò)胰蛋白酶催 化H218O對(duì)牛皮明膠酶解多肽進(jìn)行標(biāo)記，借助HPLC-LTQ Orbitrap MS得到的特征峰峰面積， 準(zhǔn)確計(jì)算牛皮明膠添加量。本發(fā)明采用HPLC-LTQ Orbitrap MS和胰蛋白酶催化的18O標(biāo)記 對(duì)牛皮明膠進(jìn)行定量檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外未有文獻(xiàn)進(jìn)行相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在提供一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法，以牛皮明膠為對(duì)象，采用胞內(nèi)蛋 白酶LyS-C和胰蛋白酶酶解、胰蛋白酶催化18O標(biāo)記、HPLC-LTQ Orbitrap MS檢測(cè)，有效確 定食品中牛皮明膠的添加量。
[0005] 其具體工藝方案如下： 1、牛皮明膠酶解 (1) 加入碳酸氫氨溶液配制牛皮明膠溶液：用10-100 mM的碳酸氫氨溶液溶解得到 0? 1-10 mg/ml的牛皮明膠溶液； (2) 加入胞內(nèi)蛋白酶Lys-C，使牛皮明膠酶解：胞內(nèi)蛋白酶和牛皮明膠質(zhì)量比mg/mg為 1:200-1:10,酶解溫度為20-50 °C，反應(yīng)時(shí)間為1-24 h; (3) 加入胰蛋白酶使牛皮明膠酶解：胰蛋白酶和牛皮明膠質(zhì)量比mg/mg為 1:200-1:10,酶解溫度為15-50 °C，反應(yīng)時(shí)間為4-30 h。
[0006] 2、同位素標(biāo)記 (1) 加酶：將胰蛋白酶加入經(jīng)胞內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解的牛皮明膠水解物中， 胰蛋白酶和牛皮明膠質(zhì)量比mg/mg為1:100-1:1 ; (2) 凍干：凍干溫度為-30至-80°C，凍干時(shí)間為2-24h; (3) 進(jìn)一步去除水分：加入20-200 色譜乙腈，常溫下真空干燥10-60min去除殘余 的水分和乙腈； (4) 標(biāo)記：一份牛皮明膠酶解物中加入H216O,另一份牛皮明膠酶解物中加入H2 18O,進(jìn) 行標(biāo)記，H216O或H218O與牛皮明膠酶解物的質(zhì)量比mg/mg為10:1-100:1，標(biāo)記所需溫度為 10-60°C，時(shí)間為 3-48h。
[0007] 3、HPLC-LTQ Orbitrap MS 檢測(cè) (1) 將標(biāo)記物和未標(biāo)記物混合：以H218O標(biāo)記的牛皮明膠水解物為內(nèi)標(biāo)，與H2 16O標(biāo)記的 牛皮明膠水解物按照1:50-50:1混合； (2) 上樣檢測(cè)：將混合樣品注射進(jìn)入HPLC-LTQ Orbitrap MS設(shè)備，檢測(cè)牛皮明膠酶解 物中H216O標(biāo)記的特征峰和H218O標(biāo)記的特征峰，上樣量為0. 5-20 ii g。
[0008] 4、數(shù)據(jù)分析 (1) 根據(jù)氨基酸序列，尋找牛皮明膠的特征峰； (2) 分析并記錄特征峰在標(biāo)記前后的峰面積； (3) 定量方法的準(zhǔn)確性分析，即通過(guò)比較標(biāo)記物/未標(biāo)記物即180/160的計(jì)算值與實(shí)際 混合比例檢驗(yàn)定量方法的準(zhǔn)確性，18CV16O按照如下公式計(jì)算：

【權(quán)利要求】
1. 一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法，其特征是： A、 牛皮明膠酶解 (1) 加入碳酸氫氨溶液配制牛皮明膠溶液； (2) 加入胞內(nèi)蛋白酶Lys-C，使牛皮明膠酶解； (3) 再加入胰蛋白酶使牛皮明膠酶解； B、 同位素標(biāo)記 (1) 加酶：將胰蛋白酶加入經(jīng)胞內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解的牛皮明膠水解物 中； (2) 凍干； (3) 進(jìn)一步去除水分； (4) 標(biāo)記：一份牛皮明膠酶解物中加入H216O,另一份牛皮明膠酶解物中加入H2 18O,進(jìn)行 標(biāo)記； C、 HPLC-LTQ Orbitrap MS 檢測(cè) (1) 將標(biāo)記物和未標(biāo)記物混合； (2) 上樣檢測(cè)：將混合樣品注射進(jìn)入HPLC-LTQ Orbitrap MS設(shè)備，檢測(cè)牛皮明膠酶解 物中H216O標(biāo)記的特征峰和H218O標(biāo)記的特征峰，上樣量為0. 5-20 g ; D、 數(shù)據(jù)分析 (1) 根據(jù)氨基酸序列，尋找牛皮明膠的特征峰； (2) 分析并記錄特征峰在標(biāo)記前后的峰面積； (3) 定量方法的準(zhǔn)確性分析，即通過(guò)比較標(biāo)記物/未標(biāo)記物即180/160的計(jì)算值與實(shí)際 混合比例檢驗(yàn)定量方法的準(zhǔn)確性，18CV16O按照如下公式計(jì)算：
其中，Itl, I2和I4分別代表未標(biāo)記即16O的特征肽在實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的單一同位素峰面積， 質(zhì)量高2Da的峰面積和質(zhì)量高4Da的峰面積；Mtl, M2和M4分別代表未標(biāo)記即16O的特征肽 在理論上的單一同位素峰面積，質(zhì)量高2Da的峰面積和質(zhì)量高4Da的峰面積。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法，其特征是： 所述牛皮明膠溶液的配比中加入10 mM的碳酸氫氨溶液溶解得到I mg/ml的牛皮明膠 溶液； 所述加入胞內(nèi)蛋白酶酶解時(shí)，胞內(nèi)蛋白酶與牛皮明膠質(zhì)量比mg/mg為1:100,酶解溫 度為37 °C，反應(yīng)時(shí)間為4 h; 所述再加入胰蛋白酶酶解時(shí)，胰蛋白酶和牛皮明膠質(zhì)量比mg/mg為1:50,酶解溫度為 37 °C，反應(yīng)時(shí)間為12 h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法，其特征是： 所述同位素標(biāo)記中胰蛋白酶和牛皮明膠質(zhì)量比為1:100-1:1 ; 所述凍干溫度為-30至_80°C，凍干時(shí)間為2-24h; 所述進(jìn)一步去除水分的條件是：加入20-200 iU色譜乙腈，常溫下真空干燥 l〇-60min ； 所述標(biāo)記中H216O或H218O與牛皮明膠酶解物的質(zhì)量比為10:1-100:1，標(biāo)記所需溫度為 10-60°C，時(shí)間為 3-48h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法，其特征在 于：未標(biāo)記時(shí)，胞內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶處理后的牛皮明膠酶解物中特征峰為 591. 79742-591. 83742+，相應(yīng)的氨基酸序列為EGPVGL*PGIDGR，其中*表示P被羥基化，經(jīng)18O 標(biāo)記后，特征峰的質(zhì)荷比變成59 3 . 79 742+_59 3 . 8 3 742+'氨基酸序列EGPVGL*PGIDGR中R的羧 基末端兩個(gè)16O原子被18O代替。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法，其特征在 于：未標(biāo)記時(shí)，胞內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶處理后的牛皮明膠酶解物中特征峰為 634. 32972-634. 36972+，相應(yīng)的氨基酸序列為GI*PGPVGAAGATGAR，其中*表示P被羥基化，經(jīng)18O標(biāo)記后，特征峰的質(zhì)荷比變成636. 32972-636. 36972+，氨基酸序列GI*PGPVGAAGATGAR中 R的羧基末端兩個(gè)16O原子被18O代替。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法，其特征在 于：未標(biāo)記時(shí)，胞內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶處理后的牛皮明膠酶解物中特征峰為 714. 35762-714. 39762+，相應(yīng)的氨基酸序列為GI*PGEFGL*PGPAGAR，其中*表示P被羥基化， 經(jīng)18O標(biāo)記后，特征峰的質(zhì)荷比變成716. 35762-716. 39762+'氨基酸序列GI*PGEFGL*PGPAGAR 中R的羧基末端兩個(gè)16O原子被18O代替。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法，其特征在 于：未標(biāo)記時(shí)，胞內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶處理后的牛皮明膠酶解物中特征峰為 780 . 90 1 02-780 . 94 1 02+，相應(yīng)的氨基酸序列為GETGPAGPAGPIGPVGAR，經(jīng)18O標(biāo)記后，特征峰的 質(zhì)荷比變成7 8 2 . 90 1 02-78 2 . 94 1 02+'氨基酸序列GETGPAGPAGPIGPVGAR中R的羧基末端兩個(gè) 16O原子被18O代替。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法，其特征在 于：未標(biāo)記時(shí)，胞內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶處理后的牛皮明膠酶解物中特征峰 為790. 87712-790. 91712+，相應(yīng)的氨基酸序列為GP*PGESGAAGPTGPIGSR，其中*表示 P被羥基化，經(jīng)18O標(biāo)記后，特征峰的質(zhì)荷比變成792.87712+_792.9171 2+'氨基酸序列 GP*PGESGAAGPTGPIGSR中R的羧基末端兩個(gè)16O原子被18O代替。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種牛皮明膠的定量檢測(cè)方法，其特征在 于：未標(biāo)記時(shí)，胞內(nèi)蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶處理后的牛皮明膠酶解物中特征峰為 923. 44312-923. 48312+，相應(yīng)的氨基酸序列為 TG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK，其中 * 表 示P被羥基化，經(jīng)18O標(biāo)記后，特征峰的質(zhì)荷比變成925. 44312-925. 48312+'氨基酸序列 TG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK中K的羧基末端兩個(gè)16O原子被18O代替。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104360002SQ201410718859
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】涂宗財(cái), 沙小梅, 肖輝, 王輝, 段鄧樂(lè), 陳媛, 劉光憲 申請(qǐng)人:江西師范大學(xué)