一種基于葉片微結(jié)構(gòu)變化的番茄鉀養(yǎng)分水平診斷方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于葉片微結(jié)構(gòu)變化的番茄鉀養(yǎng)分水平診斷方法，基于葉片微結(jié)構(gòu)診斷番茄鉀養(yǎng)分水平。首先借助掃描電子顯微系統(tǒng)和透射電子顯微系統(tǒng)采集番茄葉片的顯微結(jié)構(gòu)圖像和超微結(jié)構(gòu)圖像；然后從圖像中提取葉片表面氣孔大小和密度、表面絨毛高度和密度、表面維管束密度，葉片斷面海綿組織厚度、柵欄組織厚度和整個葉片厚度，以及葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)在不同鉀養(yǎng)分條件下的特征，并加以表征和統(tǒng)計分析；依此提出番茄鉀養(yǎng)分水平診斷方法。本發(fā)明可盡早地診斷番茄鉀養(yǎng)分信息，可應(yīng)用于設(shè)施番茄鉀養(yǎng)分水平的檢測。
【專利說明】一種基于葉片微結(jié)構(gòu)變化的番茄鉀養(yǎng)分水平診斷方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種診斷作物鉀養(yǎng)分水平的方法，具體是一種基于葉片微結(jié)構(gòu)變化的 番茄鉀營養(yǎng)水平診斷方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來我國設(shè)施農(nóng)業(yè)有了很快發(fā)展，但設(shè)施栽培中經(jīng)常會出現(xiàn)氮、磷、鉀營養(yǎng)元素 比例失調(diào)和缺素癥狀，同時有的地方又存在施肥過量的現(xiàn)象，直接影響作物的生理過程和 整體的生態(tài)環(huán)境。因此，迫切需要對作物生長過程中的養(yǎng)分進行精確管理。作物養(yǎng)分的早 期、高精度檢測是實現(xiàn)養(yǎng)分精確管理的必要前提?，F(xiàn)階段我國設(shè)施作物養(yǎng)分早期檢測技術(shù) 能精確測量氮營養(yǎng)水平，磷的檢測精度也有所提高，但對鉀營養(yǎng)水平的檢測機理還不成熟。 因此，需要探索一種用于作物鉀養(yǎng)分水平的檢測方法。
[0003] 植物營養(yǎng)學(xué)的研究已經(jīng)證明，葉片作為植物的營養(yǎng)器官，其生長發(fā)育狀態(tài)直接受 養(yǎng)分供給的影響。營養(yǎng)水平變化影響植物正常代謝活動，引起植物葉片內(nèi)活性物質(zhì)、霉、蛋 白質(zhì)等的變化，造成葉片組織細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞排列以及細(xì)胞內(nèi)含物等一系列微觀結(jié)構(gòu)信息 變化，當(dāng)這些微觀變化積累到一定程度才會最終引起葉片顏色、大小等宏觀特征的變化。因 此，可以通過觀測葉片的微觀結(jié)構(gòu)特征變化，對番茄的鉀養(yǎng)分水平進行早期診斷。
[0004] 掃描電子顯微技術(shù)能提供樣本表面微結(jié)構(gòu)高分辨形貌圖像，透射電子顯微技術(shù)能 提供樣本內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)信息。掃描電子顯微技術(shù)和透射電子顯微技術(shù)最初是用于工程材料 表面和內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)的研究，近年來用于植物器官表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的研究。未見利用掃描 電子顯微技術(shù)和透射電子顯微技術(shù)進行作物鉀養(yǎng)分水平的檢測。
[0005] 現(xiàn)有檢測作物養(yǎng)分信息的方法主要有：圖像技術(shù)、光譜技術(shù)。圖像技術(shù)能測量的顏 色、紋理、形態(tài)等特征，這些特征只有在作物出現(xiàn)營養(yǎng)脅迫病癥后才顯現(xiàn)，而缺素早期，這些 癥狀并不明顯；光譜技術(shù)對鉀養(yǎng)分水平的檢測機理仍處于探索之中。本方法從微觀尺度出 發(fā)，尋找因鉀養(yǎng)分水平不同而造成的葉片微結(jié)構(gòu)差異，依此作為鉀養(yǎng)分水平的檢測依據(jù)。既 解決了光譜技術(shù)對鉀養(yǎng)分水平檢測機理不成熟的問題，又能實現(xiàn)作物的鉀養(yǎng)分水平的早期 診斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種基于葉片微結(jié)構(gòu)變化的番茄鉀養(yǎng)分水平診斷方法，以實 現(xiàn)番茄鉀養(yǎng)分狀況的早期診斷。
[0007] 為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明利用掃描電子顯微技術(shù)和透射電子顯微技術(shù)，采 集不同鉀養(yǎng)分條件下番茄葉片表面、斷面微觀結(jié)構(gòu)信息和葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)信息，并進行 特征提取和表達，確定能夠表征植株鉀營養(yǎng)水平的微觀結(jié)構(gòu)特征量；提供基于微結(jié)構(gòu)信息 設(shè)施番茄鉀營養(yǎng)水平檢測方法，具體技術(shù)方案如下： 一種基于葉片微結(jié)構(gòu)變化的番茄鉀養(yǎng)分水平診斷方法，其特征在于按照下述步驟進 行： 步驟一，取同一水平下的番茄葉片分成兩組，為葉片A和葉片B; 步驟二，獲取葉片A的表面微結(jié)構(gòu)和葉片A的斷面微結(jié)構(gòu)特征；所述微結(jié)構(gòu)特征包括表 面氣孔大小和密度、表面絨毛密度和高度、表面維管束密度；所述斷面微結(jié)構(gòu)特征包括海綿 組織厚度、柵欄組織厚度； 步驟三，獲取所述葉片A葉肉細(xì)胞里的葉綠體超微結(jié)構(gòu)特征； 步驟四，提取和表征葉片A的表面微結(jié)構(gòu)特征、斷面微結(jié)構(gòu)特征和葉綠體超微結(jié)構(gòu)特 征； 步驟五，用硫酸消注葉片B、過濾、收集濾液，分析并測定葉片B中鉀的總含量； 步驟六，分析葉片A表面微結(jié)構(gòu)、斷面微結(jié)構(gòu)和葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)對葉片B中鉀的總含 量的響應(yīng)特征；選取區(qū)分度最大的葉片A微結(jié)構(gòu)特征組合，作為葉片A微結(jié)構(gòu)對鉀養(yǎng)分水平 的響應(yīng)特征； 步驟七，根據(jù)鉀養(yǎng)分水平和微結(jié)構(gòu)響應(yīng)特征之間的關(guān)系，提出診斷依據(jù)：當(dāng)表面絨毛密 度和高度降低、表面維管束密度降低且葉綠體結(jié)構(gòu)變松散時，則診斷為番茄植株缺鉀；當(dāng)檢 測到表面氣孔尺寸變大、表面絨毛密度和維管束密度增加，葉綠體內(nèi)部淀粉粒增加時，則診 斷為番爺植株鉀過量。
[0008] 所述步驟二具體為：利用掃描電子顯微系統(tǒng)采集葉片A表面微結(jié)構(gòu)特征和斷面微 結(jié)構(gòu)特征。
[0009] 所述步驟三具體為：利用透射電子顯微系統(tǒng)獲取葉片A的葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特 征，主要是葉綠體的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。
[0010] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：1)本發(fā)明借助掃描電子顯微（SEM)技術(shù)和透射電子顯微 (TEM)技術(shù)，可以得到不同鉀營養(yǎng)水平條件下，番茄葉片的微觀結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)圖像；2)本 發(fā)明從微觀尺度出發(fā)，探求鉀養(yǎng)分對溫室番茄微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)變化的作用機理，可以充 分挖掘葉片微結(jié)構(gòu)信息中所蘊含的作物鉀營養(yǎng)水平信息；3)本發(fā)明通過鉀養(yǎng)分和葉片微觀 結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系，可以突破現(xiàn)有檢測機理不成熟的局限，尋求新的檢測機理；4)本發(fā)明 提供了基于葉片微結(jié)構(gòu)特征的番茄鉀養(yǎng)分水平診斷方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖ι-a、圖ι-b和圖I-C為不同鉀營養(yǎng)水平對番茄葉片斷面微結(jié)構(gòu)的影響： 圖Ι-a為缺鉀組，鉀營養(yǎng)水平為25% ; 圖Ι-b為對照組，鉀營養(yǎng)水平為100% ; 圖1-c為鉀過量組，鉀營養(yǎng)水平為150% ; 圖2-a、圖2-b和圖2-c為不同鉀營養(yǎng)水平對番茄葉片表面微結(jié)構(gòu)的影響：圖2-a為缺 鉀組，鉀營養(yǎng)水平為25%; 圖2-b為對照組，鉀營養(yǎng)水平為100% ; 圖2-c為鉀過量組，鉀營養(yǎng)水平為150% ; 圖3-a、圖3-b和圖3-c為不同鉀營養(yǎng)水平對番茄葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響：圖3-a為 缺鉀組，鉀營養(yǎng)水平為25% ; 圖3-b為對照組，鉀營養(yǎng)水平為100% ; 圖3-c為鉀過量組，鉀營養(yǎng)水平為150%。

【具體實施方式】
[0012] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步詳細(xì)描述。
[0013] 本發(fā)明【具體實施方式】中所采用的掃描電子顯微鏡系統(tǒng)是由美國Fei公司生產(chǎn)的 quanta200型，利用掃描電子顯微系統(tǒng)中的顯微圖像采集系統(tǒng)采集溫室番茄葉片的表面和 斷面微觀結(jié)構(gòu)。本發(fā)明【具體實施方式】中所采用的透射電子顯微鏡系統(tǒng)是由日本電子公司生 產(chǎn)的jemlOlO型，利用透射電子顯微系統(tǒng)中的圖像采集系統(tǒng)采集番茄葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)信 息。本發(fā)明于2012年8月至2014年10月在江蘇大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點實 驗室玻璃溫室中進行實驗，番茄品種選用粉霞。為保證前期的基礎(chǔ)性研究能夠?qū)Ψ佯B(yǎng)分 的有效特征進行準(zhǔn)確提取，本發(fā)明采用無土栽培方式進行樣本培育，采用山崎培方營養(yǎng)液 進行澆灌。為了保證樣本的代表性，對每個營養(yǎng)水平植株的倒七葉進行取樣。
[0014] 40天后劃分不同的鉀養(yǎng)分水平試驗區(qū)，在各試驗區(qū)定時定量澆灌不同鉀離子濃 度的營養(yǎng)液。設(shè)置〇. 25K，1K，1.5K等3個施鉀水平，形成缺鉀、適量、鉀過量3個水平。每 個水平取樣10片，分成A、B兩組，A組用于微結(jié)構(gòu)測量，A組葉片取樣后立即放入戊二醛固 定液中進行固定，以保證葉片微結(jié)構(gòu)特征跟活體狀態(tài)保持一致。B組用于常規(guī)化學(xué)鉀含量測 量。每個處理3個重復(fù)。
[0015] (1)掃描電鏡樣品制備 葉片A經(jīng)乙醇階梯脫水后，放入由英國Quorum公司生產(chǎn)的Κ850型臨界點干燥儀中進 行干燥處理，將制備好的樣品粘在導(dǎo)電膠上，放入由日本SHINKKU VD公司生產(chǎn)的MSP-IS 型離子濺射儀中進行鍍膜，濺射金屬厚度為20nm，然后將其粘貼在掃描電鏡樣品臺上，在 15kV加速電壓下進行觀察，拍照。
[0016] (2)透射電鏡樣品制備 將經(jīng)過初固定處理的材料，再依次進行如下處理：①洗滌：用PH值為7. 0的磷酸緩沖 液洗滌3次，每次30min。②)固定：將材料轉(zhuǎn)移到1%鋨酸中，4°C下過夜進行后固定。③洗 滌：用磷酸緩沖液洗滌3次，每次30min ;④脫水：用30%、50%、70%、90%和100%的乙醇分別 進行脫水，每次15min。⑤浸透：分別用不同比例環(huán)氧丙烷與包埋劑(先后依次為3: 1、1: 1、 1:3)進行浸透，浸透時間2、4、4h，最后在純Epon812包埋劑中過夜。⑥包埋：用包埋劑進 行包埋，并在恒溫箱內(nèi)進行加溫聚合。⑦切片、染色、電鏡觀察：在德國Leica公司生產(chǎn)的 EMUC7型超薄切片機上進行切片，經(jīng)過雙染色后在日本電子公司生產(chǎn)的jemlOlO型透射電 子顯微鏡下觀察拍照。
[0017] (3)觀察葉片斷面微結(jié)構(gòu) 在掃描電子顯微鏡下觀察不同鉀水平條件下葉片斷面，測量表皮厚度、柵欄組織厚度、 海綿組織厚度和整個葉片厚度。選取典型視野進行拍照。每個樣本電鏡觀察統(tǒng)計至少10 個視野，取平均值。
[0018] 葉片斷面顯微觀察發(fā)現(xiàn)：正常水平下，番茄葉片厚度為123. 23±2.5um，其中海綿 組織厚度為69. 15±6· 5um，柵欄組織厚度為49. 87±L 3um，如圖Ι-a所示；缺鉀時葉片厚度 為108±L 32um，，海綿組織厚度為42. 32±0· 37um，柵欄組織厚度為53. 76±0· 34um，如圖 Ι-b所示。鉀過量時，葉片組織厚度112. 45±2. 48um，海綿組織厚度59. 32±1. 16um，柵欄組 織厚度為50. 43±1.24um，如圖1-c所示。
[0019] (4)觀察葉片表面微結(jié)構(gòu) 在掃描電子顯微鏡下觀察不同鉀養(yǎng)分水平下葉片表面氣孔、表面絨毛、表面維管束變 化，測量氣孔密度和大小、絨毛密度和絨毛高度、維管束密度。選取幾個有代表性的視野拍 照。每個樣本電鏡觀察統(tǒng)計至少10個視野，取平均值。
[0020] 對葉片表面的顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，與正常水平下，葉片表面3 X KT4mm2的范圍 內(nèi)氣孔平均數(shù)量為14. 5±0. 8個，氣孔大小為16. 82±0. 32um，表面分布著錐形和蘑菇形絨 毛，但以錐形為主，能看到突起在葉片表面的維管束，如圖2-a所示。缺鉀會引起葉片表面 氣孔數(shù)量和氣孔尺寸的減小，同時也會使維管束的突起不明顯，同樣大小的面積內(nèi)氣孔密 度為13. 2±0. 5個，氣孔大小為13. 48±0. 57 um ;表面絨毛數(shù)量較少，絨毛基本為錐形為 主，維管束突起不明顯，如圖2-b所示。鉀過量時，表面氣孔增大，同樣大小的面積內(nèi)氣孔密 度為14. 9±0. 3個，氣孔大小為18. 42±0. 57 um，表面絨毛增多，表面維管束增加，如圖2-c 所示。
[0021] (5)葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 在透射電子顯微鏡下觀察不同鉀養(yǎng)分水平條件下，葉片葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化情況， 選取有代表性的視野拍照。
[0022] 對葉肉細(xì)胞內(nèi)葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，正常葉片中葉綠體外形較規(guī)則，呈梭 形或圓形，緊貼細(xì)胞壁分布，葉綠體基質(zhì)中有少量嗜鋨顆粒和一定數(shù)量的淀粉粒，部分葉綠 體邊緣模糊呈現(xiàn)老化現(xiàn)象，如圖3_a所示。缺鉀時，葉綠體外形不規(guī)則，葉綠體內(nèi)部基粒片 層變模糊、松散，部分葉綠體解體，葉綠體內(nèi)部存在少量淀粉粒和嗜鋨顆粒，圖3_b所示。鉀 過量時，細(xì)胞壁變厚，葉綠體內(nèi)部存在大量的淀粉粒，圖3-c所示。
[0023] (6)測定樣本葉片鉀的總量 用硫酸消注葉片樣本，加雙氧水以加速有機物質(zhì)的氧化與破環(huán)，室溫下振蕩30min，過 濾，收集濾液，采用AA3型流動分析儀對葉片組織內(nèi)的總鉀進行測定。
[0024] (7)分析葉片微結(jié)構(gòu)對鉀營養(yǎng)水平的響應(yīng)特征； 不同鉀營養(yǎng)水平條件下，葉片微結(jié)構(gòu)差異主要體現(xiàn)在：=葉片表面氣孔大小和密度、 表面絨毛高度和密度、維管束密度；+f海綿組織厚度、柵欄組織厚度和葉片厚度；f葉肉細(xì) 胞里葉綠體超微結(jié)構(gòu)。
[0025] 缺鉀時，葉片表面絨毛密度和高度降低，維管束密度降低，海綿組織細(xì)胞斷面呈圓 形且細(xì)胞間隙變大，葉綠體結(jié)構(gòu)變松散；鉀過量時，氣孔尺寸增大、絨毛密度和維管束數(shù)量 增加，葉綠體內(nèi)部淀粉粒增加。
[0026] (8)提出適合番茄鉀養(yǎng)分水平早期診斷方法。
[0027] 表面絨毛密度和高度降低，維管束密度降低，葉綠體結(jié)構(gòu)變松散可以作為缺鉀的 診斷依據(jù)。表面氣孔尺寸、絨毛密度和維管束數(shù)量的增加，葉綠體內(nèi)部淀粉粒明顯增加可以 作為鉀過量的診斷依據(jù)。
【權(quán)利要求】
1. 一種基于葉片微結(jié)構(gòu)變化的番茄鉀養(yǎng)分水平診斷方法，其特征在于按照下述步驟進 行： 步驟一，取同一水平下的番茄葉片分成兩組，為葉片A和葉片B ; 步驟二，獲取葉片A的表面微結(jié)構(gòu)和葉片A的斷面微結(jié)構(gòu)特征；所述微結(jié)構(gòu)特征包括表 面氣孔大小和密度、表面絨毛密度和高度、表面維管束密度；所述斷面微結(jié)構(gòu)特征包括海綿 組織厚度、柵欄組織厚度和整個葉片A厚度； 步驟三，獲取所述葉片A葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征； 步驟四，提取和表征葉片A的表面微結(jié)構(gòu)特征、斷面微結(jié)構(gòu)特征和葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 特征； 步驟五，用硫酸消注葉片B、過濾、收集濾液，分析并測定葉片B中鉀的總含量； 步驟六，分析葉片A表面微結(jié)構(gòu)、斷面微結(jié)構(gòu)和葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)對葉片B中鉀的總含 量的響應(yīng)特征；選取區(qū)分度最大的葉片微結(jié)構(gòu)特征組合，作為葉片微結(jié)構(gòu)對鉀養(yǎng)分水平的 響應(yīng)特征； 步驟七，根據(jù)步驟六中鉀養(yǎng)分水平和微結(jié)構(gòu)響應(yīng)特征之間的關(guān)系，提出診斷依據(jù)：當(dāng)待 診斷葉片的表面絨毛密度和高度降低、表面維管束密度降低且葉綠體結(jié)構(gòu)變松散時，則診 斷為番茄植株缺鉀；當(dāng)檢測到表面氣孔尺寸變大、表面絨毛密度和維管束密度增加，葉綠體 內(nèi)部淀粉粒增加時，則診斷為番茄植株鉀過量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葉片微結(jié)構(gòu)變化的番茄鉀養(yǎng)分水平診斷方法，其特 征在于所述步驟二具體為：利用掃描電子顯微鏡采集葉片A表面微結(jié)構(gòu)特征和斷面微結(jié)構(gòu) 特征。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葉片微結(jié)構(gòu)變化的番茄鉀養(yǎng)分水平診斷方法，其特 征在于所述步驟三具體為：利用透射電子顯微鏡獲取葉片A的葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征，包 括葉綠體的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。
【文檔編號】G01N23/00GK104390979SQ201410719094
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】李青林, 毛罕平, 左志宇, 張曉東, 孫俊 申請人:江蘇大學(xué)