一種可視化自供能葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種操作簡單、低成本、自供能、可視化便攜式三維中空通道微流控紙芯片傳感器并成功用于現(xiàn)場檢測。該傳感器成功將生物燃料電池引入到三維中空通道微流控紙芯片上，利用生物燃料電池陰陽極對底物的催化效果自行產(chǎn)生電信號，擺脫對供能設(shè)備的限制。該傳感器的構(gòu)建過程如下：批量打印疏水圖案，熔蠟成型，利用激光切割機(jī)制備中空通道，然后絲網(wǎng)印刷電極，通過長金制備生物燃料電池的電極；制備合成三維石墨烯修飾電極；將葡萄糖氧化酶和漆酶分別修飾到生物燃料電池陽極和陰極；合成電致變色材料并均勻涂在ITO上，通過自制電路板將各個(gè)紙芯片單元夾住，連接到涂有電致變色材料的ITO上，加入葡萄糖溶液引發(fā)反應(yīng)，通過觀察電致變色材料顏色變化確定葡萄糖濃度范圍。
【專利說明】一種可視化自供能葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及葡萄糖半定量分析檢測領(lǐng)域，構(gòu)建了一種便攜式可視化自供能葡萄糖生物傳感器，采用中空通道微流控紙芯片為基底構(gòu)建生物燃料電池，以葡萄糖作為生物燃料電池的燃料，結(jié)合電致變色技術(shù)實(shí)現(xiàn)對葡萄糖的可視化檢測。

【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖是生命活動中不可缺少的物質(zhì)，它在人體內(nèi)能直接參與新陳代謝過程。葡萄糖是生命體的重要物質(zhì)，其在體液中的含量是反映身體狀況的重要指標(biāo)。尤其是對于糖尿病患者，其血糖濃度的測定是控制病情的重要手段，因此準(zhǔn)確、快速地測定血中葡萄糖的含量極為重要。長期以來，在研宄人員不斷的努力下，產(chǎn)生各式各樣的檢測原理。在已有檢測原理的基礎(chǔ)之上，人們又不斷尋求反應(yīng)時(shí)間更快，檢測時(shí)間更短，靈敏度更高的方法。
[0003]目前測定葡萄糖的方法主要有分光光度法、電化學(xué)法、旋光度法、高效液相色譜法及毛細(xì)管電泳法等。但是上述方法一起儀器比較昂貴、操作復(fù)雜，同時(shí)對能源有很強(qiáng)的依賴性，不利于隨時(shí)隨地的現(xiàn)場檢測，限制了其在當(dāng)前的應(yīng)用和發(fā)展。因此迫切需要開發(fā)一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快、成本低、檢測范圍廣的便攜式分析檢測方法來適應(yīng)形勢的發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種操作簡單、檢測速度快、成本低廉的自供能可視化檢測葡萄糖的方法。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過構(gòu)建一種新型的三維中空通道微流控紙芯片結(jié)合生物燃料電池來實(shí)現(xiàn)的葡萄糖生物傳感器，該葡萄糖生物傳感器的制備方法為:
(1)在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)三維中空通道微流控紙芯片的疏水蠟批量打印圖案，式樣如附圖1和2所示，該三維中空通道微流控紙芯片包括四個(gè)蠟打印疏水區(qū)域分別為A、B、C和D，A為陽極單元，B為中空通道單元，C為半親水通道單元，D為陰極單元，然后利用激光切割機(jī)對蠟批量打印圖案A、B和C進(jìn)行打孔切割，制備溶液入口、中空通道，并在設(shè)計(jì)的紙陽極區(qū)域和紙陰極區(qū)域分別印刷碳電極，式樣如附圖3所示；
(2)通過長金制備生物燃料電池紙電極；
(3)制備合成三維石墨烯修飾生物燃料電池陰極和陽極，用于在陽極上固定葡萄糖氧化酶，在陰極上固定漆酶，將制備好的生物燃料電池陰陽極保存在4°C備用；
(4)合成電致變色材料，均勻旋涂在氧化銦錫導(dǎo)電玻璃(ITO)上；
(5)如附圖4所示將構(gòu)建的葡萄糖生物傳感器A、B、C和D四個(gè)單元依次折疊，并用電路板夾住連接涂有電致變色材料的ITO導(dǎo)電玻璃上，然后加入葡萄糖溶液引發(fā)反應(yīng)，通過觀察涂在ITO上電致變色材料顏色變化，即可確定葡萄糖濃度范圍。
[0006]本發(fā)明所述的紙材料為普通濾紙、吸水紙或者色譜紙。
[0007]本發(fā)明所述三維中空通道微流控紙芯片制備過程如下:在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)三維中空通道微流控紙芯片的疏水蠟批量打印圖案，式樣如附圖1和2所示，該三維中空通道微流控紙芯片包括四個(gè)錯(cuò)打印疏水區(qū)域分別為A、B、C和D，A為陽極單元，B為中空通道單元，C為半親水通道單元，D為陰極單元，其中單個(gè)單元尺寸范圍為15mm-35mm，溶液入口尺寸范圍為3mm-5mm，通道寬度范圍為1.5mm-2.5mm，通道長度范圍為10mm-30mm，紙陽極和紙陰極直徑尺寸范圍為5mm-8mm，然后利用激光切割機(jī)對蠟批量打印圖案A、B和C進(jìn)行打孔切割，制備溶液入口、中空通道，并在設(shè)計(jì)的紙陽極區(qū)域和紙陰極區(qū)域分別印刷碳電極。
[0008]本發(fā)明所述通過長金制備生物燃料電池紙電極，包括以下步驟:金納米粒子的制備，將160mL水加熱到90°C，加入質(zhì)量濃度為1%的氯金酸1.6mL，升溫到96°C，保持I分鐘，加入質(zhì)量濃度為1%的檸檬酸鈉5.6mL，攪拌15分鐘，溶液變成酒紅色，室溫冷卻，制備得到金納米；長金制備生物燃料電池紙電極，將20 μ?金納米粒子滴加在紙陽極上，室溫條件下晾干，然后加入質(zhì)量濃度為1%的氯金酸和0.2Μ鹽酸羥胺混合溶液50 μ?滴加在紙電極上，在室溫條件下反應(yīng)10分鐘，然后用二次水沖洗，得到長金修飾的生物燃料電池長金紙電極。
[0009]本發(fā)明所述三維石墨烯制備過程包括以下步驟:三維石墨烯的合成利用732-型硫酸陽離子交換樹脂作為碳源，通過Ni2+-氫氧化鉀交換活化重組方法制備，首先將732-型硫酸陽離子交換樹脂浸泡在10mL 0.05Μ的醋酸鎳溶液中8h，用二次水沖洗交換樹脂60°C真空干燥，1g含有Ni2+的交換樹脂加入含有40g氫氧化鉀400mL乙醇溶液中在80°C攪拌直至溶液變成絮狀，然后室溫浸泡6h，隨后將混合液在70°C下干燥60h用粉碎機(jī)粉碎，最后將混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，850°C加熱2h，升溫速率為2°C /min，然后用IM的鹽酸腐蝕，離心二次水洗，最后60°C干燥制備得到三維石墨烯。
[0010]本發(fā)明所述紙基生物燃料電池陰極和陽極構(gòu)建包括以下步驟:首先將20 mg制備得到的三維石墨烯溶解到含有40 mg的3，4，9，10-茈四羧酸100 mL乙醇溶液中，超聲lh，然后繼續(xù)室溫?cái)嚢?2h，然后過濾依次用乙醇、二次水洗滌，最終60°C下真空干燥。然后將1mg 二環(huán)己基碳二亞胺在氮?dú)獗Ｗo(hù)下溶解到60mL 二甲基甲酰胺溶液中，然后將含有1mg修飾過的三維石墨烯的40mL 二甲基甲酰胺溶液加入到上述溶液中，加熱至40°C氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)48h，然后過濾，依次用二甲基甲酰胺、乙醇和二次水洗滌，60°C真空干燥。將Img制備得到的上述修飾過的三維石墨烯超聲溶于ImL乙醇中，取10 μ L上述溶液分別加入到長金的燃料電池陰極和陽極反應(yīng)30min，然后分別加入10 μ L 2mg/mL葡萄糖氧化酶溶液和Im/mL漆酶溶液到陽極和陰極上反應(yīng)2h，將制備得到的電極保存在40C冰箱中備用。
[0011]本發(fā)明所述電致變色材料合成包括以下步驟，反應(yīng)過程如附圖5所示:首先將
0.462g 4，4-二氨基-4-甲氧基三苯胺(A)、1.224g異氰尿酸三縮水甘油酯(B)溶于ImLN, N- 二甲基乙酰胺(DMAc)中，加熱至80°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)2h，隨后將溶液通過勻膠機(jī)均勻懸涂在ITO導(dǎo)電玻璃上，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下120°C加熱12h除去多余溶劑，然后分別在40°C、130°C和180°C下真空干燥3h、2h和3h，即制備得到電致變色材料。
[0012]本發(fā)明所述葡萄糖測定過程，首先將構(gòu)建的葡萄糖生物傳感器按照附圖4折疊并用自制導(dǎo)電夾夾住，連接到涂有電致變色材料的ITO上，通過A單元上的溶液入口加入葡萄糖溶液，葡萄糖溶液在紙纖維的毛細(xì)作用和大氣壓雙重作用下在C單元的半親水蠟/紙通道上沿著B單元設(shè)計(jì)的中空通道流動，溶液流動至紙陽極和紙陰極區(qū)域引發(fā)反應(yīng)產(chǎn)生電子，電子通過外電路傳出，引起電致變色材料顏色變化，通過觀察電致變色材料顏色變化即可得到葡萄糖溶液濃度范圍。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
(1)在微流控紙芯片實(shí)驗(yàn)室中引入中空通道，極大地縮短了試驗(yàn)時(shí)間，減少實(shí)驗(yàn)過程中溶液的揮發(fā)以及紙纖維對分子的吸附；
(2)將生物燃料電池技術(shù)和中空通道微流控紙芯片，降低了檢測成本；
(3)生物燃料電池可以自行產(chǎn)生電信號，無需外加能量激發(fā)反應(yīng)，擺脫了對能源要求的限制，有利于隨時(shí)隨地的現(xiàn)場檢測；
(4)結(jié)合電致變色可以通過肉眼確定葡萄糖濃度范圍，有利于推廣應(yīng)用。
[0014]說明書附圖
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方案對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述
圖1三維中空通道微流控芯片的疏水蠟批量打印圖案，I為溶液入口，2為紙陽極區(qū)域，3-5為中空通道區(qū)域，6、7為半親水蠟通道，8為中空區(qū)域，9為紙陰極區(qū)域；
圖2三維中空通道微流控芯片的疏水蠟批量打印圖案反面，10,11為半親水紙通道；
圖3三維中空通道微流控芯片的疏水蠟批量打印圖案反面，利用激光切割機(jī)切割制備中空通道和在陰極和陽極印刷碳電極后圖案；
圖4折疊后的三維中空通道微流控芯片圖案，a為三維中空通道微流控芯片折疊方法，b、c為自制導(dǎo)電夾，d為三維中空通道微流控芯片被導(dǎo)電夾夾住圖案；
圖5電致變色材料合成路線圖，A為4，4- 二氨基-4-甲氧基三苯胺B為異氰尿酸三縮水甘油酯。

【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1:血清中葡萄糖的檢測
(1)在計(jì)算機(jī)上利用AdobeIllustrator CS4軟件設(shè)計(jì)三維中空通道微流控紙芯片，式樣如附圖1和2所示，該三維中空通道微流控紙芯片包括四個(gè)蠟打印疏水區(qū)域分別為A、B、C和D，單個(gè)單元大小為15X 15mm, A為陽極單元，B為中空通道單元，C為半親水通道單元，D為陰極單元，其中I區(qū)域?yàn)槿芤喝肟冢?為紙陽極區(qū)域，3-5為中空通道區(qū)域，6、7為半親水蠟通道，10、11為半親水紙通道，8為中空區(qū)域，9為紙陰極區(qū)域，溶液入口 I直徑為5mm，紙陽極區(qū)域2直徑為6mm，中空通道區(qū)域兩個(gè)圓形區(qū)域3和5直徑分別為5mm和6mm，通道4寬度為2mm，長度為10mm，半親水蠟/紙通道6和10寬度為2mm，長度為10mm，半親水蠟/紙通道圓形區(qū)域7和11直徑為5mm，中空區(qū)域8直徑為6mm，紙陰極區(qū)域9直徑為6mm ;
(2)利用激光切割機(jī)對1、3-5和8區(qū)域進(jìn)行切割制備溶液入口、中空通道，并在設(shè)計(jì)的紙陽極區(qū)域2和紙陰極區(qū)域9分別印刷碳電極，式樣如附圖3所示；
(3)將制備的20PL金納米滴加在紙陽極上，晾干，然后將質(zhì)量濃度為1%氯金酸和0.2Μ鹽酸羥胺混合溶液50 μ?滴加在紙陽極上，在室溫條件下反應(yīng)10分鐘，然后用二次水沖洗制備得到金-紙電極；
(4)將20mg制備得到的三維石墨烯溶解到含有40 mg的3，4，9，10-茈四羧酸100 mL乙醇溶液中，超聲lh，然后繼續(xù)室溫?cái)嚢?2h，然后過濾依次用乙醇、二次水洗滌，最終60°C下真空干燥。然后將1mg 二環(huán)己基碳二亞胺在氮?dú)獗Ｗo(hù)下溶解到60mL 二甲基甲酰胺溶液中，然后將含有1mg修飾過的三維石墨烯的40mL 二甲基甲酰胺溶液加入到上述溶液中，加熱至40°C氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)48h，然后過濾，依次用二甲基甲酰胺、乙醇和二次水洗滌，60°C真空干燥。將Img制備得到的上述修飾過的三維石墨稀超聲溶于ImL乙醇中，取10 μ L上述溶液分別加入到長金的燃料電池陰極和陽極反應(yīng)30min，然后分別加入10 UL葡萄糖氧化酶溶液和漆酶溶液到陽極和陰極上反應(yīng)2h，將制備得到的電極保存在4°C冰箱中備用；
(5)將A、B、C和D四個(gè)單元依次堆疊，式樣如附圖4所示，隨后用電路板夾住，連接至涂有電致變色材料的ITO上，從入口加入不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過觀察電致變色材料的顏色變化，得到葡萄糖的濃度范圍，本發(fā)明對葡萄糖測定的線性范圍為50μΜ-100πιΜ，可以用于實(shí)際樣品的測定。
【權(quán)利要求】
1.一種可視化自供能葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟: (1)在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)三維中空通道微流控紙芯片的疏水蠟批量打印圖案，式樣如附圖1和2所示，該三維中空通道微流控紙芯片包括四個(gè)蠟打印疏水區(qū)域分別為A、B、C和D，A為陽極單元，B為中空通道單元，C為半親水通道單元，D為陰極單元，然后利用打孔器和激光切割機(jī)對蠟批量打印圖案A、B和C進(jìn)行打孔切割，制備溶液入口、中空通道，并在設(shè)計(jì)的紙陽極區(qū)域和紙陰極區(qū)域分別印刷碳電極，式樣如附圖3所示； (2)通過長金制備生物燃料電池紙電極； (3)制備合成三維石墨烯修飾生物燃料電池陰極和陽極，用于在陽極上固定葡萄糖氧化酶，在陰極上固定漆酶，將制備好的生物燃料電池陰陽極保存在4°C備用； (4)合成電致變色材料，均勻旋涂在氧化銦錫導(dǎo)電玻璃(ITO)上； (5)如附圖4所示將構(gòu)建的葡萄糖生物傳感器A、B、C和D四個(gè)單元依次折疊，并用電路板夾住連接涂有電致變色材料的ITO導(dǎo)電玻璃上，然后加入葡萄糖溶液引發(fā)反應(yīng)，通過觀察涂在ITO上電致變色材料顏色變化，即可確定葡萄糖濃度范圍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種可視化自供能葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建方法，所用的紙材料為普通濾紙、吸水紙或者色譜紙。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種可視化自供能葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建方法，其特征是:在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)三維中空通道微流控紙芯片的疏水蠟批量打印圖案，式樣如附圖1和2所示，該三維中空通道微流控紙芯片包括四個(gè)蠟打印疏水區(qū)域分別為A、B、C和D，A為陽極單元，B為中空通道單元，C為半親水通道單元，D為陰極單元，其中單個(gè)單元尺寸范圍為15mm-35mm，溶液入口尺寸范圍為3mm-5mm，通道寬度范圍為1.5mm-2.5mm，通道長度范圍為10mm-30mm,紙陽極和紙陰極直徑尺寸范圍為5mm-8mm，然后利用激光切割機(jī)對錯(cuò)批量打印圖案A、B和C進(jìn)行打孔切割，制備溶液入口、中空通道，并在設(shè)計(jì)的紙陽極區(qū)域和紙陰極區(qū)域分別印刷碳電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種可視化自供能葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建方法，通過長金制備生物燃料電池紙電極，其特征是:金納米粒子的制備，將160mL水加熱到90°C，加入質(zhì)量濃度為1%的氯金酸1.6mL，升溫到96°C，保持I分鐘，加入質(zhì)量濃度為1%的梓檬酸鈉5.6mL，攪拌15分鐘，溶液變成酒紅色，室溫冷卻，制備得到金納米；長金制備生物燃料電池紙電極，將20 PL金納米粒子滴加在紙陽極上，室溫條件下晾干，然后加入質(zhì)量濃度為1%的氯金酸和0.2Μ鹽酸羥胺混合溶液50 μ?滴加在紙電極上，在室溫條件下反應(yīng)10分鐘，然后用二次水沖洗，得到長金修飾的生物燃料電池長金紙電極。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種可視化自供能葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建方法，三維石墨烯材料的制備方法，其特征是:利用732-型硫酸陽離子交換樹脂作為碳源，通過Ni2+-氫氧化鉀交換活化重組方法制備，首先將732-型硫酸陽離子交換樹脂浸泡在10mL 0.05Μ的醋酸鎳溶液中8h，用二次水沖洗交換樹脂60°C真空干燥，1g含有Ni2+的交換樹脂加入含有40g氫氧化鉀400mL乙醇溶液中在80°C攪拌直至溶液變成絮狀，然后室溫浸泡6h，隨后將混合液在70°C下干燥60h用粉碎機(jī)粉碎，最后將混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，850°C加熱2h，升溫速率為2°C /min，然后用IM的鹽酸腐蝕，離心二次水洗，最后60°C干燥制備得到三維石墨烯。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種可視化自供能葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建方法，生物燃料電池陰極和陽極構(gòu)建，其特征是:首先將20 mg制備得到的三維石墨烯溶解到含有40 mg的3，4，9，10-茈四羧酸100 mL乙醇溶液中，超聲lh，然后繼續(xù)室溫?cái)嚢?2h，然后過濾依次用乙醇、二次水洗滌，最終60°C下真空干燥；然后將1mg 二環(huán)己基碳二亞胺在氮?dú)獗Ｗo(hù)下溶解到60mL 二甲基甲酰胺溶液中，然后將含有1mg修飾過的三維石墨烯的40mL 二甲基甲酰胺溶液加入到上述溶液中，加熱至40°C氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)48h，然后過濾，依次用二甲基甲酰胺、乙醇和二次水洗滌，60°C真空干燥；將Img制備得到的上述修飾過的三維石墨烯超聲溶于ImL乙醇中，取10 μ L上述溶液分別加入到長金的燃料電池陰極和陽極反應(yīng)30min，然后分別加入10 μ L 2mg/mL葡萄糖氧化酶溶液和lm/mL漆酶溶液到陽極和陰極上反應(yīng)2h，將制備得到的電極保存在4°C冰箱中備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種可視化自供能葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建方法，電致變色材料的制備方法，其特征是:首先將0.462g 4，4-二氨基-4-甲氧基三苯胺(A)、1.224g異氰尿酸三縮水甘油酯(B)溶于ImL N，N- 二甲基乙酰胺(DMAc )中，加熱至80°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)2h，隨后將溶液通過勻膠機(jī)均勻懸涂在ITO導(dǎo)電玻璃上，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下120°C加熱12h除去多余溶劑，然后分別在40°C、130°C和180°C下真空干燥3h、2h和3h，即制備得到電致變色材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種可視化自供能葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建方法，本發(fā)明所述葡萄糖測定過程，其特征是:首先將構(gòu)建的葡萄糖生物傳感器按照附圖4折疊并用自制導(dǎo)電夾夾住，連接到涂有電致變色材料的ITO上，通過A單元上的溶液入口加入葡萄糖溶液，葡萄糖溶液在紙纖維的毛細(xì)作用和大氣壓雙重作用下在C單元的半親水蠟/紙通道上沿著B單元設(shè)計(jì)的中空通道流動，溶液流動至紙陽極和紙陰極區(qū)域引發(fā)反應(yīng)產(chǎn)生電子，電子通過外電路傳出，引起電致變色材料顏色變化，通過觀察電致變色材料顏色變化即可得到葡萄糖溶液濃度范圍。
【文檔編號】G01N21/78GK104483310SQ201410722008
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】于京華, 王衍虎, 葛慎光, 李帥, 高超民, 顏梅, 劉海云, 張麗娜, 張彥 申請人:濟(jì)南大學(xué)