一種用于檢測(cè)鉛的生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)鉛的生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用，該生物傳感器包括一在三電極系統(tǒng)中用作工作電極的玻碳電極，玻碳電極的反應(yīng)端表面修飾有L-賴氨酸，L-賴氨酸表面修飾有有序介孔碳-金納米粒子，有序介孔碳-金納米粒子表面修飾有納米金膜，納米金膜表面組裝有DNAzyme探針，DNAzyme探針與DNA探針通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)連接。其制備方法包括修飾L-賴氨酸、修飾有序介孔碳-金納米粒子、電沉積納米金膜，組裝DNAzyme探針等步驟。其應(yīng)用方法為將生物傳感器插入待測(cè)溶液中，根據(jù)鉛離子濃度與阻值差的變化測(cè)定待測(cè)溶液中的鉛離子濃度。本發(fā)明的生物傳感器具有制作簡(jiǎn)單、使用壽命長(zhǎng)、抗干擾能力強(qiáng)、檢測(cè)精度和效率高等優(yōu)勢(shì)。
【專利說(shuō)明】一種用于檢測(cè)鉛的生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于檢測(cè)鉛的生物傳感器及其制 備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著工業(yè)進(jìn)步和社會(huì)發(fā)展，水污染狀況日趨嚴(yán)重，已經(jīng)成為世界性的頭號(hào)環(huán)境治 理難題。中國(guó)作為世界上最大的發(fā)展中國(guó)家，隨著城市化進(jìn)程的加速，工農(nóng)業(yè)的飛速發(fā)展， 大量環(huán)境污染物排入水體中，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染以及生態(tài)破壞，并直接危害人類的健 康。在排入水體的大量環(huán)境污染物中，重金屬污染的危害尤為嚴(yán)重。人類攝入被重金屬鎘 污染的水、食物后，會(huì)造成腎和骨骼的病變，攝入硫酸鎘20毫克，就會(huì)造成死亡。人類攝入 含砷的水、食物后，會(huì)發(fā)生急性或慢性中毒，重金屬砷會(huì)使體內(nèi)酶活性受到抑制或失活，造 成機(jī)體代謝障礙，甚至引發(fā)皮膚癌。人類攝入被重金屬鉛污染的水、食物后，導(dǎo)致人體貧血， 并出現(xiàn)頭痛、暈眩、乏力、困倦等癥狀。
[0003] 鉛是一種蓄積性的元素，可以通過(guò)食物鏈在生物組織富集，對(duì)人類的健康以及自 然界環(huán)境造成巨大危害。并且鉛對(duì)機(jī)體的損傷呈現(xiàn)多系統(tǒng)性、多器官性，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng) 毒物，對(duì)兒童的健康和危害更為嚴(yán)重?，F(xiàn)行國(guó)家環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測(cè)方法中規(guī)定水質(zhì)鉛的測(cè)定有 雙硫腙分光光度法和火焰原子吸收分光光度法，檢出濃度最低能達(dá)到0. 〇lmg/L，這些方法 雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)，但樣品前處理復(fù)雜、儀器昂貴或者耗時(shí)長(zhǎng)，需要專門的操作技術(shù) 人員，檢測(cè)成本高，經(jīng)濟(jì)效益相對(duì)較低。所以研宄出一種快速、簡(jiǎn)便、低成本、高靈敏度的鉛 離子檢測(cè)手段具有十分重要的意義。
[0004] 現(xiàn)今，電化學(xué)及生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)日益發(fā)展成熟，這為環(huán)境樣品中重金屬離子的快 速檢測(cè)提供了各種可行的技術(shù)手段，如電化學(xué)分析法-陽(yáng)極溶出伏安法（ASV)和重金屬離 子的生物學(xué)檢測(cè)方法等，其中重金屬離子生物學(xué)檢測(cè)方法包括免疫檢測(cè)技術(shù)和DNA檢測(cè)技 術(shù)。運(yùn)用生物傳感器來(lái)檢測(cè)環(huán)境中的重金屬、病原微生物、有毒有機(jī)物時(shí)，生物傳感器具有 特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)效率高、成本低廉的特點(diǎn)，因此成為了環(huán)境保護(hù)工作中的一 個(gè)研宄熱點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種使用壽命長(zhǎng)、抗干擾 能力強(qiáng)、檢測(cè)精度強(qiáng)和效率高的用于檢測(cè)鉛的生物傳感器，此外相應(yīng)提供一種方法簡(jiǎn)單、成 本低廉、制作快速的生物傳感器的制備方法，在此基礎(chǔ)上，還提供一種前述生物傳感器的應(yīng) 用，該應(yīng)用能夠以低成本、簡(jiǎn)化操作、快速響應(yīng)、高檢測(cè)精度及較強(qiáng)抗干擾性等特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì) 鉛尚子的尚效檢測(cè)。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供了一種用于檢測(cè)鉛的生物傳感器，包括一在三電極系 統(tǒng)中用作工作電極的玻碳電極，玻碳電極的反應(yīng)端表面修飾有L-賴氨酸，L-賴氨酸表面修 飾有有序介孔碳-金納米粒子，有序介孔碳-金納米粒子表面修飾有納米金膜，納米金膜表 面組裝有單鏈DNAzyme探針，DNA探針與DNAzyme探針通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)連接。
[0007] 前述的生物傳感器，優(yōu)選的，DNAzyme探針為具有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，DNA 探針為具有SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。具有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列和具有SEQ ID NO. 2的核苷酸序列互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈探針。當(dāng)生物傳感器用于檢測(cè)時(shí)，如果檢測(cè)環(huán)境中存 在鉛離子，雙鏈斷開，導(dǎo)致界面電阻發(fā)生改變，根據(jù)濃度與電阻之間的關(guān)系達(dá)到檢測(cè)環(huán)境中 鉛離子的目的。
[0008] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，DNAzyme探針為用于檢測(cè)鉛的DNAzyme探針，DNA探針和 用于檢測(cè)鉛的DNAzyme探針并不僅限于本發(fā)明提供的兩條核苷酸序列，任一用于檢測(cè)鉛的 DNAzyme探針與之配對(duì)的DNA探針進(jìn)行結(jié)合后，均能實(shí)現(xiàn)對(duì)鉛離子的檢測(cè)，并達(dá)到相同或相 似的技術(shù)效果。
[0009] 作為本發(fā)明的同一技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了上述的生物傳感器的制備方法，包 括以下步驟：
[0010] S1、修飾L-賴氨酸：制作一玻碳電極，將L-賴氨酸電沉積于玻碳電極的反應(yīng)端表 面得到L-賴氨酸修飾的玻碳電極；
[0011] S2、修飾有序介孔碳-金納米粒子：在L-賴氨酸修飾的玻碳電極的反應(yīng)端表面滴 加有序介孔碳-金納米粒子得到有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極；
[0012]S3、電沉積納米金：在有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極的反應(yīng) 端表面電沉積納米金膜，得到納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳 電極；
[0013]S4、組裝DNAzyme探針：在納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾 的玻碳電極的反應(yīng)端表面滴加DNAzyme探針，使DNAzyme探針通過(guò)金硫共價(jià)鍵固定在納米 金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極的反應(yīng)端表面，得到組裝有 DNAzyme探針的納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極；
[0014] S5、連接DNA探針：將組裝有DNAzyme探針的納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子 /L-賴氨酸修飾的玻碳電極浸泡在DNA探針溶液中培養(yǎng)，使DNAzyme探針與DNA探針進(jìn)行互 補(bǔ)配對(duì)連接，完成生物傳感器的制備。
[0015] 進(jìn)一步的，步驟S2中的有序介孔碳-金納米粒子是采用包括以下步驟的方法制 得：
[0016]S2-1、合成硅基分子篩SBA-15:將嵌段共聚物P123和正硅酸乙酯混合后在140? 150°C下油浴、然后焙燒得到硅基分子篩SBA-15 ;
[0017]S2-2、合成有序介孔碳：硅基分子篩SBA-15與水、蔗糖、濃硫酸混合得到混合物， 將混合物置于100?160°C溫度下干燥直至混合物變?yōu)楹谏?；然后將黑色的混合物置于?性氣體保護(hù)下進(jìn)行高溫?zé)峤獾玫綗峤猱a(chǎn)物，將熱解產(chǎn)物進(jìn)行洗滌、干燥步驟得到有序介孔 碳；
[0018] S2-3、在超聲條件下，將所述步驟S2-2制備得到的有序介孔碳與氯金酸按照質(zhì)量 比為1 : 50進(jìn)行超聲混合（超聲混合時(shí)間是12h);然后依次加入1%檸檬酸鈉、0.075%硼 氫化鈉，再次超聲（超聲時(shí)間是30min)得到黑色溶液，將黑色溶液離心、洗滌、干燥，得到有 序介孔碳-金納米粒子。
[0019] 優(yōu)選的，步驟S2-2中，混合物中，硅基分子篩SBA-15與水、蔗糖、濃硫酸按照質(zhì)量 比為I: 4?5 : 1.25 ?2.5 : 0.12 ?0.16。
[0020] 進(jìn)一步的，步驟Sl具體為將玻碳電極浸入L-賴氨酸的水溶液中，用CV法掃 描-2. 0?+2.OV范圍，30段，使玻碳電極表面形成一層L-賴氨酸薄膜，得到L-賴氨酸修飾 的玻碳電極。
[0021] 進(jìn)一步的，賴氨酸的水溶液為濃度I.OXl(T3mol/L的L-賴氨酸水溶液，L-賴氨酸 水溶液采用pH為8. 0的PBS溶液配制；前述CV法的掃描速率為0. 05Vs'
[0022] 進(jìn)一步的，步驟S2中將有序介孔碳-金納米粒子配制成懸浮液滴加在L-賴氨酸 修飾的玻碳電極的反應(yīng)端表面，有序介孔碳-金納米粒子懸浮液的濃度為0. 5mg/mL。
[0023] 進(jìn)一步的，步驟S3中，將有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極放 入0. 1%HAuCljK溶液中，采用循環(huán)伏安法將納米金粒子電沉積在前述修飾玻碳電極的反 應(yīng)端表面，前述循環(huán)伏安法中掃描電位為0?I. 6V，掃描速率為20mV/s，掃描圈數(shù)為6圈， 得到納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極。
[0024] 進(jìn)一步的，前述步驟S4具體為：將濃度為10?20μM的DNA滴加在前述納米金膜 /有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極的反應(yīng)端表面，在4°C下反應(yīng)12h(反 應(yīng)時(shí)間還可以是12小時(shí)以上），再轉(zhuǎn)入ImM的6-巰基乙醇溶液中培養(yǎng)1?2h得到前述組 裝有DNA探針的修飾玻碳電極。優(yōu)選的，DNA探針滴加的體積為5?10μL。
[0025] 作為本發(fā)明的同一技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種采用前述的生物傳感器或采用 前述制備方法制得的生物傳感器在檢測(cè)鉛中的應(yīng)用，包括以下步驟：
[0026] (1)以生物傳感器的玻碳電極作為工作電極浸泡在鐵氰、亞鐵氰和KCl的混合溶 液中建立三電極系統(tǒng)，將前述三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，測(cè)試交流阻抗譜；
[0027] (2)然后將玻碳電極浸泡在含鉛離子的緩沖溶液中，使鉛與DNAzyme探針充分結(jié) 合，然后取出玻碳電極洗凈、干燥后浸泡在鐵氰、亞鐵氰和KCl的混合溶液中以相同的方 式測(cè)試交流阻抗譜；優(yōu)選的，步驟（2)中玻碳電極浸泡在含鉛離子的緩沖溶液中的時(shí)間為 30 ?60min〇
[0028] (3)根據(jù)鉛離子濃度與阻值差的變化構(gòu)建線性回歸方程，即可測(cè)定待測(cè)溶液中的 鉛離子。
[0029] 進(jìn)一步的，前述鉛離子濃度與阻值差的變化的線性回歸方程為：
[0030] Y= ( - 373. 7486±8· 6726)Χ+(3778· 9752±60· 8136) (1)
[0031] 式（1)中，Y為鉛離子檢測(cè)時(shí)交流阻抗圖譜阻值的變化負(fù)值，即-ARct，單位為 Ω;X為待測(cè)溶液中鉛離子濃度值自然對(duì)數(shù)負(fù)值，即-log[Pb2+]，鉛離子濃度的單位為μΜ; 式（1)的相關(guān)系數(shù)R= 0.9758,鉛離子檢測(cè)線性范圍為SXKTkiM?5Χ10_5Μ，檢測(cè)下限為 2XKT10M0
[0032] 進(jìn)一步的，前述鐵氰、亞鐵氰和KCl的混合溶液中鐵氰的濃度為5.OmM，亞鐵氰的 濃度為5.OmM，KCl的濃度為10mM。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0034] (1)本發(fā)明提供的用于檢測(cè)鉛的生物傳感器具有優(yōu)化的微觀結(jié)構(gòu)。首先，將玻碳 電極用L-賴氨酸修飾，使有序介孔碳-金納米粒子能夠更多，更穩(wěn)定的固定在修飾電極表 面，使得有序介孔碳-金納米粒子的復(fù)合膜更均勻，同時(shí)也提高了傳感器的使用壽命；其 次，有序介孔碳-金納米粒子具有優(yōu)越的電子傳遞能力和導(dǎo)電性能，能夠顯著提高生物傳 感器和待測(cè)溶液間電子的轉(zhuǎn)移速度；電沉積納米金膜為DNAzyme探針提供了結(jié)合位點(diǎn)，使 得DNAzyme探針通過(guò)金硫共價(jià)鍵（Au-S)能夠穩(wěn)定的固定在玻碳電極上，使生物傳感器通過(guò) 協(xié)同增效，大大提高了生物傳感器的穩(wěn)定性、重復(fù)性和傳感器結(jié)構(gòu)的可靠性，提高了生物傳 感器的檢測(cè)水平。
[0035] (2)本發(fā)明提供的用于檢測(cè)鉛的生物傳感器特異性強(qiáng)、檢測(cè)精度高、效率高、成本 低廉，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鉛離子的高效檢測(cè)。
[0036] (3)本發(fā)明的生物傳感器的制備方法不僅工藝步驟簡(jiǎn)單、成本低廉，且制作效率 尚。
[0037] (4)本發(fā)明采用生物傳感器檢測(cè)重金屬鉛離子的應(yīng)用方法，生物傳感器中DNA探 針、DNAzyme探針互補(bǔ)配對(duì)形成的雙鏈探針，在鉛離子特異性的作用下，雙鏈探針中DNA探 針會(huì)發(fā)生斷裂，從而使鐵氰溶液中的氧化還原電子對(duì)發(fā)生改變，以改變交流阻抗譜，實(shí)現(xiàn)對(duì) 鉛離子的快速和特異性檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0038] 為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例 中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。
[0039] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中生物傳感器的自組裝過(guò)程示意圖。
[0040] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1的生物傳感器檢測(cè)Pb2+原理圖。
[0041]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2的有序介孔碳的透射電鏡圖。
[0042]圖4為本發(fā)明實(shí)施例2的有序介孔碳-金納米粒子的透射電鏡圖。
[0043] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中Pb2+溶液濃度與交流阻抗譜的阻值差的線性回歸曲線 圖。
[0044] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例4中生物傳感器檢測(cè)的再現(xiàn)性圖。
[0045] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例5中生物傳感器檢測(cè)Pb2+溶液濃度的重復(fù)性圖。
[0046] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例7中生物傳感器檢測(cè)不同重金屬離子的交流阻抗圖譜阻值 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0047] 以下結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而 限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0048] 以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。
[0049] 實(shí)施例1:
[0050] 參照?qǐng)D1，一種用于檢測(cè)鉛的生物傳感器，包括一在三電極系統(tǒng)中用作工作電極 的玻碳電極，玻碳電極的反應(yīng)端表面修飾有L-賴氨酸，L-賴氨酸膜表面修飾有有序介孔 碳-金納米粒子，再在有序介孔碳-金納米粒子表面沉積一層納米金膜，DNAzyme探針通過(guò) 共價(jià)鍵（Au-S)固定在納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的生物傳感器 的反應(yīng)端表面；然后與DNA探針互補(bǔ)配形成雙鏈DNA。
[0051] DNAzyme序列具有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，具體為：
[0052] 5? - HS - (CH2) 6 - SS - (CH2) 6 - TTT - CATCTCTTC - TCCGAGCCGGTCGAAA - TAGTGAGT- 3'
[0053] DNA序列具有SEQ ID NO. 2的核苷酸序列，具體為：
[0054] 3' -GTAGAGAAGGrATATCACTCA-5'
[0055] 參見圖2,生物傳感器中DNA探針、DNAzyme探針互補(bǔ)配對(duì)形成的雙鏈探針，當(dāng)待 測(cè)的水體中存在鉛離子時(shí)，在鉛離子特異性的作用下，發(fā)生斷裂，從而使鐵氰溶液中的氧化 還原電子對(duì)發(fā)生改變，以改變交流阻抗譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)鉛離子的快速和特異性檢測(cè)。從圖2中可 知，實(shí)施例1的生物傳感器可以檢測(cè)待測(cè)溶液中是否存在鉛離子，并根據(jù)電阻的大小判斷 鉛離子的濃度。
[0056] 實(shí)施例2
[0057] -種用于檢測(cè)鉛的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：
[0058]S1、修飾L-賴氨酸：制作一玻碳電極，將玻碳電極放入I.OXl(T3m〇l/L的L-賴氨 酸水溶液中（L-賴氨酸水溶液用pH為8. 0的PBS溶液配制），用CV法掃描，-2.0?+2. OV 范圍，30段，掃描速率為0. 05Vs'進(jìn)行掃描，使玻碳電極表面形成一層L-賴氨酸薄，得到 L-賴氨酸修飾的玻碳電極。
[0059]S2、修飾有序介孔碳-金納米粒子：將有序介孔碳-金納米粒子配制成濃度為 0. 5mg/mL的懸浮液，滴加在L-賴氨酸修飾的玻碳電極的反應(yīng)端表面得到有序介孔碳-金納 米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極。有序介孔碳-金納米粒子按照以下方法制備得到：
[0060] S2-1、合成硅基分子篩SBA-15 :將嵌段共聚物P123和正硅酸乙酯混合后在140? 150°C下油?。ü栌停⑷缓笠?50°C焙燒得到硅基分子篩SBA-15。
[0061]S2-2、合成有序介孔碳：將前述硅基分子篩SBA-15與水、蔗糖、濃硫酸按照質(zhì)量比 為1 : 5 : 1.875 : 0.14進(jìn)行混合得到混合物（硅基分子篩SBA-15與水、蔗糖、濃硫酸的 質(zhì)量比為1 : 4?5 : 1.25?2.5 : 0.12?0.16,均可實(shí)施），將前述混合物置于鼓風(fēng)干 燥箱中，以l〇〇°C溫度下保持6h，然后將溫度提高至160°C并保持6h，直至混合物變?yōu)楹谏?然后將黑色的混合物置于惰性氣體保護(hù)下，以5°C/min的升溫速率升溫至900°C，在900°C 下進(jìn)行高溫?zé)峤?. 5h得到熱解產(chǎn)物（高溫?zé)峤鈺r(shí)間為4h?5h均可實(shí)施），將前述熱解產(chǎn) 物進(jìn)行洗滌、80°C干燥步驟得到有序介孔碳（圖3為按照前述方法制備得到的有序介孔碳 的透射電鏡圖）。
[0062] S2-3、在超聲條件下，取有序介孔碳（OMC)以質(zhì)量比為1 : 50加入到0.lwt%的氯 金酸中，超聲12h。然后再加入ImL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%檸檬酸鈉，快速攪拌Imin后，加入ImL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 075 %的硼氫化鈉，超聲30min得到黑色溶液。將黑色溶液離心，洗滌，最后放 置80°C下干燥，得到有序介孔碳-金納米粒子（圖4為按照前述方法制備得到的有序介孔 碳-金納米粒子的透射電鏡圖）。
[0063]S3、電沉積納米金：將有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極放入 0. 1%HAuCljK溶液中，采用循環(huán)伏安法將納米金粒子電沉積在前述修飾玻碳電極的反應(yīng) 端表面；循環(huán)伏安法中掃描電位為0?I. 6V，掃描速率為20mV/s，掃描圈數(shù)為6圈，得到納 米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極。
[0064]S4、組裝DNAzyme探針：在納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾 的玻碳電極的反應(yīng)端表面滴加10μL(體積為5?10μL均可實(shí)施）濃度為10μM(濃度為 5?10μM均可實(shí)施）的DNA探針，在4°C下反應(yīng)12h，使DNAzyme探針通過(guò)金硫共價(jià)鍵固定 在納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極的反應(yīng)端表面，得到組 裝有DNAzyme探針的納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極。
[0065] 用Tris-HClO4W洗前述組裝有DNAzyme探針的納米金膜/有序介孔碳-金納米 粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極，然后再浸泡在ImM的6-巰基乙醇溶液（MCH)中培養(yǎng)2h， 然后用Tris-HClO4沖洗，干燥待用。MCH能夠?qū)?fù)合膜修飾電極的表面進(jìn)行封端，不僅使 DNAzyme探針可以穩(wěn)定的固定于修飾電極表面，還可以使DNAzyme與DNA能夠更好的互補(bǔ)配 對(duì)形成雙鏈DNA。
[0066] 將組裝有DNAzyme探針的納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾 的玻碳電極浸泡在濃度為7μM的DNA探針溶液（DNA探針溶液的濃度為5?10μM均可 實(shí)施）中于恒溫水浴鍋中培養(yǎng)lh，然后取出反應(yīng)完成的玻碳電極，用Tris-HClOjl沖溶液 (PH8. 0)沖洗，干燥后待用，完成生物傳感器的制備。
[0067] 實(shí)施例3
[0068] -種實(shí)施例1的生物傳感器在檢測(cè)鉛中的應(yīng)用，包括以下步驟：
[0069] (1)以生物傳感器的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑電極 作為對(duì)電極，將玻碳電極用1^ 8-!1(：104清洗干凈后浸泡在鐵氰（5.OmM)、亞鐵氰（5.OmM)和 KCl(IOmM)的混合溶液中建立三電極系統(tǒng)，將前述三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，測(cè)試交 流阻抗譜；
[0070] (2)然后將玻碳電極浸泡在Pb2+濃度分別為5X10 _5M、5X10_6M、5X10_7M、 5X10_8M、5X10_9M和SXKTkiM的Pb2+緩沖溶液中2h，取出洗凈、干燥后浸泡在鐵氰 (5.OmM)、亞鐵氰（5.OmM)和KCl(IOmM)的混合溶液中以相同的方式測(cè)試交流阻抗譜；
[0071] (3)根據(jù)鉛離子濃度與阻值差的變化構(gòu)建線性回歸方程。
[0072] 圖5是Pb2+溶液濃度與交流阻抗譜的阻值差的線性回歸曲線圖，從圖5中可知，鉛 離子濃度與阻值差的變化的線性回歸方程為：
[0073] Y = ( -373. 7486±8· 6726)Χ+(3778· 9752±60· 8136) (1)
[0074] 式（1)中，Y為鉛離子檢測(cè)時(shí)交流阻抗圖譜阻值的變化負(fù)值，即-ARct，單位為 Ω;X為待測(cè)溶液中鉛離子濃度值自然對(duì)數(shù)負(fù)值，即-log[Pb2+]，鉛離子濃度單位為μΜ;式 (1)的相關(guān)系數(shù)R= 0.9758,鉛離子檢測(cè)線性范圍為SXKTkiM?5Χ10_5Μ，檢測(cè)下限為 2X10^1(檢測(cè)下限按照3倍空白樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算）。
[0075] 實(shí)施例4:對(duì)生物傳感器的再現(xiàn)性進(jìn)行檢查。
[0076] 為了驗(yàn)證實(shí)例1的生物傳感器及其檢測(cè)方法的檢測(cè)效果，按照實(shí)施例2的制備 方法制備5個(gè)生物傳感器，將前述5個(gè)生物傳感器用于檢測(cè)同一濃度的鉛離子（鉛離子 5Χ1(Γ9Μ)，檢測(cè)結(jié)果參見圖6。從圖6中可知，5個(gè)生物傳感器檢測(cè)同一濃度的鉛離子，相 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4. 9%，表明按照實(shí)施例2的制備方法制備的生物傳感器，有較好的再現(xiàn)性。
[0077] 實(shí)施例5 :對(duì)生物傳感器的重復(fù)性進(jìn)行檢查。
[0078] 將實(shí)施例1的生物傳感器，對(duì)鉛離子濃度為5Χ1(Γ9Μ的水溶液進(jìn)行檢測(cè)，平行檢 測(cè)三次，檢測(cè)結(jié)果如圖7所示：三次檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4. 3%，表明實(shí)例1的生物 傳感器具有較好的重復(fù)性。
[0079] 實(shí)驗(yàn)例6 :對(duì)生物傳感器的檢測(cè)精確度進(jìn)行檢查。
[0080] 配制4組不同鉛離子濃度的待測(cè)溶液，用實(shí)施例1的生物傳感器進(jìn)行測(cè)定（測(cè)定 方法參照實(shí)施例3)，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。
[0081] 具體的實(shí)驗(yàn)步驟：取自長(zhǎng)沙自來(lái)水公司的自來(lái)水，經(jīng)過(guò)濾后測(cè)定自來(lái)水中不含可 檢測(cè)到的鉛離子。將河水平均分為四份，配制成濃度分別為5nM、50nM、500nM、5000nM的待 測(cè)溶液。將實(shí)施例1的生物傳感器按照實(shí)施例3的檢測(cè)方法檢測(cè)待測(cè)溶液中的鉛離子濃度， 結(jié)果列于表1中。
[0082] 表1 :五組待測(cè)溶液的回收率驗(yàn)證結(jié)果
[0083]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)鉛的生物傳感器，包括一在三電極系統(tǒng)中用作工作電極的玻碳電極， 其特征在于，所述玻碳電極的反應(yīng)端表面修飾有L-賴氨酸，所述L-賴氨酸表面修飾有有序 介孔碳-金納米粒子，所述有序介孔碳-金納米粒子表面修飾有納米金膜，所述納米金膜表 面組裝有DNAzyme探針，DNA探針與所述DNAzyme探針通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)連接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述DNAzyme探針為具有SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列的探針，所述DNA探針為具有SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列的探 針。
3. -種如權(quán)利要求1或2所述生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 51、 修飾L-賴氨酸：制作一玻碳電極，將L-賴氨酸電沉積于所述玻碳電極的反應(yīng)端表 面得到L-賴氨酸修飾的玻碳電極； 52、 修飾有序介孔碳-金納米粒子：在所述L-賴氨酸修飾的玻碳電極的反應(yīng)端表面滴 加有序介孔碳-金納米粒子得到有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極； 53、 電沉積納米金：在所述有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極的反應(yīng) 端表面電沉積納米金膜，得到納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳 電極； 54、 組裝DNAzyme探針：在所述納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的 玻碳電極的反應(yīng)端表面滴加 DNAzyme探針，使DNAzyme探針固定在所述納米金膜/有序介 孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極的反應(yīng)端表面，得到組裝有DNAzyme探針的 納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極； 55、 連接DNA探針：將所述組裝有DNAzyme探針的納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子 /L-賴氨酸修飾的玻碳電極浸泡在DNA探針溶液中培養(yǎng)，使所述DNAzyme探針與所述DNA探 針進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)連接，完成生物傳感器的制備。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中的有序介孔碳-金納 米粒子是采用包括以下步驟的方法制得： S2-1、合成娃基分子篩SBA-15 :將嵌段共聚物P123和正娃酸乙醋混合后在140? 150°C下油浴、然后焙燒得到硅基分子篩SBA-15 ; S2-2、合成有序介孔碳：所述硅基分子篩SBA-15與水、蔗糖、濃硫酸混合得到混合物， 將所述混合物置于100?160°C溫度下干燥直至混合物變?yōu)楹谏?；然后將黑色的混合物?于惰性氣體保護(hù)下進(jìn)行高溫?zé)峤獾玫綗峤猱a(chǎn)物，將所述熱解產(chǎn)物進(jìn)行洗滌、干燥步驟得到 所述有序介孔碳； S2-3、在超聲條件下，將所述步驟S2-2制備得到的有序介孔碳與氯金酸按照質(zhì)量比為 1 : 50進(jìn)行超聲混合；然后依次加入1%檸檬酸鈉、0.075%硼氫化鈉，再次超聲得到黑色溶 液，將黑色溶液離心、洗滌、干燥，得到有序介孔碳-金納米粒子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S1具體為將玻碳電極 浸入L-賴氨酸的水溶液中，用CV法掃描-2. 0?+2. 0V范圍，30段，使所述玻碳電極表面形 成一層L-賴氨酸膜，得到L-賴氨酸修飾的玻碳電極。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中，將所述有序介孔 碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極放入0. 1% HAuCljK溶液中，采用循環(huán)伏安法 制備得到所述納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電極。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S4具體為：將10? 20 y M的DNA探針滴加在所述納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳 電極的反應(yīng)端表面，在4°C下反應(yīng)至少12h，再轉(zhuǎn)入ImM的6-巰基乙醇溶液中培養(yǎng)1?2h 得到所述組裝有DNA探針的納米金膜/有序介孔碳-金納米粒子/L-賴氨酸修飾的玻碳電 極。
8. -種用權(quán)利要求1或2所述的生物傳感器或采用權(quán)利要求3至7中任意一項(xiàng)所述制 備方法制得的生物傳感器在檢測(cè)鉛中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟： (1) 以生物傳感器的玻碳電極作為工作電極浸泡在鐵氰、亞鐵氰和KC1的混合溶液中 建立三電極系統(tǒng)，將所述三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，測(cè)試交流阻抗譜； (2) 然后將玻碳電極浸泡在含鉛離子的緩沖溶液中，使鉛離子與DNAzyme探針結(jié)合，然 后取出洗凈、干燥后浸泡在鐵氰、亞鐵氰和KC1的混合溶液中測(cè)試交流阻抗譜； (3) 根據(jù)鉛離子濃度與阻值差的變化構(gòu)建線性回歸方程，即可測(cè)定待測(cè)溶液中的鉛離 子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述鉛離子濃度與阻值差的變化的線性 回歸方程為： Y = ( - 373. 7486±8. 6726)X+(3778. 9752±60. 8136) (1) 式（1)中，Y為鉛離子檢測(cè)時(shí)交流阻抗圖譜阻值的變化負(fù)值，即-ARct，單位為Q ; X為待測(cè)溶液中鉛離子濃度值自然對(duì)數(shù)負(fù)值，即-log[Pb2+]，鉛離子濃度的單位為yM;式 (1)的相關(guān)系數(shù)R = 〇. 9758,鉛離子檢測(cè)線性范圍為5 X 1(T ?5 X 1(T5M，檢測(cè)下限為 2X10'M〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述鐵氰、亞鐵氰和KC1的混合溶液 中鐵氰的濃度為5. OmM，亞鐵氰的濃度為5. OmM，KC1的濃度為10mM，所述步驟（2)中所述玻 碳電極浸泡在含鉛離子的緩沖溶液中的時(shí)間為30?60min。
【文檔編號(hào)】G01N27/327GK104483366SQ201410735397
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】張辰, 曾光明, 黃丹蓮, 湯琳, 周耀渝, 賴萃, 許飄, 程敏 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)