一種提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及體外診斷試劑領(lǐng)域，特別是涉及一種提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法。本發(fā)明提供一種提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法，包括如下步驟：1）選用大粒徑的膠乳顆粒與抗體反應(yīng)，進(jìn)行抗體包被；2）將包被后的膠乳經(jīng)過清洗和封閉步驟后，分散于緩沖液中，制得膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑盒試劑2；3）配置膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑盒試劑1；4）在全自動生化分析儀上，設(shè)置參數(shù)；5）運行生化儀，在使用已知濃度的樣品進(jìn)行定標(biāo)后，檢測待測樣本得到吸光度變化值，根據(jù)校準(zhǔn)曲線，計算出樣本中待測物的含量。本發(fā)明所提供的提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法大大提升試劑的分析靈敏度和精密度，且并未提高檢測成本，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及體外診斷試劑領(lǐng)域，特別是涉及一種提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度 的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)光線通過一個渾濁介質(zhì)溶液時，由于溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收一部分， 吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測定光吸收量的方法稱為透射比濁法。這一方法 早于1959年Schultre和Schuick等報道應(yīng)用于血楽蛋白與其抗體結(jié)合后形成復(fù)合物，導(dǎo) 致濁度的改變，再進(jìn)行透射比濁測定，一般采用抗體對抗原定量的透射比濁法，稱為免疫透 射比濁法。其原理是，利用抗原和抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物，通過測定復(fù)合物形成量的 多少對抗原或抗體進(jìn)行定量的方法。
[0003] 但是經(jīng)典的免疫比濁法，少量的小的抗原抗體復(fù)合物極難形成濁度，除非放置較 長時間；如形成較大的復(fù)合物，則抗原和抗體用量也較大，顯然不符合微量化的要求。于是 發(fā)展了現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于生化分析儀的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法（PETIA):以多克隆抗體為基礎(chǔ) 的改良免疫比濁分析法，利用基因工程方法將抗體與膠乳顆粒結(jié)合，當(dāng)抗原抗體相結(jié)合時 便形成了抗原-抗體-膠乳顆粒復(fù)合物，增強(qiáng)了反應(yīng)吸光度，反應(yīng)液在一定波長處比濁，與 同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液比較，計算標(biāo)本中抗原的含量。利用生化分析儀進(jìn)行比濁測定，整個分析 過程只需幾分鐘，該方法與傳統(tǒng)免疫比濁法比較其靈敏度更高。
[0004] 隨著檢驗醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對于低濃度檢測物質(zhì)的檢測越來越多，檢測物質(zhì)的濃度正 在從y g/mL級別下降至ng/mL級別，對于診斷試劑的靈敏度要求也越來越高，對于傳統(tǒng)的 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法來說需要進(jìn)一步的提升檢測的靈敏度，以適應(yīng)檢測要求，傳統(tǒng)的提升 檢測靈敏度的方法包括采用親和力更高的抗體，采用更大顆粒，穩(wěn)定性更好的膠乳顆粒，選 用更好的促進(jìn)抗原抗體反應(yīng)的緩沖液體系等，但是這些都會增加試劑的成本，如何提升面 對ng/mL級別被分析物的分析靈敏度和精密度，同時不增加成本一直是試劑開發(fā)的一大挑 戰(zhàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于通過反應(yīng)波長的選擇，不僅檢 測乳抗體抗原復(fù)合物的生成，還檢測未結(jié)合膠乳顆粒的減少，提高檢測物質(zhì)的分析靈敏度 和精密度，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種提升膠乳增強(qiáng)免疫比 濁法靈敏度的方法，包括如下步驟：
[0007] 1)選用大粒徑的膠乳顆粒與抗體反應(yīng)，進(jìn)行抗體包被，大粒徑的膠乳顆粒的粒徑 為 0? 2-1. 0 Ii m ;
[0008] 2)將包被后的膠乳經(jīng)過清洗和封閉步驟后，分散于緩沖液中，制得膠乳增強(qiáng)免疫 比濁法試劑盒試劑2 ;
[0009] 3)配置有促進(jìn)抗原和抗體反應(yīng)作用的緩沖液，制得膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑盒試 劑1 ;
[0010] 4)在全自動生化分析儀上，設(shè)置參數(shù)，其中，主波長設(shè)置為300-500nm，副波長設(shè) 置為500-800nm，反應(yīng)方向為負(fù)方向；
[0011] 5)運行生化儀，在使用已知濃度的樣品進(jìn)行定標(biāo)后，檢測待測樣本得到吸光度變 化值，根據(jù)校準(zhǔn)曲線，計算出樣本中待測物的含量。
[0012] 優(yōu)選的，所述步驟2中，緩沖液為TriS-HCl緩沖液，濃度為50mM，其中牛血清白蛋 白BSA的濃度為5g/L，疊氮鈉的濃度為lg/L。
[0013] 優(yōu)選的，所述步驟3中，緩沖液為Tris-HCl緩沖液，其配方為：Tris 50mmol/L， 牛血清白蛋白BSA的濃度為3g/L，疊氮鈉的濃度為lg/L，PEG6000的濃度為50g/L，水蘇 糖 0. 8-3g/L ;明研^ 0. 1-lg/L ;果糖二磷酸鈉 0. 8-3g/L ;六偏磷酸鈉 0. 05-0. 5g/L，pH = 7. 0-7. 4。
[0014] 優(yōu)選的，所述提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法不是以疾病的診斷和治療為 目的的。
[0015] 更優(yōu)選的，對待測物含量的測量的直接目的不是獲得診斷結(jié)果或健康狀況，而只 是從人體或動物體獲取作為中間結(jié)果的信息的方法，或只是對已脫離人體或動物體的組 織、體液或排泄物進(jìn)行處理或檢測以獲取作為中間結(jié)果的信息的方法。
[0016] 本發(fā)明第二方面提供所述提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法在生物檢測領(lǐng) 域的用途。
[0017] 本發(fā)明第三方面提供一種高靈敏度膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑盒，包括試劑1和試 劑2,所述試劑2為包被有抗體的膠乳顆粒分散液，所述膠乳顆粒的粒徑為0. 2-1. 0 i! m，所 述試劑1為促進(jìn)抗原和抗體反應(yīng)的緩沖液。
[0018] 優(yōu)選的，所述試劑1的配方為：Tris 50mmol/L，牛血清白蛋白BSA的濃度為3g/L, 疊氮鈉的濃度為lg/L，PEG6000的濃度為50g/L，水蘇糖0. 8-3g/L ;明礬0. 1-lg/L ;果糖二 磷酸鈉〇? 8-3g/L ;六偏磷酸鈉0? 05-0. 5g/L。
[0019] 優(yōu)選的，所述試劑1中，pH值為中性。
[0020] 優(yōu)選的,所述試劑2中，包被的抗體與檢測物相對應(yīng)。
[0021] 更優(yōu)選為D-二聚體抗體。
[0022] 優(yōu)選的，所述試劑2中，分散液中Tris-HCl緩沖液的濃度為50mM，牛血清白蛋白 BSA的濃度為5g/L，疊氮鈉的濃度為lg/L。
[0023] 本發(fā)明第四方面提供所述高靈敏度膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑盒的制備方法，包括 如下步驟：
[0024] 1.選用大粒徑的膠乳顆粒與抗體反應(yīng)，進(jìn)行抗體包被，所述乳膠顆粒的粒徑為 0. 2-1. 0 u m ；
[0025] 2.將包被后的膠乳經(jīng)過清洗和封閉步驟后，分散于特定緩沖液中，制得膠乳增強(qiáng) 免疫比濁法試劑盒試劑2 ;
[0026] 3.配置有促進(jìn)抗原和抗體反應(yīng)作用的緩沖液，制得膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑盒試 劑1。本發(fā)明第五方面提供所述高靈敏度膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑盒在生物檢測領(lǐng)域的用 途。
[0027] 本發(fā)明根據(jù)膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的基本原理：即包被有抗體的膠乳與抗原反應(yīng)， 形成較大的膠乳抗原抗體復(fù)合物，引起濁度的增加，增強(qiáng)了反應(yīng)吸光度，反應(yīng)液在一定波長 處測試，與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液比較，計算標(biāo)本中抗原的含量。本發(fā)明人認(rèn)為在包被抗體膠乳 顆粒粒徑較大的情況下，膠乳顆粒本身具有一定的濁度，在特定波長具有較大的吸收，而當(dāng) 包被抗體膠乳與抗原形成較大的膠乳抗原抗體復(fù)合物后，為反應(yīng)的包被抗體膠乳顆粒也隨 之減少根據(jù)米氏散射理論，不同直徑的微球?qū)τ诠潭úㄩL的光反射能力不同，所以整個反 應(yīng)液在某些波長下吸光度增加，但是在某些波長下吸光度會下降，通過測量上升波長和下 降波長的吸光度變化值，并進(jìn)行加和，可以提升分析靈敏度的1倍以上。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具如下優(yōu)勢：
[0029] 1.大大提升試劑的分析靈敏度和精密度：本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過特殊的促進(jìn)抗 原抗體反應(yīng)的緩沖液，并進(jìn)一步利用大粒徑包被膠乳微球減少所引起的吸光度變化和膠乳 抗原抗體復(fù)合物增加所引起的吸光度變化（大粒徑包被膠乳微球減少所引起的吸光度變 化往往大于膠乳抗原抗體復(fù)合物增加所引起的吸光度變化），兩者吸光度變化加和后，試劑 的分析靈敏度提升一倍或者以上，與此同時分析靈敏度的提升也帶來精密度的提升。
[0030] 2.可以不增加或者是減少成本：首先本發(fā)明僅僅是測量方式的改變，可以很容易 在全自動生化儀上通過修改參數(shù)的方式實現(xiàn)，所以不會增加成本，其次由于大粒徑膠乳微 球包被所需抗體往往比同質(zhì)量的小粒徑膠乳微球少（表面積較小），同時使用本發(fā)明所需 的膠乳濃度較小，所以本發(fā)明往往可以減少試劑的成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1是實施例1制備的檢測試劑盒的反應(yīng)全波長掃描動力學(xué)實驗結(jié)果。
[0032] 圖2是實施例1制備的檢測試劑盒的校準(zhǔn)曲線圖。

【具體實施方式】
[0033] 以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0034] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個"、"一"和"這個"包括復(fù)數(shù)形式。
[0035] 當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0036] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 and Third edition,2001 ;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons, New York,1987 and periodic updates ； the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998；METH0DS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe, eds. ), Academic Press，San Diego，1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，V〇1.119, Chromatin Protocols (P. B. Becker, ed. ) Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0037] 需要具體說明的是，本發(fā)明所用的原料基本均可以為市售產(chǎn)品，其中三羥甲基氨 基甲燒Tris購自Sigma公司；其中羧基化聚苯乙烯膠乳顆粒以羧基化聚苯乙烯膠乳顆粒溶 液的形式加入，購自日本JSR公司；D-二聚體抗體和D-二聚體購自芬蘭hytest公司。
[0038] 實施例1
[0039] -、定量檢測膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒的制備
[0040] 試劑1的制備：
[0041] 由濃度為50mM的TriS-HCl緩沖液、3g牛血清白蛋白BSA、lg疊氮鈉、2. 2g水蘇 糖、0. 6g明礬、I. 9g果糖二磷酸鈉、0. 3g六偏磷酸鈉和50g PEG6000制備得到，最終試劑1 中Tris-HCl緩沖液的濃度為50mM，牛血清白蛋白BSA的濃度為3g/L，疊氮鈉的濃度為Ig/ L，PEG6000的濃度為50g/L，水蘇糖2. 2g/L、明礬0. 6g/L、果糖二磷酸鈉I. 9g/L、六偏磷酸 鈉 〇. 3g/L ;
[0042] 稱取6.06g三羥甲基氨基甲烷（Tris)、3g BSA、50g PEG6000、水蘇糖2.2g、明礬 〇. 6g、果糖二磷酸鈉I. 9g、六偏磷酸鈉0. 3g、Ig疊氮鈉溶于0. 8L去離子水中，用HCl調(diào)節(jié) pH至7.0,定容至IL即得試劑1。
[0043] 試劑2的制備：
[0044] 由濃度為50mM的Tris-HCl緩沖液、5g的牛血清白蛋白BSA、Ig的疊氮鈉和包被鼠 抗人D-二聚體抗體的致敏聚苯乙烯膠乳顆粒制備得到，最終試劑2中Tris-HCl緩沖液的 濃度為50mM，牛血清白蛋白BSA的濃度為5g/L，疊氮鈉的濃度為lg/L ;
[0045] ①乳顆粒的活化、洗滌：
[0046] 取質(zhì)量體積比為10 %的羧基化聚苯乙烯膠乳顆粒溶液IOOy L，向其中加入質(zhì)量 濃度為1 % EDAC溶液10 ii L，置于37°C搖床中反應(yīng)0. 5?Ih后，再在12000rmp的轉(zhuǎn)速下離 心分離30min，然后倒掉上層清液，再用濃度為50mM、pH為7. 2的甘氨酸緩沖液洗滌三次， 最后將沉淀分散于IL濃度為50mM、pH為7. 2的甘氨酸緩沖液中，使最終溶液中聚苯乙烯膠 乳顆粒的濃度（以質(zhì)量體積比計）為〇? 5?1%。
[0047] ②抗體的純化：
[0048] 將鼠抗人D-二聚體抗體加入到透析袋中，在lOOmM、pH為7. 2的PBS緩沖液中透 析48小時，在透析的過程中換緩沖液3次，得到純化的鼠抗人D-二聚體抗體。
[0049] ③抗體膠乳顆粒的偶聯(lián)：
[0050] 將經(jīng)過步驟①活化后的羧基化聚苯乙烯膠乳顆粒溶液與步驟②純化后的抗體混 合，混勻后置于37°C搖床孵育2h，得到抗體-膠乳顆粒復(fù)合物；然后將抗體-膠乳顆粒復(fù)合 物在12000rpm離心30min，倒掉上清液，再用濃度為lOOmM、pH為7. 2的PBS緩沖液洗滌2 次，最后再加入濃度為50mM、pH為7. 0的Tris-HCl緩沖液10ml，攪拌混合均勻即可。其中 IOml的Tris-HCl緩沖液中含有0. 5mg的牛血清白蛋白BSA和Img的疊氮鈉；所述包被鼠 抗人D-二聚體抗體的致敏聚苯乙烯膠乳顆粒的質(zhì)量體積比終濃度為0. 05?0. 20%。
[0051] 校準(zhǔn)品的制備：
[0052] 由濃度為IOOmM的PBS緩沖液、3g牛血清白蛋白BSA、Ig疊氮鈉和D-二聚體以制 備得到，最終校準(zhǔn)品中PBS緩沖液的濃度為IOOmM,牛血清白蛋白BSA的濃度為3g/L，疊氮 鈉的濃度為lg/L ;
[0053] 稱取35. 61Na2HP04 ? 2H20、3g牛血清白蛋白BSA、lg疊氮鈉溶于0? 8L去離子水中， 調(diào)節(jié)pH至7. 2,用蒸餾水定容至1L，將D-二聚體溶于上述配制好的溶液中，配制成D-二聚 體的濃度分別為〇、〇. 5、l、2、4、8ng/mL的溶液，即得到校準(zhǔn)品。
[0054] 二、檢測試劑盒的反應(yīng)全波長掃描動力學(xué)實驗
[0055] 將校準(zhǔn)品與試劑1混合均勻，37°C孵育5min后，加入試劑2, 37°C孵育IOS后使用 紫外分光光度計全波長掃描反應(yīng)液（第一次），37°C反應(yīng)4min50S后使用紫外分光光度計 全波長掃描反應(yīng)液（第二次），計算吸光度變化值A(chǔ) A = A2-A1 ;全波長掃描的波長范圍為 200-800nm。表1所示為全波長掃描動力學(xué)實驗結(jié)果。
[0056] 表 1
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法，包括如下步驟： 1) 選用大粒徑的膠乳顆粒與抗體反應(yīng)，進(jìn)行抗體包被，大粒徑的膠乳顆粒的粒徑為 0. 2-1. 0 u m ； 2) 將包被后的膠乳經(jīng)過清洗和封閉步驟后，分散于緩沖液中，制得膠乳增強(qiáng)免疫比濁 法試劑盒試劑2 ; 3) 配置有促進(jìn)抗原和抗體反應(yīng)作用的緩沖液，制得膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑盒試劑 1 ; 4) 在全自動生化分析儀上，設(shè)置參數(shù)，其中，主波長設(shè)置為300-500nm，副波長設(shè)置為 500-800nm，反應(yīng)方向為負(fù)方向； 5) 運行生化儀，在使用已知濃度的樣品進(jìn)行定標(biāo)后，檢測待測樣本得到吸光度變化值， 根據(jù)校準(zhǔn)曲線，計算出樣本中待測物的含量。
2. 如權(quán)利要求1所述的提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法，其特征在于，所述步 驟2中，緩沖液為Tris-HCl緩沖液，濃度為50mM，其中牛血清白蛋白BSA的濃度為5g/L，疊 氮鈉的濃度為lg/L。
3. 如權(quán)利要求1所述的提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法，其特征在于，所述步 驟3中，緩沖液為Tris-HCl緩沖液，濃度為50mM，其中牛血清白蛋白BSA的濃度為3g/L，疊 氮鈉的濃度為lg/L，PEG6000的濃度為50g/L，水蘇糖0. 8-3g/L ;明礬0. 1-lg/L ;果糖二磷 酸鈉0? 8-3g/L ;六偏磷酸鈉0? 05-0. 5g/L。
4. 如權(quán)利要求1所述的提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法，其特征在于，所述提 升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法不是以疾病的診斷和治療為目的的。
5. 如權(quán)利要求4所述的提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法，其特征在于，對待測 物含量的測量的直接目的不是獲得診斷結(jié)果或健康狀況，而只是從人體或動物體獲取作為 中間結(jié)果的信息的方法，或只是對已脫離人體或動物體的組織、體液或排泄物進(jìn)行處理或 檢測以獲取作為中間結(jié)果的信息的方法。
6. 如權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的提升膠乳增強(qiáng)免疫比濁法靈敏度的方法在生 物檢測領(lǐng)域的用途。
【文檔編號】G01N21/31GK104360056SQ201410738145
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】劉霖 申請人:重慶中元生物技術(shù)有限公司