本發(fā)明涉及一種新的組合標(biāo)志物在制備早期肝癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。屬于分析化學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年肝癌新發(fā)患者約60萬，其發(fā)病率居惡性腫瘤的第五位，致死率居第三位。肝癌的病因復(fù)雜，大部分是由于肝炎病毒感染引起的，在我國肝癌多在乙肝肝硬化的基礎(chǔ)上發(fā)展而來。肝癌由于其早期癥狀不明顯難以被發(fā)現(xiàn)，而對于中晚期肝癌又缺乏有效的治療，其5年存活率為7％，而到IV階段僅為3.9％，因此早發(fā)現(xiàn)、早治療對肝癌極其重要。目前，肝癌的診斷主要有影像學(xué)檢查和血清甲胎蛋白(AFP)檢測，但是前者檢查作用有限，往往到了中、晚期才能夠發(fā)現(xiàn)和確診，缺少預(yù)警價值；后者其診斷的敏感性和特異性較低，檢出率一般只有50％-75％左右。因此，為了提高肝癌早期臨床診斷的靈敏度和特異性，開發(fā)新的診斷方法勢在必行。有研究表明肝癌的發(fā)生和發(fā)展與多種小分子代謝紊亂密切相關(guān)，例如：氨基酸代謝，脂質(zhì)代謝，膽汁酸代謝等等。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)血清中的甘氨膽酸、色氨酸、組氨酸、尿苷、膽堿、苯甲酰胺、溶血磷脂酰膽堿16：1和苯丙氨酰色氨酸苯丙氨酰色氨酸可以作為一種新的肝癌標(biāo)志物組合，并采用步進(jìn)式判別法(見圖1)，用于輔助診斷早期肝癌。甘氨膽酸是種甘氨酸結(jié)合型膽汁酸的膽汁，膽汁酸是一種類固醇酸，由膽固醇在肝臟中合成，可加速脂肪的代謝和脂溶性的維生素和固醇類的吸收，同時它也被認(rèn)為是一種多功能的重要信號分子，在能量動態(tài)平衡、磷脂代謝、糖代謝以及細(xì)胞增殖或凋亡等整合調(diào)節(jié)中起重要調(diào)節(jié)作用[1]。膽堿是卵磷脂的基本組成部分，它是乙酰膽堿的合成前體，同時也是很多代謝過程中的甲基供體(如脂質(zhì)代謝)，目前它也被認(rèn)為是一個重要的維生素，涉及到脂質(zhì)代謝和葡萄糖體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)[2、3]；色氨酸是人體中常見的必需氨基酸和生糖氨基酸，有研究報(bào)道腫瘤患者中色氨酸代謝異常，可能是由于機(jī)體對惡性腫瘤做出抵抗性免疫應(yīng)答或者是惡性腫瘤的免疫逃逸機(jī)制導(dǎo)致色氨酸的損耗[4、5]；組氨酸是一種蛋白氨基酸，在機(jī)體中組氨酸利用其咪唑環(huán)具有清除活性氧的特性來保護(hù)有炎癥的組織和器官，具有抗氧化，抗炎和氧化應(yīng)激的特性[6]；尿苷涉及到嘧啶代謝；苯甲酰胺是苯甲酸降解的中間物；溶血磷脂酰膽堿類代謝物對病理生理學(xué)的刺激非常靈敏，在細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞入侵和促炎、抗炎[7、8]等生理過程起著重要調(diào)控作用。鑒于此，測定血清中以上8種小分子代謝物的含量變化情況有利于了解肝細(xì)胞的代謝變化，以便輔助診斷早期肝癌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為克服肝癌早期隱蔽性強(qiáng)而診斷難的問題，提供一種新的血清代謝物組合，該代謝物組合可作為標(biāo)志物應(yīng)用于肝癌的早期診斷。本發(fā)明首次公開了一種能夠用于肝癌早期診斷的血清代謝物的組合，該組合包括甘氨膽酸、色氨酸、組氨酸、尿苷、膽堿、苯甲酰胺、溶血磷脂酰膽堿16：1和苯丙氨酰色氨酸8種血清小分子。優(yōu)選地，所述組合由甘氨膽酸、色氨酸、組氨酸、尿苷、膽堿、苯甲酰胺、溶血磷脂酰膽堿16：1和苯丙氨酰色氨酸這8種血清小分子組成。換言之，本發(fā)明提供一種用于肝癌早期診斷的組合的標(biāo)志物，其包括甘氨膽酸、色氨酸、組氨酸、尿苷、膽堿、苯甲酰胺、溶血磷脂酰膽堿16：1和苯丙氨酰色氨酸8種血清小分子，優(yōu)選地，其由甘氨膽酸、色氨酸、組氨酸、尿苷、膽堿、苯甲酰胺、溶血磷脂酰膽堿16：1和苯丙氨酰色氨酸這8種血清小分子組成。該組合的質(zhì)譜靶向分析離子信息如表1所示。表1.8種組合標(biāo)志物的靶向分析的信息表根據(jù)上述小分子代謝物的組合，采用步進(jìn)式判別法(見圖1)，以邏輯回歸公式可應(yīng)用于早期肝癌的診斷，包括對肝癌、肝硬化患者與健康人進(jìn)行區(qū)分以及對肝癌及肝硬化患者進(jìn)行判別。本發(fā)明還涉及甘氨膽酸、色氨酸、組氨酸、尿苷、膽堿、苯甲酰胺、溶血磷脂酰膽堿16：1和苯丙氨酰色氨酸的血清代謝物組合在制備早期肝癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種早期肝癌診斷試劑盒，所述試劑盒包含檢測血液樣品中權(quán)利要求1所述的每種血清代謝物的濃度的試劑和內(nèi)標(biāo)。其中所述內(nèi)標(biāo)為D5-色氨酸、D3-肉堿、D5-甘氨膽酸、D8-纈氨酸、LPC19：0和D3-脂肪酸18：0。根據(jù)上述血清代謝物組合標(biāo)志物的試劑盒采用基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的靶向方法檢測，試劑盒中包含的提取溶劑內(nèi)標(biāo)及其濃度見表2。表2.提取劑中內(nèi)標(biāo)及其濃度根據(jù)該試劑盒的檢測方法如下：a)血清樣本預(yù)處理方法：血樣在4℃下解凍，取80μL血清樣本，加入320μL含有試劑盒內(nèi)標(biāo)的乙腈提取液沉淀蛋白：渦旋30-90s，靜置15-30mins后，4℃條件下10000-14000rpm轉(zhuǎn)速離心10-15mins，取上清冷凍干燥。b)目標(biāo)代謝物靶向檢測方法如下：分離系統(tǒng)為Waters超高效液相色譜儀，流動相流速為0.35ml/min，柱溫為50℃，進(jìn)樣量為5ul；正離子模式：色譜柱為C8柱，洗脫液A相為0.1％(v/v)甲酸的水溶液、B相為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液；負(fù)離子模式：色譜柱為T3柱，流動相A為含5mM的碳酸氫銨水溶液，B相為含5mM的碳酸氫銨的甲醇溶液；檢測器為適合定量分析的單四極桿質(zhì)譜或串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀。待檢測的離子對及其相關(guān)的碰撞電壓見表1。c)基于質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)的判斷模型：首先，基于正常對照組和肝病組(肝硬化和肝癌組)數(shù)據(jù)建立了判別正常人和肝病組的模型I；回歸方程如下式1：模型IX＝9.876-0.509*A+2.339*B-0.482*H-0.454*G-0.566*EProb(肝病)＝1/(1+e-X)(截點(diǎn)值(Cutoff)＝0.5)(式1)其次基于肝硬化組和肝癌組數(shù)據(jù)建立了判別肝硬化組和肝癌組的模型II，回歸方程如下式2：模型IIX’＝7.709-0.413*A-1.803*B-0.118*C-10.983*D-1.455*FProb’(肝癌)＝1/(1+e-X’)(截點(diǎn)值(Cutoff)＝0.5)(式2)其中A、B、C、D、E、F、G、H分別為苯丙氨酰色氨酸、甘氨膽酸、色氨酸、苯甲酰胺、膽堿、尿苷、溶血磷脂酰膽堿16：1、和組氨酸的在取自受試者的血清樣品中的濃度值(ug/ml)，Prob(肝病)表示診斷為肝病的概率，截點(diǎn)值(Cutoff)＝0.5，即當(dāng)Prob(肝病)值大于0.5時，診斷所述受試者患有肝??；Prob’(肝癌)表示診斷為肝癌的概率，截點(diǎn)＝0.5，即當(dāng)Prob’(肝癌)值大于0.5時，診斷所述受試者患有肝癌。由此，本發(fā)明提供一種診斷受試者中的早期肝癌的方法，所述方法包括：(1)從所述受試者采集血液樣品，提取血清，加入內(nèi)標(biāo)，利用質(zhì)譜法定量血清樣品中的甘氨膽酸、組氨酸、膽堿、溶血磷脂酰膽堿16：1和苯丙氨酰色氨酸的濃度值，單位為ug/ml，利用邏輯回歸判別公式1計(jì)算所述受試者患有肝病的可能性：邏輯回歸判別公式1：Prob(肝病概率)＝1/(1+e-X)，其中X＝9.876-0.509×苯丙氨酰色氨酸濃度值+2.339×甘氨膽酸濃度值-0.482×組氨酸濃度值-0.454×溶血磷脂酰膽堿16：1濃度值-0.566×膽堿濃度值，其中截點(diǎn)值為0.5，大于該截點(diǎn)值的Prob(肝病概率)指示所述受試者患有肝??；(2)定量步驟(1)中被診斷為患有肝病的受試者的血清樣品中甘氨膽酸、色氨酸、苯甲酰胺、尿苷和苯丙氨酰色氨酸的濃度值，單位為ug/ml，利用邏輯回歸判別公式2計(jì)算所述受試者患有肝癌的可能性：邏輯回歸判別公式2：Prob’(肝癌概率)＝1/(1+e-X’)，其中X’＝7.709-0.413×苯丙氨酰色氨酸濃度值-1.803×甘氨膽酸濃度值-0.118×色氨酸濃度值-10.983×苯甲酰胺濃度值-1.455×尿苷濃度值其中截點(diǎn)值為0.5，大于該截點(diǎn)值的Prob’(肝病概率)指示所述受試者患有肝癌。在該診斷方法中，所用的內(nèi)標(biāo)為D5-色氨酸、D3-肉堿、D5-甘氨膽酸、D8-纈氨酸、LPC19：0和D3-脂肪酸18：0。因此，本發(fā)明提供下述方案：1.一種能夠用于肝癌早期診斷的新的血清代謝物的組合，其包含下述血清代謝物：甘氨膽酸、色氨酸、組氨酸、尿苷、膽堿、苯甲酰胺、溶血磷脂酰膽堿16：1和苯丙氨酰色氨酸。2.第1項(xiàng)所述的血清代謝物的組合在制備早期肝癌診斷試劑盒中的用途，其中所述試劑盒包含血清樣品提取溶液和檢測所述血清代謝物的濃度所需要的內(nèi)標(biāo)，其中診斷步驟包括：(1)通過檢測血清樣品中甘氨膽酸、組氨酸、膽堿、溶血磷脂酰膽堿16：1和苯丙氨酰色氨酸的濃度來診斷受試者是否患有肝病，并且(2)通過檢測步驟(1)中被診斷為患有肝病的受試者的血清樣品中甘氨膽酸、色氨酸、苯甲酰胺、尿苷和苯丙氨酰色氨酸的濃度來確定所述受試者是否是肝癌患者。3.根據(jù)第2項(xiàng)所述的用途，其中檢測第1項(xiàng)所述的各種血清代謝物的內(nèi)標(biāo)為D5-色氨酸、D3-肉堿、D5-甘氨膽酸、D8-纈氨酸、LPC19：0和D3-脂肪酸18：0。4.根據(jù)第2項(xiàng)所述的用途，其中步驟(1)區(qū)分肝病患者和健康受試者的邏輯回歸判別公式1為：Prob(肝病概率)＝1/(1+e-X)，其中X＝9.876-0.509×苯丙氨酰色氨酸濃度值+2.339×甘氨膽酸濃度值-0.482×組氨酸濃度值-0.454×溶血磷脂酰膽堿16：1濃度值-0.566×膽堿濃度值，其中血液樣品中各代謝物的濃度單位為ug/ml，其中截點(diǎn)值為0.5，大于該截點(diǎn)值的Prob(肝病概率)指示所述受試者患有肝病。5.根據(jù)第2項(xiàng)所述的用途，其中步驟(2)區(qū)分肝硬化患者和肝癌患者的邏輯回歸判別公式2為：Prob’(肝癌概率)＝1/(1+e-X’)，X’＝7.709-0.413×苯丙氨酰色氨酸濃度值-1.803×甘氨膽酸濃度值-0.118×色氨酸濃度值-10.983×苯甲酰胺濃度值-1.455×尿苷濃度值其中血液樣品中各代謝物的濃度單位為ug/ml，其中截點(diǎn)值為0.5，大于該截點(diǎn)值的Prob’(肝病概率)指示所述受試者患有肝癌。6.一種早期肝癌診斷試劑盒，所述試劑盒包含檢測血液樣品中第1項(xiàng)所述的每種血清代謝物的濃度的試劑和內(nèi)標(biāo)。7.根據(jù)第6項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述內(nèi)標(biāo)為D5-色氨酸、D3-肉堿、D5-甘氨膽酸、D8-纈氨酸、LPC19：0和D3-脂肪酸18：0。8.根據(jù)第6項(xiàng)所述的試劑盒，所述試劑盒利用基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)來檢測每種血清代謝物的濃度。9.一種診斷受試者中的早期肝癌的方法，所述方法包括：(1)從所述受試者采集血液樣品，提取血清，加入內(nèi)標(biāo)，利用質(zhì)譜法定量血清樣品中的甘氨膽酸、組氨酸、膽堿、溶血磷脂酰膽堿16：1和苯丙氨酰色氨酸的濃度值，單位為ug/ml，利用邏輯回歸判別公式1計(jì)算所述受試者患有肝病的可能性：邏輯回歸判別公式1：Prob(肝病概率)＝1/(1+e-X)，其中X＝9.876-0.509×苯丙氨酰色氨酸濃度值+2.339×甘氨膽酸濃度值-0.482×組氨酸濃度值-0.454×溶血磷脂酰膽堿16：1濃度值-0.566×膽堿濃度值，其中截點(diǎn)值為0.5，大于該截點(diǎn)值的Prob(肝病概率)指示所述受試者患有肝病；(2)定量步驟(1)中被診斷為患有肝病的受試者的血清樣品中甘氨膽酸、色氨酸、苯甲酰胺、尿苷和苯丙氨酰色氨酸的濃度值，單位為ug/ml，利用邏輯回歸判別公式2計(jì)算所述受試者患有肝癌的可能性：邏輯回歸判別公式2：Prob’(肝癌概率)＝1/(1+e-X’)，其中X’＝7.709-0.413×苯丙氨酰色氨酸濃度值-1.803×甘氨膽酸濃度值-0.118×色氨酸濃度值-10.983×苯甲酰胺濃度值-1.455×尿苷濃度值其中截點(diǎn)值為0.5，大于該截點(diǎn)值的Prob’(肝病概率)指示所述受試者患有肝癌，其中所用的內(nèi)標(biāo)為D5-色氨酸、D3-肉堿、D5-甘氨膽酸、D8-纈氨酸、LPC19：0和D3-脂肪酸18：0。本發(fā)明具有的效果是：首次將甘氨膽酸、色氨酸、組氨酸、尿苷、膽堿、苯甲酰胺、LPC16：1和苯丙氨酰色氨酸8種血清小分子代謝物組合，并采用步進(jìn)式判別法(見圖1)，應(yīng)用于早期肝癌的診斷，具有高靈敏、高特異性特征，并且通過發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證、再驗(yàn)證在三批共計(jì)579例臨床樣本驗(yàn)證了該組合標(biāo)志物穩(wěn)定性和可靠性。同時，該組合標(biāo)志物可以與傳統(tǒng)的標(biāo)志物AFP互補(bǔ)，聯(lián)合使用能夠輔助診斷早期肝癌，具有臨床開發(fā)應(yīng)用的價值。附圖說明從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中：圖1顯示8種血清小分子組合對早期肝癌診斷的步進(jìn)式判別圖，其中甘氨膽酸、組氨酸、膽堿、溶血磷脂酰膽堿16：1(LPC(16：1))和苯丙氨酰色氨酸組成“組合標(biāo)志物I”，甘氨膽酸、色氨酸、苯甲酰胺、尿苷和苯丙氨酰色氨酸組成“組合標(biāo)志物II”，所述“組合標(biāo)志物I”用來判斷受試者是否患有肝病，所述“組合標(biāo)志物II”進(jìn)一步區(qū)分所述受試者是患有肝硬化還是肝癌。圖2顯示實(shí)施例1中甘氨膽酸(GCA)、色氨酸(Tryptophan)、尿苷(Uridine)、膽堿(Choline)、苯甲酰胺(Benzamide)、溶血磷脂酰膽堿16：1(LPC(16：1)、組氨酸(Histidine)和苯丙氨酰色氨酸(Phenylalanyl-Tryptophan)在各實(shí)驗(yàn)組的檢測濃度值。圖3顯示實(shí)施例1中各組合標(biāo)志物在各個批次實(shí)驗(yàn)中判別健康對照組和肝病組(肝硬化和肝癌組)的診斷結(jié)果圖，以及在判別肝硬化組和肝癌組的診斷結(jié)果圖。圖4顯示實(shí)施例2中甘氨膽酸(GCA)、色氨酸(Tryptophan)、尿苷(Uridine)、膽堿(Choline)、苯甲酰胺(Benzamide)、溶血磷脂酰膽堿16：1(LPC(16：1)、組氨酸(Histidine)和苯丙氨酰色氨酸(Phenylalanyl-Tryptophan)在各實(shí)驗(yàn)組的檢測濃度值。圖5顯示實(shí)施例2中各組合標(biāo)志物在各個批次實(shí)驗(yàn)中判別健康對照組和肝病組(肝硬化和肝癌組)的診斷結(jié)果圖，以及在判別肝硬化組和肝癌組的診斷結(jié)果圖。圖6顯示實(shí)施例3中甘氨膽酸(GCA)、色氨酸(Tryptophan)、尿苷(Uridine)、膽堿(Choline)、苯甲酰胺(Benzamide)、溶血磷脂酰膽堿16：1(LPC(16：1)、組氨酸(Histidine)和苯丙氨酰色氨酸(Phenylalanyl-Tryptophan)在各實(shí)驗(yàn)組的檢測濃度值。圖7顯示實(shí)施例3中各組合標(biāo)志物在各個批次實(shí)驗(yàn)中判別健康對照組和肝病組(肝硬化和肝癌組)的診斷結(jié)果圖，以及在判別肝硬化組和肝癌組的診斷結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面參照具體的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明并不限于這些具體的實(shí)施例。實(shí)施例11.血清樣品收集采集前，納入志愿者簽署知情同意書。正常對照、肝硬化和原發(fā)性肝癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：參考《黃家駟外科學(xué)(第7版)》人民衛(wèi)生出版社2008北京健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：正常體檢人群(40-70歲之間)。體檢身體健康者。相同條件下采用血清樣本：40例正常人、79例肝硬化和80例肝癌患者的血清樣本；入院后24小時內(nèi)留取患者空腹抗凝血及促凝血各4ml，半小時之內(nèi)分離血清，置于-80℃冰箱保存，備檢。2.分析方法2.1血清樣本預(yù)處理血樣在4℃下解凍，取80μL血清樣本，加入320μL含有多個內(nèi)標(biāo)的乙腈提取液沉淀蛋白：渦旋30-90s，靜置15-30mins后，4℃條件下10000-14000rpm轉(zhuǎn)速離心10-15mins，取上清冷凍干燥。提取液中加入的內(nèi)標(biāo)及相應(yīng)的濃度見表2。2.2超高效液相色譜質(zhì)譜分析(1)液相條件：色譜儀為WatersAcQuity超高效液相色譜(Waters，Ireland)；正離子模式：色譜柱為WatersACQUITYUPLC@BEHC8(1.7um，2.1mmX100mm)(Waters，Ireland)；流動相A為流動相：A相為含0.1％(v/v)甲酸水溶液，B相為0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；洗脫梯度：初始流動相為10％B相，0-3min線性變化到40％B相，3min-15min線性變化到100％B，相保持5min，0.1min內(nèi)線性降至2％B相平衡3mins；柱溫為50℃；流動相流速為0.35mL/min；進(jìn)樣量為5μL。負(fù)離子模式：色譜柱為WatersACQUITYUPLC@HSST3(1.7um，2.1mmX100mm)(Waters，Ireland)；流動相A為流動相：A相為含5mM的碳酸氫銨水溶液，B相為含5mM的碳酸氫銨的甲醇溶液；洗脫梯度：初始流動相為2％B相，0-3min線性變化到40％B相，3min-12min線性變化到100％B，相保持4min，0.1min內(nèi)線性降至2％B相平衡4mins；柱溫為50℃；流動相流速為0.35mL/min；進(jìn)樣量為5μL。實(shí)際應(yīng)用時流動相梯度總時間可以適當(dāng)?shù)目s短，以減少檢測的時間。(2)質(zhì)譜條件：質(zhì)譜為QTRAP5500質(zhì)譜(美國ABSciex公司)。氣簾氣壓力為0.241MPa，Gas1、Gas2壓力均為0.276Mpa，正離子模式電噴霧離子源溫度為550℃，噴霧電壓為5500V；負(fù)離子模式電噴霧離子源溫度為450℃，噴霧電壓為-4500V；待檢測的離子對及其相關(guān)的碰撞電壓見表1。2.3血清測試結(jié)果及輔助診斷方法各組人群中色氨酸、尿苷、膽堿、苯甲酰胺、LPC(16：1)、組氨酸和苯丙氨酰色氨酸，甘氨膽酸含量值見圖2和表3。同時，將各標(biāo)志物的含量(表3)帶入對應(yīng)的回歸方程式(及，式1或式2)中，計(jì)算出概率，概率值及分布見圖3。采用的截點(diǎn)值為0.5，即概率大于0.5則認(rèn)為是肝病或肝癌，模型I在對正常人和肝病的診斷中，其正確診斷率分別為97.5％(39/40)、97.5％(155/159)；模型II在對肝硬化和肝癌診斷中，其正確診斷率為96.2％(76/79)、97.5％(78/80)，組合標(biāo)志物的AUC＝0.947，靈敏度和特異性也比較高，分別為94.9％和85.4％(圖3)。實(shí)施例2為了驗(yàn)證組合標(biāo)志物對早期肝癌診斷的穩(wěn)定性和可靠性，加入了肝癌中腫瘤直徑小的小肝癌樣本進(jìn)行驗(yàn)證。此次實(shí)驗(yàn)所用分析方法、儀器和試劑都和實(shí)施例1中的完全一致。1.血清樣品收集采集前，納入志愿者簽署知情同意書。正常對照、肝硬化和原發(fā)性肝癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：參考《黃家駟外科學(xué)(第7版)》人民衛(wèi)生出版社2008北京健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：正常體檢人群(40-70歲之間)。體檢身體健康者。相同條件下采用血清樣本：40例正常人、65例肝硬化和75例小肝癌患者和29例大肝癌患者的血清樣本；入院后24小時內(nèi)留取患者空腹抗凝血及促凝血各4ml，半小時之內(nèi)分離血清，置于-80℃冰箱保存，備檢。2.血清測試及輔助診斷結(jié)果相對于非肝癌組，色氨酸、尿苷、膽堿、苯甲酰胺、LPC(16：1)、組氨酸和苯丙氨酰色氨酸顯著性下降(見圖4和表4)。同時，將各標(biāo)志物的含量(表4)帶入對應(yīng)的回歸方程式中，計(jì)算出概率(概率值及分布見圖5)，采用的截點(diǎn)值值為0.5，即概率大于0.5則認(rèn)為是肝病或肝癌或小肝癌，模型I在對正常人和肝病的診斷中，其正確診斷率分別為75％(30/40)、98.8％(2/169)，模型II在對肝硬化和肝癌診斷中，其正確診斷率為93.8％(61/65)、96.2％(100/104)，其中小肝癌的診斷正確率達(dá)96％(72/75)，可見，該組合標(biāo)準(zhǔn)物對于小粒徑的肝癌腫瘤的正確診斷也很高；同時在肝癌患者中有42例病人是AFP假陰性，即血清甲胎蛋白(AFP)的濃度低于20ug/mL(截點(diǎn)值)，而使用模型II判別，這42人中僅有1人的Prob’(肝癌)＜0.5(截點(diǎn)值)；另一方面，在肝癌患者中有4例病人的Prob’(肝癌)＜0.5，而這4人中僅1人的(AFP)的濃度低于20ug/mL，可見新的組合標(biāo)志物可以與傳統(tǒng)的血清標(biāo)志物AFP在診斷早期肝癌時具有良好的互補(bǔ)性(圖5)。實(shí)施例3為了驗(yàn)證組合標(biāo)志物對早期肝癌診斷的穩(wěn)定性和可靠性，加入了與實(shí)施例1、2不同地域的肝癌患者進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)II。此次實(shí)驗(yàn)所用分析方法、儀器和試劑都和實(shí)施例1中的完全一致。1.血清樣品收集采集前，納入志愿者簽署知情同意書。正常對照、肝硬化和原發(fā)性肝癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：參考《黃家駟外科學(xué)(第7版)》人民衛(wèi)生出版社2008北京健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：正常體檢人群(40-70歲之間)。體檢身體健康者。相同條件下采用血清樣本：31例正常人、48例肝硬化和92例大肝癌患者的血清樣本；入院后24小時內(nèi)留取患者空腹抗凝血及促凝血各4ml，半小時之內(nèi)分離血清，置于-80℃冰箱保存，備檢。2.血清測試及輔助診斷結(jié)果相對于非肝癌組，色氨酸、尿苷、膽堿、苯甲酰胺、LPC(16：1)、組氨酸，苯丙氨酰色氨酸及甘氨膽酸顯著性下降(見圖6和表5)。同時，將各標(biāo)志物的含量(表5)帶入對應(yīng)的回歸方程式中，計(jì)算出概率，概率值及分布見圖7。采用的截點(diǎn)值為0.5，即概率大于0.5則認(rèn)為是肝病或肝癌，模型I在對正常人和肝病的診斷中，其正確診斷率分別為77.1％(24/31)、95.4％(134/140)；模型II在對肝硬化和肝癌診斷中，其正確診斷率為56.3％(27/48)、80.8％(84/92)。同時，在肝癌患者中有36例病人呈AFP假陰性，即血清甲胎蛋白(AFP)的濃度低于20ug/mL(截點(diǎn)值)，而使用模型II判斷，這36人中僅有4人的Prob’(肝癌)＜0.5(截點(diǎn)值)；另一方面，在肝癌患者中有8例病人的Prob’(肝癌)＜0.5，而這8人中有4人的(AFP)的濃度低于20ug/mL，可見新的組合標(biāo)志物與傳統(tǒng)的血清標(biāo)志物AFP在診斷早期肝癌時具有良好的互補(bǔ)性(圖7)。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意組合。參考文獻(xiàn)[1]JeremyK.Nicholsonetal.Host-GutMicrobiotaMetabolicInteractions，Science336，1262(2012)[2]Z.Wangetal.Thegutmicrobiotain2011：Translatingthemicrobiotatomedicine，Nature472，57(2011).[3]F.P.Martinetal.，DietaryModulationofGutFunctionalEcologyStudiedbyFecalMetabonomicsJ.ProteomeRes.9，5284(2010)[4]Takikawa，Oetal.Mechanismofinterferon-gammaaction-characterizationofindoleamine2，3-dioxygenaseinculturedhumancellsinducedbyinterferon-gammaandevaluationoftheenzyme-mediatedtryptophandegradationinitsanticellularactivity.J.Biol.Chem.1988，263(4)，2041-2048[5]Uyttenhove，Cetal.Evidenceforatumoralimmuneresistancemechanismbasedontryptophandegradationbyindoleamine2，3-dioxygenase.Nat.Med.2003，9(10)，1269-1274[6]WatanabeM，etal.Consequencesoflowplasmahistidineinchronickidneydiseasepatients：associationswithinflammation，oxidativestress，andmortality.AmJClinNutr.2008Jun；87(6)：1860-6[7]Hung，N.Detal.Preventionof1-palmitoyllysophosphatidylcholine-inducedinflammationbypolyunsaturatedacyllysophosphatidylcholine.Inflamm.Res.2012，61(5)，473-383.Huang，L.S.；[8]Hung，N.D.etal.Lysophosphatidylcholinecontainingdocosahexaenoicacidatthesn-1positionisantiinflammatory.Lipids2010，45(3)，225-236。