一種原料乳中乳過氧化物酶的試紙檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種原料乳中乳過氧化物酶的試紙檢測(cè)方法，該方法包括配制反應(yīng)試劑、試紙反應(yīng)、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立及乳樣檢測(cè)等步驟。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：檢測(cè)速度快，最快可在幾秒鐘完成對(duì)乳過氧化物酶的定性檢測(cè)，3分鐘即可定量測(cè)定原料乳中的乳過氧化物酶含量，適合乳過氧化物酶的在線檢測(cè)，并且檢測(cè)費(fèi)用低，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，最低檢出濃度為1-2mg/L，環(huán)境要求低，檢測(cè)操作簡(jiǎn)便。
【專利說明】一種原料乳中乳過氧化物酶的試紙檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生化檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種原料乳中乳過氧化物酶的分析測(cè)試方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 乳過氧化物酶（Lactoperoxidase, LP)是過氧化物酶類的一種，由一條多肽鏈構(gòu) 成，包括612個(gè)氨基酸殘基，分子量大約是78kDa,該酶是一個(gè)依賴于過氧化氫（H2O2)的氧 化還原酶類，作為乳液中的內(nèi)源酶之一，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的乳腺、唾液腺、淚腺及其分 泌物中。在牛乳中，LP是含量?jī)H次于黃嘌呤氧化酶的酶，它在乳中的濃度大約是30mg/L。 LP熱穩(wěn)定性相對(duì)較高，de Wit等發(fā)現(xiàn)牛奶中LP徹底失活，需要在78°C持續(xù)15s ;Marks等 證明了普通的巴氏滅菌法并不能使牛奶中的LP失活，經(jīng)72°C持續(xù)15s的巴氏滅菌后仍有活 性。因此，可通過檢測(cè)LP活力，掌握乳品的熱處理情況。
[0003] 國(guó)內(nèi)外對(duì)乳過氧化物酶檢測(cè)的研究較多，ABTS、TMB、愈創(chuàng)木酚等常用于檢測(cè)LP?，F(xiàn) 有的檢測(cè)方法都是借助大型儀器測(cè)定酶活性與酶濃度，方法的準(zhǔn)確度、靈敏度均較高，但由 于需借助大型儀器，不適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。目前，鑒于乳過氧化物酶的儀器檢測(cè)方法，需對(duì)樣 品進(jìn)行復(fù)雜前處理且處理時(shí)間長(zhǎng)、無法實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)等缺點(diǎn)。因此，開發(fā)快速、靈敏、準(zhǔn)確檢 測(cè)乳過氧化物酶含量的關(guān)鍵技術(shù)，用于原料乳驗(yàn)收及其乳制品加工，具有重要理論研究?jī)r(jià) 值和實(shí)際意義。本發(fā)明利用酶促顯色反應(yīng)原理，利用四甲基聯(lián)苯胺（TMB)為顯色底物，優(yōu)化 檢測(cè)試紙的最佳制備條件，研制出一種簡(jiǎn)便、快速、精確的乳過氧化酶試紙檢測(cè)方法，以滿 足實(shí)際現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)乳過氧化酶的加工需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的乳過氧化物酶含量的分析測(cè)試方法中存在的操 作繁瑣且需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作、或成本高、或無法實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)等問題，提供一種 快速、便捷的乳過氧化物酶的檢測(cè)方法。
[0005] 實(shí)現(xiàn)上述目的的本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0006] 一種原料乳中乳過氧化物酶的試紙檢測(cè)法，該方法包括以下步驟：
[0007] (1)配制試紙浸泡液：分別配制pH值為4. 0?6. 0的0? lmol/L朽1檬酸-〇? 2mol/L 磷酸氫二鈉緩沖溶液、濃度為l〇-25mmol/L的TMB溶液以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1% -1. 0%的表 面活性劑溶液；將上述配制好的三種溶液按照緩沖溶液：TMB溶液：表面活性劑溶液體積比 =30-50:0. 5-2:1-3,優(yōu)選按照體積比40:1:2混合混勻，即為試紙浸泡液；
[0008] ⑵配制過氧化氫（H2O2)溶液：配制濃度為0? 5-1. Ommol/L的H2O2溶液；
[0009] (3)試紙的制作：將裁剪好的濾紙條在步驟⑴配制的試紙浸泡液中，浸泡 1?3分鐘，完全浸透后，放在平皿上抽真空干燥，制得乳過氧化物酶檢測(cè)試紙，為提 高試紙的穩(wěn)定性，干燥后的試紙裁去邊緣0. 5cm，將處理好的顯色試紙切割成規(guī)格為 0. 2-0. 8cmX0. 2-0. 8cm的試紙片，作為反應(yīng)區(qū)黏接在準(zhǔn)備好的PVC膠版上，即制成乳過氧 化物酶檢測(cè)試紙；
[0010] ⑷試紙檢測(cè)：在步驟⑶中制備好的檢測(cè)試紙上，先滴加3 iiL步驟⑵配制好 的H2O2溶液，再滴加3 y L待檢測(cè)乳樣品，反應(yīng)l-7min后，目測(cè)或使用便攜式光電測(cè)色儀或 其他任何可采集樣品顏色信息的儀器，記錄試紙顏色信息變化；
[0011] (5)標(biāo)準(zhǔn)的建立：配制濃度范圍在0_25mg/L的標(biāo)準(zhǔn)乳過氧化物酶樣品，按照步驟 (4)的方法，采用測(cè)定吸光度值或與之等效的方法，制作標(biāo)準(zhǔn)比色卡，或建立反應(yīng)過程中的 顏色變化信息與乳過氧化物酶濃度之間固定的函數(shù)關(guān)系，作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；
[0012] (6)檢測(cè)：將步驟⑷采集的顏色變化信息與步驟（5)獲得的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較， 獲得所測(cè)乳樣中的乳過氧化物酶的濃度。
[0013] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟（1)所述的0. lmol/L檸檬酸-0. 2mol/L磷 酸氫二鈉緩沖液pH值為5. 0。
[0014] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟（1)所述的TMB溶液濃度為22mmol/L。
[0015] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟（1)所述的表面活性劑為Tween-20、 Triton、CTAB或SDS中的至少一種。更優(yōu)選的，步驟（1)所述的表面活性劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0? 5 %的Tween-20或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0? 3 %的CTAB。
[0016] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟（2)所述的H2O2濃度為0. 6mmol/L。
[0017] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟（3)所述試紙為快速、中速、慢速定性濾紙 或者快速、中速、慢速定量濾紙，更優(yōu)選為中速定量濾紙。
[0018] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟（4)中試紙檢測(cè)時(shí)間為反應(yīng)3min。
[0019] 采用本發(fā)明所述的方法對(duì)原料乳中乳過氧化物酶進(jìn)行檢測(cè)，其最低檢測(cè)濃度為 卜2mg/L〇
[0020] 相對(duì)于現(xiàn)有的技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 1、檢測(cè)速度快，最快幾秒鐘試紙由白色變?yōu)闇\黃綠色，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)乳過氧化物酶 進(jìn)行定性檢測(cè)；3min即可定量測(cè)定乳中乳過氧化物酶的濃度，適合在線檢測(cè)；
[0022] 2、檢測(cè)費(fèi)用低，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，試紙法能檢出的最低乳樣中乳過氧化物酶濃度為 l-2mg/L，該檢測(cè)法性價(jià)比高；
[0023] 3、環(huán)境要求低，檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，建立好標(biāo)準(zhǔn)后，在試紙上滴加H2O2溶液后，試紙與 乳樣反應(yīng)即可，操作人員無需專門培訓(xùn)，易普及；
[0024] 4、乳過氧化物酶檢測(cè)試紙，其檢測(cè)精密度在3% -7%，說明該試紙法具有較好的 精密度；
[0025] 5、乳過氧化物酶試紙檢測(cè)法與TMB試管檢測(cè)法相關(guān)性較好，其相關(guān)系數(shù)為0. 983。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為反光值與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系曲線；
[0027] 注：同一曲線標(biāo)注無相同字母者差異顯著（p〈0. 05)
[0028] 圖2為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液pH值對(duì)顯色反應(yīng)的影響；
[0029] 注：同一曲線標(biāo)注無相同字母者差異顯著（p〈0. 05)
[0030] 圖3為不同濃度TMB對(duì)顯色反應(yīng)的影響；
[0031] 注：同一曲線標(biāo)注無相同字母者差異顯著（p〈〇. 05)
[0032] 圖4表面活性劑的篩選；
[0033] 注：同一曲線標(biāo)注無相同字母者差異顯著（p〈0. 05)
[0034] SDS:十二烷基硫酸鈉；T20 :Tween-20 ;CTAB :十六烷基三甲基溴化銨；TlOO : TritionX-IOO ；
[0035] 圖5為不同濃度過氧化氫對(duì)反應(yīng)的影響；
[0036] 注：同一曲線標(biāo)注無相同字母者差異顯著（p〈0. 05)
[0037] 圖6為乳過氧化物酶濃度與反光值的關(guān)系曲線；
[0038] 注：同一曲線標(biāo)注無相同字母者差異顯著（p〈0. 05)
[0039] 圖7為試紙檢測(cè)法最低檢出濃度；
[0040] 注：同一曲線標(biāo)注無相同字母者差異顯著（p〈〇. 05)
[0041] 圖8為試紙檢測(cè)法與TMB試管法檢測(cè)乳過氧化物酶濃度相關(guān)性。

【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0043] 實(shí)施例1乳過氧化物酶的快速檢測(cè)
[0044] 本實(shí)施方式原料乳中乳過氧化物酶的試紙檢測(cè)方法按照以下步驟進(jìn)行：
[0045] (1)配制試紙浸泡液：分別配制pH為5. 0的0? lmol/L檸檬酸-0? 2mol/L磷酸氫二 鈉緩沖溶液、濃度為22mmol/L的TMB溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的Tween-20溶液；將上述配制 好的三種溶液按照緩沖溶液=TMB溶液：表面活性劑溶液體積比=40:1:2混合，振蕩3min 混勻，即為試紙浸泡液；
[0046] (2)配制H2O2溶液：配制濃度為0? 6mmol/L的H2O2溶液。
[0047] (3)試紙的制作：將裁剪好的中速定量濾紙條（3cmX5cm)在步驟⑴配制的浸泡 液中，浸泡1?3分鐘，完全浸透后，放在平皿上抽真空干燥，制得乳過氧化物酶檢測(cè)試紙， 為提高試紙的穩(wěn)定性，干燥后的試紙裁去邊緣0.5cm，將處理好的顯色試紙切割成規(guī)格為 0. 5cmX0. 5cm的試紙片，作為反應(yīng)區(qū)黏接在準(zhǔn)備好的PVC膠版上，即制成乳過氧化物酶檢 測(cè)試紙。
[0048] (4)試紙檢測(cè)：在步驟⑶中制備好的檢測(cè)試紙上，先滴加3 y L步驟⑵配制好 的H2O2溶液，再滴加3 y L待檢測(cè)乳樣品，反應(yīng)3min后，目測(cè)或使用便攜式光電測(cè)色儀或其 他任何可采集樣品顏色信息的儀器，記錄試紙顏色信息變化；
[0049] (5)標(biāo)準(zhǔn)的建立：配制濃度為0、5、10、15、20、25mg/L的標(biāo)準(zhǔn)乳過氧化物酶樣品，按 照步驟（4)的方法，采用測(cè)定吸光度值或與之等效的方法，制作標(biāo)準(zhǔn)比色卡，或建立反應(yīng)過 程中的顏色變化信息與乳過氧化物酶濃度之間固定的函數(shù)關(guān)系，作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；
[0050] (6)檢測(cè)：將步驟⑷采集的顏色變化信息與步驟（5)獲得的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較， 獲得所測(cè)乳樣中的乳過氧化物酶濃度。
[0051] 本實(shí)施方式中步驟（5)建立標(biāo)準(zhǔn)的操作只需一次，標(biāo)準(zhǔn)建立后，以后的每次檢測(cè) 僅需與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較即可。
[0052] 實(shí)施例2乳過氧化物酶的快速檢測(cè)
[0053] 本實(shí)施方式原料乳中乳過氧化物酶的分析測(cè)試方法按照以下步驟進(jìn)行：
[0054] (1)配制試紙浸泡液：分別配制pH為4. 8的0? lmol/L檸檬酸-0? 2mol/L磷酸氫二 鈉緩沖溶液、濃度為20mmol/L的TMB溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 3%的CTAB溶液；將上述配制好的 三種溶液按照緩沖溶液：TMB溶液：表面活性劑溶液體積比=45:1. 5:1混合，振蕩3min混 勻，即為試紙浸泡液；
[0055] (2)配制H2O2溶液：配制濃度為0? 8mmol/L的H2O2溶液。
[0056] (3)試紙的制作：將裁剪好的中速定量濾紙條（3cmX5cm)在步驟⑴配制的浸泡 液中浸泡1?3分鐘，完全浸透后，放在平皿上抽真空干燥，制得乳過氧化物酶檢測(cè)試紙， 為提高試紙的穩(wěn)定性，干燥后的試紙裁去邊緣0.5cm，將處理好的顯色試紙切割成規(guī)格為 0. 5cmX0. 5cm的試紙片，作為反應(yīng)區(qū)黏接在準(zhǔn)備好的PVC膠版上，即制成乳過氧化物酶檢 測(cè)試紙。
[0057] (4)試紙檢測(cè)：在步驟⑶中制備好的檢測(cè)試紙上，先滴加3 y L步驟⑵配制好 的H2O2溶液，再滴加3 y L待檢測(cè)乳樣品，反應(yīng)3min后，目測(cè)或使用便攜式光電測(cè)色儀或其 他任何可采集樣品顏色信息的儀器，記錄試紙顏色信息變化；
[0058] (5)標(biāo)準(zhǔn)的建立：配制濃度為0、5、10、15、20、25mg/L的標(biāo)準(zhǔn)乳過氧化物酶樣品，按 照步驟（4)的方法，采用測(cè)定吸光度值或與之等效的方法，制作標(biāo)準(zhǔn)比色卡，或建立反應(yīng)過 程中的顏色變化信息與乳過氧化物酶濃度之間固定的函數(shù)關(guān)系，作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；
[0059] (6)檢測(cè)：將步驟⑷采集的顏色變化信息與步驟（5)獲得的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較， 獲得所測(cè)乳樣中的乳過氧化物酶濃度。
[0060] 本實(shí)施方式中步驟（5)建立標(biāo)準(zhǔn)的操作只需要一次，標(biāo)準(zhǔn)建立后，以后的每次檢 測(cè)僅需與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較即可。
[0061] 試驗(yàn)例1不同試紙載體對(duì)顯色反應(yīng)的影響
[0062] 選用快、中、慢速定量濾紙；快、中、慢定性濾紙為試紙載體，浸入試紙浸泡液中，浸 泡Imin后取出，放在平皿上抽真空烘干。測(cè)定不同試紙載體對(duì)顯色反應(yīng)的影響。以不同紙 張的吸水力、顯色能力以及顏色分布的均勻程度為依據(jù)，選擇最好的紙張作為制作試紙的 載體。其余步驟同實(shí)施例1。
[0063] 不同試紙載體對(duì)顯色反應(yīng)的影響見表1。由表1可見，快速定量濾紙與快速定性濾 紙的吸水能力都較強(qiáng)，但在顯色能力及顏色分布上存在一定欠缺陷；慢速定量濾紙與慢速 定性濾紙的吸水能力較差、顏色分布不均勻。中速定量濾紙的吸水能力強(qiáng)，顯色效果好，且 顏色分布均勻?；谝陨辖Y(jié)果，所以本發(fā)明優(yōu)選采用中速定量濾紙為試紙載體。
[0064] 表1試紙載體的選擇
[0065]

【權(quán)利要求】
1. 一種原料乳中乳過氧化物酶的試紙檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1)配制試紙浸泡液：分別配制pH值為4. 0?6. 0的0? lmol/L朽1檬酸-0? 2mol/L磷 酸氫二鈉緩沖溶液、濃度為l〇-25mmol/L的TMB溶液以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1% -1. 0%的表面 活性劑溶液；將上述配制好的三種溶液按照緩沖溶液：TMB溶液：表面活性劑溶液體積比= 30-50:0. 5-2:1-3,優(yōu)選按照體積比40:1:2混合混勻，即為試紙浸泡液； ⑵配制過氧化氫（H202)溶液：配制濃度為0? 5-1. Ommol/L的H202溶液； (3) 試紙的制作：將裁剪好的濾紙條在步驟（1)配制的試紙浸泡液中，浸泡1?3分鐘， 完全浸透后，放在平皿上抽真空干燥，制得乳過氧化物酶檢測(cè)試紙，為提高試紙的穩(wěn)定性， 干燥后的試紙裁去邊緣〇. 5cm，將處理好的顯色試紙切割成規(guī)格為0. 2-0. 8cmX0. 2-0. 8cm 的試紙片，作為反應(yīng)區(qū)黏接在準(zhǔn)備好的PVC膠版上，即制成乳過氧化物酶檢測(cè)試紙； (4) 試紙檢測(cè)：在步驟（3)中制備好的檢測(cè)試紙上，先滴加3 yL步驟⑵配制好的H202溶液，再滴加3 y L待檢測(cè)乳樣品，反應(yīng)l-7min后，目測(cè)或使用便攜式光電測(cè)色儀或其他任 何可采集樣品顏色信息的儀器，記錄試紙顏色信息變化； (5) 標(biāo)準(zhǔn)的建立：配制濃度范圍在0-25mg/L的標(biāo)準(zhǔn)乳過氧化物酶樣品，按照步驟（4) 的方法，采用測(cè)定吸光度值或與之等效的方法，制作標(biāo)準(zhǔn)比色卡，或建立反應(yīng)過程中的顏色 變化信息與乳過氧化物酶濃度之間固定的函數(shù)關(guān)系，作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)； (6) 檢測(cè)：將步驟（4)采集的顏色變化信息與步驟（5)獲得的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，獲得 所測(cè)乳樣中的乳過氧化物酶的濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)所述的0. lmol/L檸檬酸-0. 2mol/ L磷酸氫二鈉緩沖液的pH值為5. 0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟⑴所述的TMB溶液濃度為22mmol/ L〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)所述的表面活性劑為Tween-20、 TritonX-100、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)或十二烷基硫酸鈉（SDS)中的至少一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟（1)所述的表面活性劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0? 5 %的Tween-20或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0? 3 %的CTAB。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2)所述的H202濃度為0. 6mmol/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3)所述試紙為快速、中速、慢速定性 濾紙或者快速、中速、慢速定量濾紙。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于步驟（3)所述試紙為中速定量濾紙。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4)中試紙檢測(cè)時(shí)間為反應(yīng)3min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測(cè)試紙對(duì)原料乳中乳過氧化物酶的最 低檢測(cè)濃度為l_2mg/L。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104406977SQ201410798199
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】姜瞻梅, 許曉曦, 車紅霞, 劉麗麗, 辛巖 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)