結(jié)核分枝桿菌tb-sa抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒及其制備方法，檢測(cè)試劑盒由試紙條和加樣緩沖液組成，試紙條由檢測(cè)線包被有TB-SA抗原、質(zhì)控線包被有羊抗人多抗的硝酸纖維素膜、膠體金標(biāo)記的SPA蛋白吸附在聚酯膜上的金標(biāo)墊、樣品墊和吸水紙組成。加樣緩沖液為含有表面活性劑的PB溶液。檢測(cè)試劑盒的制備方法包括試紙條的制備和加樣緩沖液的制備。本發(fā)明結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、成本低廉、特異性好和靈敏度高的特點(diǎn)，測(cè)試結(jié)果在5到15分鐘內(nèi)讀取。制備該試劑盒的方法操作簡(jiǎn)單，制備方便、適宜于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒及其制備方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗體檢測(cè)試劑盒及其制備方法，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌 TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病、艾滋病與瘧疾一起，被視為至今影響全球公共衛(wèi)生的三大疾病，結(jié)核病是 我國(guó)重點(diǎn)控制的重大疾病之一，也是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。
[0003] 據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO)和全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示：目前全球有近 1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年有約800萬(wàn)新病例發(fā)生，接近300萬(wàn)人死于該病。中國(guó) 是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病患者數(shù)量居世界第二位。目前有肺結(jié)核病人 約450萬(wàn)，結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約130萬(wàn)，我國(guó)肺結(jié)核的發(fā)病率為459/10萬(wàn)人，占全球發(fā)病的 14. 3%，每年因結(jié)核病死亡人數(shù)達(dá)13萬(wàn)，大大超過(guò)其他傳染病死亡人數(shù)的總和。
[0004] 結(jié)核病是人畜共患傳染病，可感染各個(gè)階段的人群，第五次流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨 著年齡的增長(zhǎng)，結(jié)核病人的發(fā)病率增加。有報(bào)道顯示，一個(gè)傳染性結(jié)核病人一年內(nèi)可能傳染 10?15人。面對(duì)如此嚴(yán)峻的形勢(shì)，我們應(yīng)該及早采取措施。結(jié)核病的早期診斷及有效治療 是結(jié)核病預(yù)防工作的重中之重，對(duì)于控制結(jié)核菌傳播有著重要的臨床意義。目前國(guó)內(nèi)大多 數(shù)醫(yī)院根據(jù)直接涂片鏡檢和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù)對(duì)活動(dòng)性結(jié)合進(jìn)行診斷。結(jié)核菌涂片檢 測(cè)雖然簡(jiǎn)單易行且準(zhǔn)確性高，但陽(yáng)性率低。結(jié)核菌培養(yǎng)檢測(cè)可信度高，但耗時(shí)較長(zhǎng)，不能滿(mǎn) 足臨床需求。此外，結(jié)核菌素皮試（PPD)試驗(yàn)所用抗原為結(jié)核分枝桿菌粗提的抗原混合物， 和許多非結(jié)核分枝桿菌及卡介苗（BCG)均存在共同抗原成分，從而導(dǎo)致該法用于結(jié)核病診 斷特異性差。中國(guó)是結(jié)核病高度流行區(qū)，由于廣泛接種BCG，也造成PH)實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性率很高， 所以臨床上只能根據(jù)pro實(shí)驗(yàn)皮膚的反應(yīng)強(qiáng)弱給予輔助診斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的即在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可快速定性檢測(cè)樣本中的結(jié) 核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒的制 備方法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法 檢測(cè)試劑盒，它由試紙條和加樣緩沖液組成，所述試紙條所述試紙條包括包被有TB-SA抗 原、質(zhì)控線包被有羊抗人多抗的硝酸纖維素膜、膠體金標(biāo)記的SPA蛋白吸附在聚酯膜上的 金標(biāo)塾、樣品塾和吸水紙；
[0008] 所述結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗原為無(wú)色透明液體，濃度大于2mg/ml，用SDS-PAGE測(cè) 定；
[0009] 所述羊抗人多抗為無(wú)色透明液體，濃度大于2mg/ml;
[0010] 所述SPA蛋白為無(wú)色透明液體，濃度大于2mg/ml;
[0011] 所述加樣緩沖液為含有〇. 5g/ml表面活性劑TWEEN-20的PB溶液。
[0012] 結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒的制備方法，它包括以下步驟：
[0013]SL試紙條的制備：
[0014]SlL反應(yīng)膜的制備：用磷酸鹽緩沖液將結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗原稀釋到包被濃度 I.Omg/ml，將羊抗人多抗體稀釋至包被濃度為I. 5mg/ml，用劃膜噴金標(biāo)機(jī)將兩種溶液分別 劃到硝酸纖維膜上，將膜干燥后保存；
[0015]S12.金結(jié)合墊的制備：將濃度為0. 5mg/ml的SPA蛋白將膠體金進(jìn)行標(biāo)記，以轉(zhuǎn)速 為12000r/min離心30min，棄上清，加入膠體金結(jié)合物稀釋液至原體積的1/10,然后浸潤(rùn)裁 切好的聚酯膜，制備成金結(jié)合墊；
[0016]S13.組裝切條：在反應(yīng)膜所在的PVC底板上揭去2.Ocm不干膠，粘貼上吸水紙，使 紙下部壓住反應(yīng)膜，揭去底板上的I. 7cm不干膠，分別粘貼上金結(jié)合墊和樣品墊，金結(jié)合墊 的上部壓住反應(yīng)膜1mm，樣品墊上部壓住金結(jié)合墊下部1mm，組裝好后，用切條機(jī)將試紙切 成3. 5?3. 7謹(jǐn)試紙條，包裝；
[0017] S2.加樣緩沖液的制備：稱(chēng)取表面活性劑TWEEN-20,用20mMPB緩沖液溶解至濃度 為0· 5g/ml。
[0018] 進(jìn)一步地，步驟Sl所述干燥溫度為35?40°C，干燥時(shí)間為115?125min。
[0019] 本發(fā)明中所述步驟S13所述包裝可以為桶裝或卡盒裝，裸條試紙為桶裝，卡盒裝 試紙條進(jìn)行塑封后盒裝。
[0020] 本發(fā)明的試劑盒的檢測(cè)原理為：本發(fā)明試劑盒系用純化的結(jié)核分枝桿菌分泌型 TB-SA抗原和抗人IgG分別固定于硝酸纖維素膜上，以膠體金標(biāo)記SPA蛋白，米用膜免疫層 析技術(shù)原理制備成。
[0021] 測(cè)試時(shí)，標(biāo)本和緩沖液等在毛細(xì)效應(yīng)下向另一方移動(dòng)，標(biāo)本中的成分IgG流經(jīng)檢 測(cè)區(qū)（T線，包被TB-SA蛋白），如果標(biāo)本中含有抗TB-SA的抗體，則抗TB-SA的抗體（IgG) 就和T線上的TB-SA蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合，隨后而來(lái)的膠體金標(biāo)記SPA蛋白與TB-SA的抗 體（IgG)結(jié)合，并被固定在T線，形成一條紅色條帶。如果標(biāo)本中不含有抗TB-SA的抗體， 則無(wú)相關(guān)的的IgG結(jié)合在T線上，隨后而來(lái)的膠體金標(biāo)記SPA蛋白也不與T線上的物質(zhì)反 應(yīng)，從而不顯色出現(xiàn)。質(zhì)控區(qū)內(nèi)（C線，包被抗人IgG)所顯示的紅色條帶是判定層析過(guò)程是 否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。
[0022] 本發(fā)明的檢測(cè)樣本可以采用肝素、EDTA-鉀、檸檬酸三鈉作為抗凝劑。沒(méi)有使用抗 凝劑的全血標(biāo)本需立即使用，若果全血發(fā)生凝集現(xiàn)象，則不能用該標(biāo)本做全血標(biāo)本檢測(cè)看， 可使用其血清標(biāo)本檢測(cè)。
[0023] 本發(fā)明結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法為：
[0024] 使用前將試劑和血清、全血等標(biāo)本恢復(fù)至室溫（20_30°C)。
[0025] 1.從包裝盒取出試劑，在1小時(shí)內(nèi)應(yīng)盡快地使用，特別是在室溫高于30°C或在高 度潮濕的環(huán)境中。
[0026] 2.將試紙條平放在操作臺(tái)面上，做好標(biāo)識(shí)，取2μ1血清標(biāo)本或全血加在試劑條的 加樣處（前端加樣），輕輕接觸膜面，使樣本擴(kuò)散到膜面上。
[0027] 3.盡快在試紙條的后端緩慢加入緩沖液2-3滴，見(jiàn)有液體流到膜面計(jì)時(shí)開(kāi)始。
[0028] 4.等待紅色條帶的出現(xiàn)，測(cè)試結(jié)果在5分鐘后15分鐘內(nèi)讀取。
[0029] 檢測(cè)結(jié)果：
[0030] 陽(yáng)性⑴：兩條紅色條帶出現(xiàn)。一條位于檢測(cè)區(qū)（T)，另一條位于質(zhì)控區(qū)（C)。表 明結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體陽(yáng)性。
[0031] 陰性:僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶，在檢測(cè)區(qū)（T)內(nèi)無(wú)紫紅色條帶出現(xiàn)。表明 結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體陰性。
[0032] 無(wú)效：質(zhì)控區(qū)（C)未出現(xiàn)紅色條帶。
[0033] 本發(fā)明的有益效果是：結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒具有快速、 簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和靈敏度高的特點(diǎn)，測(cè)試結(jié)果在5到15分鐘內(nèi)讀取。本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌 TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)。制備 該試劑盒的方法操作簡(jiǎn)單，制備方便、適宜于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所 述：
[0035] 實(shí)施例1 :反應(yīng)條件的確定
[0036] 免疫層析膠體金檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程主要涉及三個(gè)方面的組合匹配，分別是：金標(biāo)結(jié)合 物的制備、檢測(cè)線和質(zhì)控線的包被、硝酸纖維素膜的選擇。
[0037] 1.金標(biāo)結(jié)合物制備的確定
[0038] 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，整個(gè)過(guò)程分為膠體金的制備、標(biāo)記、封閉、離心濃縮和噴涂等過(guò)程， 各個(gè)過(guò)程條件確定如下：
[0039] 膠體金的制備：采用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備，具體的制備工藝確定如下 ：
[0040] 配制：1 %氯金酸溶液、1 %檸檬酸三鈉溶液。
[0041] 制備：在裝有97ml超純水的錐形瓶中加入2.Oml檸檬酸鈉溶液（1% )，加熱至沸 騰，邊攪拌邊加熱，迅速加入I.Oml氯金酸溶液（1% )，5min后變?yōu)榉€(wěn)定的酒紅色，繼續(xù)加熱 攪拌lOmin。冷卻后用超純水補(bǔ)充至100ml。
[0042] 2.膠體金的標(biāo)記：
[0043](I)pH值的確定過(guò)程如下：
[0044] 根據(jù)文件介紹，SPA蛋白標(biāo)記的最佳pH值在6.0附近，我們測(cè)定剛燒制好的膠體 金溶液pH值在6. 0-6. 5,我們測(cè)試4. 5到7.O標(biāo)記的差異，結(jié)果顯示SPA標(biāo)記時(shí)屬于pH值 非嚴(yán)格依賴(lài)型，PH值在5. 0-7.O差異不顯著，最后確定燒制好的膠體金直接標(biāo)記使用，不調(diào) 整pH值。
[0045] (2)SPA標(biāo)計(jì)量的確定：
[0046] 初步測(cè)試：
[0047] ①取潔凈微孔板，每孔加200μ1膠體金及5μ1 0. 2MK2C03 (事先將0. 2M的碳酸 鉀和膠體金按此比例混勻，再分別加入各孔）。
[0048] ②將5mg/ml的SPA稀釋為0. 5μg/ul濃度。
[0049] ③每孔分別加 1μ1、2μ1、4μ1、8μ1、16μ1、32μ1，并做復(fù)孔，靜置lOmin。
[0050] ④每孔分別加入NaCl溶液20ul，置IOmin后，觀察。
[0051] ⑤實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示：
[0052]表 3 :
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它由試紙條和加樣緩 沖液組成，所述試紙條包括包被有TB-SA抗原、質(zhì)控線包被有羊抗人多抗的硝酸纖維素膜、 膠體金標(biāo)記的SPA蛋白吸附在聚酯膜上的金標(biāo)墊、樣品墊和吸水紙； 所述結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗原，為無(wú)色透明液體，濃度大于2mg/ml ; 所述羊抗人多抗，為無(wú)色透明液體，濃度大于2mg/ml ; 所述SPA蛋白為無(wú)色透明液體，為無(wú)色透明液體，濃度大于2mg/ml ; 所述加樣緩沖液為含有〇. 5g/ml表面活性劑TWEEN-20的PB溶液。
2. 如權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒的制備方法，其 特征在于，它包括以下步驟：
51. 試紙條的制備：
511. 反應(yīng)膜的制備：用磷酸鹽緩沖液將結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗原稀釋到包被濃度 1. Omg/ml，將羊抗人多抗體稀釋至包被濃度為1. 5mg/ml，用劃膜噴金標(biāo)機(jī)將兩種溶液分別 劃到硝酸纖維膜上，將膜干燥后保存；
512. 金結(jié)合墊的制備：將濃度為0. 5mg/ml的SPA蛋白將膠體金進(jìn)行標(biāo)記，以轉(zhuǎn)速為 12000r/min離心30min，棄上清，將膠體金結(jié)合物稀釋液至原體積的1/10,然后浸潤(rùn)裁切好 的聚酯膜，制備成金結(jié)合墊；
513. 組裝切條：在反應(yīng)膜所在的PVC底板上揭去2. Ocm不干膠，粘貼上吸水紙，使紙 下部壓住反應(yīng)膜，揭去底板上的1. 7cm不干膠，分別粘貼上金結(jié)合墊和樣品墊，金結(jié)合墊的 上部壓住反應(yīng)膜1mm，樣品墊上部壓住金結(jié)合墊下部1mm，組裝好后，用切條機(jī)將試紙切成 3. 5?3. 7mm試紙條，包裝；
52. 加樣緩沖液的制備：稱(chēng)取表面活性劑TWEEN-20,用20mM PB緩沖液溶解至濃度為 0?5g/ml〇
3. 如權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒的制備方法，其 特征在于，步驟S1所述干燥溫度為35?40°C，干燥時(shí)間為115?125min。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104483491SQ201410798281
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】葉成棟, 劉軍, 郭沛, 羅春勤, 王洪 申請(qǐng)人:成都永安制藥有限公司