基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析檢測試紙條及應用，本發(fā)明采用低噪聲激發(fā)式熒光染料作為標記，采用免疫層析技術，制備靶向于諾如病毒衣殼蛋白的免疫層析試紙條，檢測時，采用專用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別掃描質控線和檢測線，以檢測線熒光強度檢測值實現(xiàn)樣本的定性檢測，該試紙條適用于食品及病理樣本中諾如病毒即時檢測，本發(fā)明具有快速、高敏、兼顧定性及精準定量及便攜的特點。
【專利說明】基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學、食品安全檢測領域，具體地說涉及一種基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的諾如病毒免疫層析試紙條及其制備方法與應用。

【背景技術】
[0002]諾如病毒作為致病菌檢測的一項重要指標，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗檢疫中均有重要的意義，同時也對諾如病毒的快速及高精度的定量檢測提出了更高的要求。為探求快速、準確、高靈敏度、易操作且能夠定量的檢測方法，世界各國學者進行了大量研宄，從以傳統(tǒng)方法為基礎發(fā)展到以免疫學、分子生物學為基礎的快速檢測方法，并在實踐中不斷取得新進展。
[0003]免疫層析技術是一項有效結合了層析法卓越分離能力和免疫反應高度特異性的新型免疫檢測技術，當前在疾病快速診斷、環(huán)境污染物分析及致病生物因子檢定等領域得到廣泛應用。其原理是將特異抗原或抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當迀移至交聯(lián)標記抗體的特定區(qū)域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結合形成抗原-標記抗體復合物，經標記物的顯色、發(fā)光或電化學反應而使該區(qū)域顯示一定的信號，從而實現(xiàn)特異性免疫診斷。常用的標記物包括生色型探針(包括膠體金、膠體碳、著色微球等)和熒光分子(如有機熒光染料、量子點、稀土元素配合物、上轉磷光顆粒等)。
[0004]然而上述的標記物卻存在靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量檢測等缺陷，進而限制了免疫層析技術的廣泛應用。如現(xiàn)有技術中常見的利用酶標記催化生色底物的酶促反應而顯色，可用于抗原或抗體的直接檢測，將該方法應用于食品中諾如病毒的檢測，通過單克隆抗體大大降低假陽性率，但是該方法的靈敏度較分子生物學方法低，且必須經過增菌篩選純培養(yǎng)步驟，因此難以在短時間內得到檢測結果。
[0005]對于現(xiàn)有的膠體金免疫層析技術，通過膠體金等納米顆粒的聚集反應而顯色，從而實現(xiàn)結果判定。雖然該種方法具有便捷、快速、準確和無污染等特點被廣泛應用于醫(yī)學檢測和臨床診斷，在病原體檢測方面，其敏感性、特異性具有其他免疫學方法無可比擬的優(yōu)勢，且無需特殊儀器設備，對檢測人員的專業(yè)要求低，有良好的基層應用開發(fā)前景。但這種方法中存在標記物的穩(wěn)定性較差，顏色單一，靈敏度較低，受基質的背景干擾大等缺陷，且只能定性檢測，不能做到精確定量檢測，上述標記靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量，限制了免疫層析技術的應用。


【發(fā)明內容】

[0006]為此，本發(fā)明所要解決的技術問題在于現(xiàn)有技術中難于快速檢測諾如病毒的問題，進而提供一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，并進一步公開了其應用。
[0007]為解決上述技術問題，本發(fā)明提供的一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，包括:
[0008]底板以及沿所述底板的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊、結合墊、抗體承載膜和吸水墊，所述樣品墊、結合墊、抗體承載膜和吸水墊之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜粘附于所述底板的中間部位，其上設置有相間隔的檢測線和質控線，所述檢測線靠近所述結合墊，所述質控線靠近所述吸水墊；
[0009]所述結合墊上噴涂低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的可與諾如病毒衣殼蛋白特異性結合的單克隆抗體；
[0010]所述檢測線由可與所述諾如病毒衣殼蛋白特異性結合的多克隆抗體涂層形成；所述質控線由與所述諾如病毒以及所述可與諾如病毒特異性結合的多克隆抗體均無關的抗體涂層形成。
[0011]所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，所述結合墊上噴涂的所述可與諾如病毒特異性結合的單克隆抗體為鼠抗諾如病毒衣殼蛋白單克隆抗體(購自Pierce公司)。
[0012]所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，所述檢測線上的可與諾如病毒特異性結合的多克隆抗體涂層為兔抗諾如病毒衣殼蛋白多克隆抗體(購自Abcam 公司)。
[0013]所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，形成所述質控線的抗體為羊抗鼠IgG多克隆抗體。
[0014]所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為激發(fā)波長為777nm，發(fā)射波長為790nm的低噪聲激發(fā)式熒光染料為DyLight800 (由 Thermofisher 公司提供)。
[0015]所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，所述質控線與所述檢測線平行設置，所述檢測線和所述質控線間距0.5cm。
[0016]本發(fā)明提供了一種制備所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條的方法，包括如下步驟:
[0017]A)取以PBS (pH為7.4)緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料(便于取樣準確)，染料與諾如病毒衣殼蛋白單克隆抗體按1:10質量比混合均勻，室溫條件下避光反應2小時，隨后將所得的標記產物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標記好的標記產物中添加終濃度為1.5% BSA,0.15% Tween20和0.1%。疊氮化鈉，4°C保存，備用；
[0018]B)在所述結合墊上噴涂以層析緩沖液稀釋1000倍后的所述標記產物，然后室溫風干，備用；
[0019]C)使用pH為7.4的含5% BSA, 0.1 % Tween 20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊上，室溫風干后，備用；
[0020]D)分別取所述諾如病毒多克隆抗體與諾如病毒以及可與諾如病毒特異性結合的多克隆抗體均無關的抗體用劃線機在所述抗體承載膜上劃所述檢測線和所述質控線，室溫風干，備用；
[0021]E)將上述步驟獲得的所述樣品墊、所述結合墊、所述抗體承載膜和所述吸水墊沿所述底板的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得；
[0022]本發(fā)明提供了一種由上述的制備方法制得的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條在定性檢測諾如病毒領域中的用途。
[0023]本發(fā)明提供了一種利用所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條定性檢測諾如病毒的方法，包括如下步驟:
[0024]a)以含5 % BSA，0.1 % Tween 20的PBS (pH為7.4)緩沖液稀釋處理待測樣品，取上清液作為待檢樣用所述的試紙條進行免疫層析；
[0025]b)熒光掃描所述檢測線和所述質控線，分別測定所述檢測線和所述質控線區(qū)域的熒光強度，若所述質控線區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述檢測線區(qū)域同時出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結果，反之則為陰性。
[0026]本發(fā)明的上述技術方案相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點:
[0027](I)本發(fā)明所述的基于基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的標記的諾如病毒免疫層析試紙條，其激發(fā)光譜位于低噪聲激發(fā)式區(qū)域(波長為777nm)的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的探針具有較高的信噪比，并由此保障了其高檢測靈敏度，同時由于生物基體極少在低噪聲激發(fā)式光譜區(qū)自發(fā)熒光，使得基于此類探針標記的分析檢測免受背景熒光干擾；因散射光強度與波長的四次方成反比，發(fā)射光位于長波區(qū)的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的探針受其干擾小。與常用的膠體金免疫層析試紙條相比，基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的免疫層析體系對革E標病毒的靈敏度與實時焚光PCR法相近。
[0028](2)本發(fā)明所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條定性檢測諾如病毒的方法具有便攜的優(yōu)勢，適用于現(xiàn)場、即時、快速檢測，本方法所涉的免疫層析試紙條及低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀均屬于便攜可移動裝置，且整個檢測過程可在30分鐘內完成，適用于現(xiàn)場、即時、快速檢測，相對于實時熒光定量PCR法等分子生物學方法在儀器的檢測速度、便攜性及現(xiàn)場適用性上呈現(xiàn)明顯優(yōu)勢。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]為了使本發(fā)明的內容更容易被清楚的理解，下面根據本發(fā)明的具體實施例并結合附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中
[0030]圖1是實施例1中所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條的不意圖；
[0031]圖2是實施例2中所述的諾如病毒低噪聲激發(fā)式熒光檢測圖；
[0032]圖中附圖標記表示為:1-樣品墊，2-結合墊，3-硝酸纖維素膜，4-檢測線，5-質控線，6-吸水墊，7-底板。

【具體實施方式】
[0033]實施例1
[0034]本實施例所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條如圖1所示，其包括，底板7以及沿所述底板7的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊1、結合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6且所述樣品墊1、結合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜3上粘附于所述底板7的中間部位，其上設置有相間隔的檢測線4的質控線5，所述檢測線4靠近所述結合墊2，所述質控線5靠近所述吸水墊6 ;所述質控線4與所述檢測線5平行設置，所述檢測線和所述質控線間距0.5cm。
[0035]所述結合墊2上噴涂所述的可與諾如病毒特異性結合的單克隆抗體鼠抗諾如病毒衣殼蛋白單克隆抗體(購自Pierce公司)；所述檢測線4由可與所述諾如病毒特異性結合的多克隆抗體兔抗諾如病毒衣殼蛋白多克隆抗體(購自Abcam公司)涂層形成；所述質控線5由與所述諾如病毒以及所述可與諾如病毒特異性結合的多克隆抗體均無關的羊抗鼠IgG多克隆抗體(購自北京華大蛋白質公司)涂層形成。
[0036]所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為發(fā)射波長為777nm，發(fā)射光波長為790nm的NHS活化的低噪聲激發(fā)式熒光染料DyLight800作為熒光分子。
[0037]上述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條的制備方法，包括如下步驟:
[0038]A)取以PBS (pH為7.4)緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料(便于取樣準確)，染料與諾如病毒衣殼蛋白單克隆抗體按1:10質量比混合均勻，室溫條件下避光反應2小時，隨后將所得的標記產物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標記好的標記產物中添加終濃度為1.5% BSA,0.15% Tween20和0.1%。疊氮化鈉，4°C保存，備用；
[0039]B)在所述結合墊上噴涂以層析緩沖液稀釋1000倍后的所述標記產物，然后室溫風干，備用；
[0040]C)選取纖維素膜為所述樣品墊1，使用含5% BSA, 0.1% Tween 20的PBS (pH為7.4)緩沖液噴涂在所述樣品墊I上，室溫風干后，備用；
[0041]D)選取硝酸纖維素膜為所述抗體承載膜3，分別取所述諾如病毒多克隆抗體和所述羊抗鼠IgG(購自北京華大蛋白質公司)多克隆抗體用劃線機在所述抗體承載膜3上劃所述檢測線4和所述質控線5，室溫風干，備用；
[0042]E)將上述步驟獲得的所述樣品墊1、所述結合墊2、所述抗體承載膜3和所述吸水墊6沿所述底板7的長度方向上依次粘附，具體為在底板7中間先鋪設抗體承載膜3，然后在抗體承載膜3的與質控線5相臨近的一端鋪吸水墊6，使吸水墊6與抗體承載膜3部分重疊，然后在抗體承載膜3的與所述檢測線4相臨近的一端鋪所述結合墊2，使所述抗體承載膜3與所述結合墊2的一端部分重疊，隨后在所述結合墊2的另一端再部分重疊的鋪設所述樣品墊I，最后切割成0.5cm寬，即得試紙條。
[0043]實施例2
[0044]本實施例提供了一種利用上述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條定性檢測諾如病毒的方法，包括如下步驟:
[0045]a)取牡蠣肉質部分 25g，剪碎，用 225mL 含 5 % BSA，0.1% Tween 20 的 PBS (pH 為7.4)緩沖液稀釋樣本，取洗脫液作為檢樣，吸取50 μ L檢樣滴加到樣品墊I上，待吸收干后再滴加50 μ L所述PBS緩沖液，另取所述緩沖液作為陰性對照，用所述的試紙條進行免疫層析；
[0046]b)室溫放置1min后，用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀(北京博潤福得科技發(fā)展有限公司)分別測定所述檢測線4和所述質控線5區(qū)域的熒光強度，若所述質控線5區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述檢測線區(qū)域同時出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結果，反之則為陰性。附圖2給出了對上述樣品的定性檢測結果?？梢?，本發(fā)明所述試紙條可有效對諾如病毒進行定性的檢測之用。
[0047]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
【權利要求】
1.一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，其特征在于，包括: 底板(7)以及沿所述底板(7)的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊(1)、結合墊(2)、抗體承載膜(3)和吸水墊￠)，且所述樣品墊(1)、結合墊(2)、抗體承載膜(3)和吸水墊(6)之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜(3)粘附于所述底板(7)的中間部位，其上設置有相間隔的檢測線(4)和質控線(5)，所述檢測線(4)靠近所述結合墊(2)，所述質控線(5)靠近所述吸水墊(6); 所述結合墊(2)上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的可與所述諾如病毒衣殼蛋白特異性結合的單克隆抗體； 所述檢測線(4)由可與所述諾如病毒衣殼蛋白特異性結合的多克隆抗體涂層形成；所述質控線(5)由與所述諾如病毒以及所述可與諾如病毒衣殼蛋白特異性結合的多克隆抗體均無關的抗體涂層形成。
2.根據權利要求1所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，其特征在于，所述結合墊(2)上噴涂的所述可與諾如病毒特異性結合的單克隆抗體為鼠抗諾如病毒衣殼蛋白單克隆抗體。
3.根據權利要求1或2所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，其特征在于，形成所述檢測線(4)的所述可與諾如病毒特異性結合的多克隆抗體為兔抗諾如病毒衣殼蛋白多克隆抗體。
4.根據權利要求1-3任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，其特征在于，形成所述質控線(5)的抗體為羊抗鼠IgG多克隆抗體。
5.根據權利要求1-4任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，其特征在于，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為激發(fā)波長波長為777nm，發(fā)射波長為790nm的熒光分子。
6.根據權利要求5所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條，其特征在于，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為NHS活化的低噪聲激發(fā)式熒光染料DyLight800。
7.—種制備權利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式焚光標記的諾如病毒免疫層析試紙條的方法，其特征在于，包括如下步驟: A)取以pH為7.4的PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料，染料與諾如病毒衣殼蛋白單克隆抗體按1:10質量比混合均勻，室溫條件下避光反應2小時，隨后將所得的標記產物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標記好的標記產物中添加終濃度為1.5% BSA,0.15% Tween20和0.1 %。疊氮化鈉，4 °C保存，備用； B)在所述結合墊(2)上噴涂以層析緩沖液稀釋1000倍后的上述步驟A)中的所述標記產物，然后室溫風干，備用； C)使用pH為7.4的含5% BSA,0.1% Tween 20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊(I)上，室溫風干后，備用； D)分別取所述諾如病毒衣殼蛋白多克隆抗體和所述與諾如病毒以及可與諾如病毒特異性結合的多克隆抗體均無關的抗體用劃線機在所述抗體承載膜(3)上劃所述檢測線(4)和所述質控線(5)，室溫風干，備用； E)將上述步驟獲得的所述樣品墊(I)、所述結合墊(2)、所述抗體承載膜(3)和所述吸水墊(6)沿所述底板(7)的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得。
8.權利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的諾如病毒免疫層析試紙條在定性檢測諾如病毒領域中的用途。
9.一種利用權利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式焚光標記的諾如病毒免疫層析試紙條檢測諾如病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟: a)以pH為7.4的含5 % BSA, 0.1 % Tween 20的PBS緩沖液稀釋處理待測樣品，取上清液作為待檢樣以利用權利要求1-6任一所述的試紙條進行免疫層析檢測； b)熒光掃描所述檢測線(4)和所述質控線(5)，分別測定所述檢測線(4)和所述質控線(5)區(qū)域的熒光強度，若所述質控線(5)區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述檢測線(4)區(qū)域同時出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結果，反之則為陰性。
【文檔編號】G01N33/577GK104502597SQ201410814966
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權日:2014年12月23日
【發(fā)明者】張捷, 趙琢, 王靜, 周翔, 劉潔, 康西西, 張曉光, 舒咬根, 陳廣全 申請人:北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 天津出入境檢驗檢疫局工業(yè)產品安全技術中心, 威海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心