基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的a組輪狀病毒的層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，具體地說涉及一種基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明采用量子點作為標(biāo)記，采用免疫層析技術(shù)，制備靶向于A組輪狀病毒的免疫層析試紙條，檢測時，采用專用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別掃描質(zhì)控線和檢測線，以檢測線熒光強(qiáng)度檢測值實現(xiàn)樣本的定性及定量檢測，該試紙條適用于食品及病理樣本中A組輪狀病毒即時檢測，本發(fā)明具有快速、高敏、兼顧定性及精準(zhǔn)定量及便攜的特點。
【專利說明】基于低噪聲激發(fā)式黃光標(biāo)巧的A組輪狀病毒的層析試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品（醫(yī)學(xué)）檢測領(lǐng)域，具體地說設(shè)及一種基于低噪聲激發(fā)式巧光染 料標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條及其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 輪狀病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體之一，其主要感染小腸上皮細(xì)胞，從而 造成細(xì)胞損傷，引起腹瀉。輪狀病毒每年在夏秋冬季流行，感染途徑為糞一口途徑，臨床表 現(xiàn)為急性胃腸炎，呈滲透性腹瀉病。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的輪狀病毒對人類 的安全具有危險，該菌在低溫仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一， 因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗中，必須加W重視。目前，輪狀病毒已經(jīng)作為致病菌檢測的一 項重要指標(biāo)，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗檢疫中均有重要的意義，同時 也對輪狀病毒的快速及高精度的定量檢測提出了更高的要求。為探求快速、準(zhǔn)確、高靈敏 度、易操作且能夠定量的檢測方法，世界各國學(xué)者進(jìn)行了大量研究，從W傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā) 展到W免疫學(xué)、分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測方法，并在實踐中不斷取得新進(jìn)展。
[0003] 免疫層析技術(shù)是一項有效結(jié)合了層析法卓越分離能力和免疫反應(yīng)高度特異性的 新型免疫檢測技術(shù)，當(dāng)前在疾病快速診斷、環(huán)境污染物分析及致病生物因子檢定等領(lǐng)域得 到廣泛應(yīng)用。其原理是將特異抗原或抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝 酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)遷移至交聯(lián)標(biāo) 記抗體的特定區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原-標(biāo)記抗體 復(fù)合物，經(jīng)標(biāo)記物的顯色、發(fā)光或電化學(xué)反應(yīng)而使該區(qū)域顯示一定的信號，從而實現(xiàn)特異性 免疫診斷。常用的標(biāo)記物包括生色型探針（包括膠體金、膠體碳、著色微球等）和巧光分子 (如有機(jī)巧光染料、量子點、稀±元素配合物、上轉(zhuǎn)磯光顆粒等）。
[0004] 然而上述的標(biāo)記物卻存在靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量檢測等缺陷，進(jìn)而限制 了免疫層析技術(shù)的廣泛應(yīng)用。如現(xiàn)有技術(shù)中常見的利用酶標(biāo)記催化生色底物的酶促反應(yīng)而 顯色，可用于抗原或抗體的直接檢測，將該方法應(yīng)用于食品中輪狀病毒的檢測，通過單克隆 抗體大大降低假陽性率，但是該方法的靈敏度較分子生物學(xué)方法低，且必須經(jīng)過增菌篩選 純培養(yǎng)步驟，因此難W在短時間內(nèi)得到檢測結(jié)果。
[0005] 對于現(xiàn)有的膠體金免疫層析技術(shù)，通過膠體金等納米顆粒的聚集反應(yīng)而顯色，從 而實現(xiàn)結(jié)果判定。雖然該種方法具有便捷、快速、準(zhǔn)確和無污染等特點被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué) 檢測和臨床診斷，在病原體檢測方面，其敏感性、特異性具有其他免疫學(xué)方法無可比擬的優(yōu) 勢，且無需特殊儀器設(shè)備，對檢測人員的專業(yè)要求低，有良好的基層應(yīng)用開發(fā)前景。但該種 方法中存在標(biāo)記物的穩(wěn)定性較差，顏色單一，靈敏度較低，受基質(zhì)的背景干擾大等缺陷，且 只能定性檢測，不能做到精確定量檢測，上述標(biāo)記靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量，限制了 免疫層析技術(shù)的應(yīng)用。
[0006] 另外，現(xiàn)有免疫層析技術(shù)一直主要用于對蛋白類的檢測，對于微生物的檢測則所 見甚少，同時更難W實現(xiàn)微生物的定量檢測，對于快速檢測致病菌而言，其應(yīng)用受到極大的 限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有技術(shù)中難于快速定量檢測輪狀病毒的 問題，進(jìn)而提供一種基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條，并進(jìn)一 步公開了其應(yīng)用。
[000引為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的A組輪狀 病毒免疫層析試紙條，包括：
[0009] 底板W及沿所述底板的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊、結(jié)合墊、抗 體承載膜和吸水墊，所述樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜和吸水墊之間，依次與且僅與相鄰部 位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜粘附于所述底板的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的 檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線靠近所述結(jié)合墊，所述質(zhì)控線靠近所述吸水墊；
[0010] 所述結(jié)合墊上噴涂有低噪聲激發(fā)式巧光染料標(biāo)記的可與A組輪狀病毒特異性結(jié) 合的單克隆抗體；
[0011] 所述檢測線由可與所述輪狀病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì)控線 由與所述輪狀病毒W(wǎng)及所述可與輪狀病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體涂層形 成。
[0012] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條，所述結(jié)合墊 上噴涂的所述可與A組輪狀病毒特異性結(jié)合的單克隆抗體為鼠抗A組輪狀病毒衣殼蛋白單 克隆抗體。
[0013] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條，形成所述檢 測線的可與A組輪狀病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體為羊抗A組輪狀病毒多克隆抗體。
[0014] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條，形成所述質(zhì) 控線的抗體為羊抗鼠IgG多克隆抗體。
[0015] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條，所述的低噪 聲激發(fā)式巧光染料為發(fā)射波長為650-1000nm。
[0016] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的輪狀病毒免疫層析試紙條，所述的低噪聲激 發(fā)式巧光染料為DyLi曲巧00。
[0017] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的輪狀病毒免疫層析試紙條，所述質(zhì)控線與所 述檢測線平行設(shè)置，所述檢測線和所述質(zhì)控線間距0. 5cm。
[0018] 本發(fā)明提供了一種制備所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的輪狀病毒免疫層析 試紙條的方法，包括如下步驟：
[0019] A)取W PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式巧光染料DyLi曲巧00 (由美國 Thermo Fisher公司提供）與所述鼠抗A組輪狀病毒衣殼蛋白單克隆抗體（購自Pierce抗 體公司）按質(zhì)量比為1:4混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后將所得的標(biāo)記產(chǎn)物放 入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標(biāo)記好的抗體溶液標(biāo)記產(chǎn)物中添加 終濃度為1. 5% BSA、0. 15% Tween20和疊氮化鋼0. l%〇,4°C保存，備用；
[0020] B)在所述結(jié)合墊上噴涂W層析緩沖液稀釋4000倍后的上述步驟A)中的所述標(biāo)記 產(chǎn)物，然后室溫風(fēng)干，備用；
[0021] C)使用含5% BSA，0. 1 % Tween 20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊上，室溫風(fēng)干 后，備用；
[0022] D)分別取所述輪狀病毒多克隆抗體和所述與輪狀病毒W(wǎng)及可與輪狀病毒特異性 結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體用劃線機(jī)在所述抗體承載膜上劃所述檢測線和所述質(zhì)控 線，室溫風(fēng)干，備用；
[0023] 巧將上述步驟獲得的所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述抗體承載膜和所述吸水墊沿 所述底板的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得。
[0024] 本發(fā)明提供了一種由上述的制備方法制得的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的輪狀 病毒免疫層析試紙條在定性及定量檢測輪狀病毒領(lǐng)域中的用途。
[0025] 本發(fā)明提供了一種利用所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的輪狀病毒免疫層析 試紙條檢測輪狀病毒的方法，包括如下步驟：
[0026] a) W PBS (抑7. 2)緩沖液稀釋處理待測樣品，取上清液作為待檢樣，另取所述PBS 緩沖液作為陰性對照，分別用所述的試紙條進(jìn)行免疫層析；
[0027] b)巧光掃描所述檢測線和所述質(zhì)控線，分別測定所述檢測線和所述質(zhì)控線區(qū)域的 巧光強(qiáng)度，若所述質(zhì)控線區(qū)域出現(xiàn)巧光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述 檢測線區(qū)域同時出現(xiàn)巧光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性。
[002引所述的檢測A組輪狀病毒的方法，還包括制備標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量檢測的步驟；其中：
[0029] 所述制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟包括：取A組輪狀病毒衣殼蛋白抗原（北京華大蛋白質(zhì) 公司）配制成1-40倍梯度濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品；并將上述濃度系列標(biāo)準(zhǔn)品分別用所述的試紙 條進(jìn)行免疫層析，巧光掃描所述檢測線和所述質(zhì)控線，分別測定所述檢測線和所述質(zhì)控線 區(qū)域的巧光強(qiáng)度，制作抗原濃度與巧光強(qiáng)度比之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合方程；
[0030] 所述定量檢測的步驟包括；取待測樣品W所述的試紙條進(jìn)行免疫層析檢測，利用 上述標(biāo)準(zhǔn)曲線及工作方程求得所述輪狀病毒濃度。
[0031] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有W下優(yōu)點：
[0032] (1)本發(fā)明所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條， 其發(fā)射光譜位于低噪聲激發(fā)式區(qū)域（波長為650-1 lOOnm)的低噪聲激發(fā)式巧光探針具有較 高的信噪比，并由此保障了其高檢測靈敏度，同時由于生物基體極少在低噪聲激發(fā)式光譜 區(qū)自發(fā)巧光，使得基于此類探針標(biāo)記的分析檢測免受背景巧光干擾；因散射光強(qiáng)度與波長 的四次方成反比，發(fā)射光位于長波區(qū)的低噪聲激發(fā)式巧光探針受其干擾小。與常用的膠體 金免疫層析試紙條相比，基于低噪聲激發(fā)式巧光染料標(biāo)記的免疫層析體系對祀病毒的靈敏 度提高約10倍；如輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條的最低檢出限為5 y g/mU而本發(fā)明中 基于低噪聲激發(fā)式巧光染料的輪狀病毒免疫層析試紙條的最低檢出限為0. 5 y g/mL ;
[0033] (2)本發(fā)明所述的低噪聲激發(fā)式巧光A組輪狀病毒免疫層析試紙條定性檢測輪狀 病毒的方法具有便攜的優(yōu)勢，適用于現(xiàn)場、即時、快速檢測，本方法所設(shè)的免疫層析試紙條 及低噪聲激發(fā)式巧光掃描儀均屬于便攜可移動裝置，且整個檢測過程可在lOmin內(nèi)完成， 適用于現(xiàn)場、即時、快速檢測，相對于實時巧光定量PCR法等分子生物學(xué)方法則在儀器的檢 測速度、便攜性及現(xiàn)場適用性上呈現(xiàn)明顯優(yōu)勢；
[0034] (3)本發(fā)明所述的低噪聲激發(fā)式巧光輪狀病毒免疫層析試紙條定量檢測輪狀病毒 的方法可對所述輪狀病毒進(jìn)行定量檢測，傳統(tǒng)的免疫層析法依賴膠體金顆粒的聚集效應(yīng)而 生色w判讀結(jié)果，其顏色深淺雖與樣品中祀標(biāo)菌的濃度存在一定的數(shù)量關(guān)系，但無法進(jìn)行 準(zhǔn)確定量，而本發(fā)明將近紅外巧光染料標(biāo)記于特異性抗體上，檢測線的巧光強(qiáng)度直接體現(xiàn) 了與捕獲分子相結(jié)合的祀標(biāo)菌的量，加之質(zhì)控線不隨樣本改變的巧光強(qiáng)度作為內(nèi)參，通過 掃描檢測線及質(zhì)控線上的巧光強(qiáng)度、計算比值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出檢樣中祀病毒 的濃度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合 附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中
[0036] 圖1是實施例1中所述的低噪聲激發(fā)式巧光A組輪狀病毒免疫層析試紙條的示意 圖；
[0037] 圖2是實施例2中所述的A組輪狀病毒低噪聲激發(fā)式巧光檢測圖；
[003引圖3是實施例3中所述的輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0039] 圖中附圖標(biāo)記表示為；1-樣品墊，2-結(jié)合墊，3-硝酸纖維素膜，4-檢測線，5-質(zhì)控 線，6-吸水墊，7-底板。

【具體實施方式】
[0040] 實施例1
[0041] 本實施例所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條如 圖1所示，其包括，底板7 W及沿所述底板7的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊 1、結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6,且所述樣品墊1、結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6 之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜3上粘附于所述底板7的 中間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線4的質(zhì)控線5,所述檢測線4靠近所述結(jié)合墊2,所述 質(zhì)控線5靠近所述吸水墊6。所述質(zhì)控線4與所述檢測線5平行設(shè)置，所述檢測線和所述質(zhì) 控線間距0. 5畑1。
[0042] 所述結(jié)合墊2上噴涂有低噪聲激發(fā)式巧光染料標(biāo)記的可與輪狀病毒特異性結(jié)合 的單克隆抗體鼠抗A組輪狀病毒衣殼蛋白單克隆抗體；所述檢測線4由可與所述輪狀病毒 特異性結(jié)合的多克隆抗體_羊抗A組輪狀病毒多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì)控線5由與所 述輪狀病毒W(wǎng)及所述可與輪狀病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的羊抗鼠IgG多克隆 抗體涂層形成。
[0043] 所述的低噪聲激發(fā)式巧光染料為發(fā)射波長為777皿，發(fā)射光波長為790nm的NHS活 化的低噪聲激發(fā)式巧光染料DyLi曲巧00作為巧光分子。
[0044] 上述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的輪狀病毒免疫層析試紙條的制備方法，包括 如下步驟：
[0045] 1)低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的輪狀病毒單克隆抗體
[0046] 取W PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式巧光染料DyLi曲巧00 (由美國 Thermo Fisher公司提供）與所述鼠抗A組輪狀病毒衣殼蛋白單克隆抗體（購自Pierce抗 體公司）按質(zhì)量比為1:4混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后將所得的標(biāo)記產(chǎn)物放 入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標(biāo)記好的抗體溶液標(biāo)記產(chǎn)物中添加 終濃度為1. 5% BSA、0. 15% Tween20和疊氮化鋼0. l%〇,4°C保存，備用；
[0047] 2)制作結(jié)合墊
[0048] 選取玻璃纖維素膜為所述結(jié)合墊2,在所述結(jié)合墊2上噴涂步驟（1)的 DyLi曲巧00標(biāo)記的抗體，然后室溫風(fēng)干，備用；
[0049] 如制作樣品墊
[0化日]選取纖維素膜為所述樣品墊1，使用含5% BSA，0. 1 % Tween 20的PBS緩沖液噴涂 在所述樣品墊1上，室溫風(fēng)干后，備用；
[0化1] 4)抗體承載膜
[0化2] 選取硝酸纖維素膜為所述抗體承載膜3,分別取所述A組輪狀病毒多克隆抗體和 所述羊抗鼠IgG(北京華大蛋白質(zhì)公司）多克隆抗體用劃線機(jī)在所述抗體承載膜3上劃所 述檢測線4和所述質(zhì)控線5,室溫風(fēng)干，備用；
[0化3] 5)組裝免疫層析試紙條
[0化4] 將上述步驟獲得的所述樣品墊1、所述結(jié)合墊2、所述抗體承載膜3和所述吸水墊6 沿所述底板7的長度方向上依次粘附，具體為在底板7中間先鋪設(shè)抗體承載膜3,然后在抗 體承載膜3的與質(zhì)控線5相臨近的一端鋪吸水墊6,使吸水墊6與抗體承載膜3部分重疊， 然后在抗體承載膜3的與所述檢測線4相臨近的一端鋪所述結(jié)合墊2,使所述抗體承載膜3 與所述結(jié)合墊2的一端部分重疊，隨后在所述結(jié)合墊2的另一端再部分重疊的鋪設(shè)所述樣 品墊1，最后切割成0. 5cm寬，即得試紙條。
[0化5] 實施例2
[0化6] 本實施例提供了一種利用上述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的A組輪狀病毒免 疫層析試紙條進(jìn)行定性檢測輪狀病毒的方法，包括如下步驟：
[0057] a)取草替樣品25g，用225血含5% BSA，0. 1 % Tween 20的PBS緩沖液稀釋樣品， 取上清液作為檢樣，吸取1ml上清液待用。吸取50 y L已預(yù)處理的檢樣滴加到樣品墊1上， 待吸收干后再滴加50 y L層析液，另取所述緩沖液作為陰性對照，用所述的試紙條進(jìn)行免 疫層析；
[0化引 b)室溫放置15min后，用便攜式低噪聲激發(fā)式巧光掃描儀（北京博潤福得科技發(fā) 展有限公司）分別測定所述檢測線和所述質(zhì)控線區(qū)域的巧光強(qiáng)度，若所述質(zhì)控線區(qū)域出現(xiàn) 巧光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述檢測線區(qū)域同時出現(xiàn)巧光發(fā)射峰則 為陽性結(jié)果，反之則為陰性，附圖2給出了對上述樣品的定性檢測結(jié)果。
[0化9] C)將沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、副溶血 弧菌分別調(diào)制成0. 6 X 104CFU/血菌液，按照先前介紹的方法進(jìn)行破菌處理，吸取100 y L經(jīng) 超聲處理的樣本滴加到樣品墊上，待吸收干后再滴加50 y L層析液。室溫放置15min后，用 便攜式近紅外巧光掃描儀讀數(shù)。除輪狀病毒樣品外，其余檢測的細(xì)菌在檢測線位置均未出 現(xiàn)發(fā)射峰，各菌的試紙條均在質(zhì)控線處出現(xiàn)發(fā)射峰。表明本方法對輪狀病毒的檢測特異性 好，與其他四個菌屬無交叉反應(yīng)。
[0060] 實施例3
[0061] 本實施例提供了一種利用所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的輪狀病毒免疫層 析試紙條定量檢測輪狀病毒的方法。
[006引 （a)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：取100 yg/ml的A組輪狀病毒衣殼蛋白（北京華大蛋白質(zhì)公 司），用含5% BSA，0. 1% Tween 20, PBS(抑7. 2)稀釋液將所述蛋白進(jìn)行倍數(shù)系列稀釋，審U 成 0. 5、1、2. 5、5、10、20yg/ml 的樣品。
[0063] 化）吸取50 y L W上樣本滴加到樣品墊1上，待樣品吸收后再滴加50 y L層析液， 室溫靜置10分鐘，將上述試紙條放入便攜式低噪聲激發(fā)式巧光掃描儀（北京博潤福得科技 發(fā)展有限公司）中讀數(shù)。上述系列稀釋的A組輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行檢測，掃描獲得檢 測線和質(zhì)控線的巧光值，同時出現(xiàn)檢測區(qū)域巧光峰和質(zhì)控區(qū)域巧光峰方表明反應(yīng)正常。每 個稀釋度樣本平行測量兩次，取平均值作為測量值，檢測結(jié)果見表1，W該值對相應(yīng)的樣品 濃度制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖3所示，并擬合得適用的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0064] 表1不同濃度A組輪狀病毒菌標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)檢測結(jié)果
[00 巧 1

【權(quán)利要求】
1. 一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙條，其特征在于，包 括： 底板（7)以及沿所述底板（7)的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊（1)、結(jié)合 墊（2)、抗體承載膜（3)和吸水墊（6)，且所述樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、抗體承載膜（3)和吸 水墊（6)之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜（3)粘附于所述 底板（7)的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線（4)和質(zhì)控線（5)，所述檢測線（4)靠近 所述結(jié)合墊（2)，所述質(zhì)控線（5)靠近所述吸水墊（6); 所述結(jié)合墊（2)上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標(biāo)記的可與所述A組輪狀病毒衣殼蛋 白特異性結(jié)合的單克隆抗體； 所述檢測線（4)由可與所述A組輪狀病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì) 控線（5)由與所述輪狀病毒以及所述可與A組輪狀病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的 抗體涂層形成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙 條，其特征在于，所述結(jié)合墊（2)上噴涂的所述可與A組輪狀病毒特異性結(jié)合的單克隆抗體 為鼠抗A組輪狀病毒衣殼蛋白單克隆抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試 紙條，其特征在于，形成所述檢測線（4)的所述可與A組輪狀病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體 為羊抗A組輪狀病毒多克隆抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析 試紙條，其特征在于，形成所述質(zhì)控線（5)的抗體為羊抗鼠 IgG多克隆抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層 析試紙條，其特征在于，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為發(fā)射波長為650-1000nm的熒光分 子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試 紙條，其特征在于，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為NHS活化的低噪聲激發(fā)式熒光染料 DyLight800。
7. -種制備權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫 層析試紙條的方法，其特征在于，包括如下步驟： A) 取以PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料DyLight800與所述A組輪 狀病毒衣殼蛋白單克隆抗體按質(zhì)量比為1:4混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后將 所得的標(biāo)記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析過夜，向所述標(biāo)記好的抗體溶液 標(biāo)記產(chǎn)物中添加終濃度為1. 5% BSA、0. 1% Tween20和疊氮化鈉0. 15%。，4°0保存，備用； B) 在所述結(jié)合墊（2)上噴涂以層析緩沖液稀釋4000倍后的上述步驟A)中的所述標(biāo)記 產(chǎn)物，然后室溫風(fēng)干，備用； C) 使用含5% BSA，0. 1% Tween 20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊（1)上，室溫風(fēng)干 后，備用； D) 分別取所述A組輪狀病毒多克隆抗體和所述與A組輪狀病毒以及可與A組輪狀病毒 特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體用劃線機(jī)在所述抗體承載膜（3)上劃所述檢測線 (4)和所述質(zhì)控線（5)，室溫風(fēng)干，備用； E)將上述步驟獲得的所述樣品墊（1)、所述結(jié)合墊（2)、所述抗體承載膜（3)和所述吸 水墊（6)沿所述底板（7)的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得。
8. 權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫層析試紙 條在定性及定量檢測輪狀病毒領(lǐng)域中的用途。
9. 一種利用權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的A組輪狀病毒免疫 層析試紙條檢測輪狀病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 以pH為7. 2的PBS緩沖液稀釋處理待測樣品，取上清液作為待檢樣，另取所述PBS 緩沖液作為陰性對照，分別以利用權(quán)利要求1-6任一所述的試紙條進(jìn)行免疫層析檢測； b) 熒光掃描所述檢測線（4)和所述質(zhì)控線（5)，分別測定所述檢測線（4)和所述質(zhì)控 線（5)區(qū)域的熒光強(qiáng)度，若所述質(zhì)控線（5)區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反 之則無效；若所述檢測線（4)區(qū)域同時出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測A組輪狀病毒的方法，其特征在于，還包括制備標(biāo)準(zhǔn)曲 線及定量檢測的步驟：其中 所述制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟包括：取A組輪狀病毒衣殼蛋白抗原配制成1-100倍梯度濃 度的系列標(biāo)準(zhǔn)品；并將上述濃度系列標(biāo)準(zhǔn)品分別用所述的試紙條進(jìn)行免疫層析，熒光掃描 所述檢測線（4)和所述質(zhì)控線（5)，分別測定所述檢測線（4)和所述質(zhì)控線（5)區(qū)域的熒光 強(qiáng)度，制作抗原濃度與熒光強(qiáng)度比之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合方程； 所述定量檢測的步驟包括：取待測樣品以所述的試紙條進(jìn)行免疫層析檢測，利用上述 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程計算得到所述A組輪狀病毒濃度。
【文檔編號】G01N33/533GK104502608SQ201410814970
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】張捷, 張巖, 楊向瑩, 李錦豐, 張惠媛, 劉潔, 張曉光, 舒咬根, 陳廣全 申請人:北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 河北省食品檢驗研究院, 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院