一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化simple同部位標記診斷方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SIMPLE 同部位標記診斷方法及其試劑盒。其試劑盒包括：肥大細胞（MC）第一抗體，該第一抗體為鼠抗人MC單克隆抗體；IgE第一抗體，該第一抗體為鼠抗人IgE單克隆抗體；通用型第二抗體試劑；抗原修復試劑；DAB顯色液、AEC顯色液及緩沖液系統(tǒng)等。該試劑盒具有價格低、特異性好、敏感性強、準確性高、穩(wěn)定性好、簡單通用的特性。主要應用于病理學與法醫(yī)病理學的鑒定中，能精準地提供過敏性休克直觀的病理學依據(jù)。
【專利說明】—種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SIMPLE同部位標記診斷方法及其試劑盒

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測【技術領域】，涉及一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法及其試劑盒。

【背景技術】
[0002]過敏性休克(anaphylaxis, anaphylactic shock)為I型變態(tài)反應,是外界某些抗原性物質(zhì)進入已致敏的機體后，通過免疫機制在短時間內(nèi)發(fā)生的一種強烈的多臟器累及癥群。
[0003]MC以及MC活化后脫顆粒是過敏性休克發(fā)生發(fā)展的核心。MC被激活后其內(nèi)部的富含類胰蛋白酶的顆粒和組胺顆粒均釋放入血液中，MC中類胰蛋白酶的外溢情況已被作為衡量有無過敏性休克的重要指標之一。除了血清檢測該酶的方法外，還可以針對患者體內(nèi)病變組織進行免疫組織化學方法檢測MC胞內(nèi)以及胞外的類胰蛋白酶含量。再運用相關軟件進行分析MC活化情況，并進一步診斷過敏性休克類型。
[0004]過敏性休克是臨床上高發(fā)的急癥之一，占每年法醫(yī)糾紛的10 %左右，但由于疾病發(fā)病突然，尸檢時只見猝死時組織臟器淤血水腫等非特異性表現(xiàn)，很難發(fā)現(xiàn)明確的形態(tài)學改變，法醫(yī)學司法鑒定時還需結合死者過敏史、用藥史，并排除其他種種死因才能診斷，這給過敏性休克的法醫(yī)學診斷帶來極大的不便，因此尋找簡便易行的診斷指標成了亟待解決的問題。過敏性休克機制中MC、脫顆粒MC、IgE, EOS發(fā)揮了極大作用，但MC脫顆粒率至今還很少有報道，IgE和EOS也多限于動物模型的研究，并且在人體尚未出現(xiàn)它們的聯(lián)合測定及相關意義的探討。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，提供一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法及其試劑盒。通過免疫組化同部位標記技術以觀察IgE與MC脫顆粒共定位，可作為過敏休克的病理診斷指標。
[0006]本發(fā)明一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法，包括如下步驟:
步驟一:制作組織片；
步驟二:抗原修復——IgE:先將抗原修復試劑I放入高壓鍋，煮沸后將組織片放入，冒氣后3min關火，從高壓鍋取出組織片及抗原修復試劑，自然冷卻至室溫；
步驟三:采用PBS緩沖液洗3次，每次5min ;滴加用PBS稀釋過的IgE第一抗體在組織片上，將組織片放入濕盒，4°C過夜處理；分別用PBS洗3次，每次5min ；
步驟四:將所有組織片均加入通用型二抗試劑，并在37°C中孵育30min左右；用？85溶液洗凈所有組織片3min，共計3次；
步驟五:采用AEC顯色液顯色(該過程將在光學顯微鏡下進行染色程度控制)，流水終止顯色后繼續(xù)沖洗1min ；
步驟六:蘇木素復染lmin，流水沖2min，放入1%鹽酸酒精分化液中分化6_8秒，流水沖5min ；
步驟七:將組織片浸入70%酒精、80%酒精、90%酒精、1000%酒精中均為5min ;再用二甲苯對組織片進行透明5min，共計3次；用中性樹膠封片；
步驟八:用全自動的生物顯微鏡對所有組織片進行掃描拍照保存；
步驟九=SMPLE法組織片褪片-將所有組織片置入60°C以上的熱水之中，用PBS液洗5min，共計3次，以洗去封片劑AEC ;隨后將其放入含有濃度80%酒精的染缸中進行操作，并在搖床上進行I小時振搖，用PBS液洗5min，共計3次；之后將組織片置入Tris-HCl液中過夜，用PBS液洗5min，共計3次；
步驟十:再次抗原修復——MC:將抗原修復試劑2滴加到組織片上，將組織片放入濕盒，37 °C恒溫孵育20min ；
步驟十一:采用PBS緩沖液洗3次，每次5min ;滴加稀釋后的MC第一抗體組織片放入濕盒，4°C過夜處理；分別用PBS洗3次，每次5min ；
步驟十二:將所有組織片均加入通用型二抗試劑，并在37°C中孵育30min左右；用PBS溶液洗凈所有組織片3min，共計3次；
用PBS液洗5min，共計3次；
步驟十三:配制DAB顯色液，用DAB液進行顯色(該過程將在光學顯微鏡下進行染色程度控制)，并在該過程中不斷流水沖洗；
步驟十四:蘇木素復染lmin，流水沖2min，放入1%鹽酸酒精分化液中分化6_8秒，流水沖5min ;用飽和碳酸鋰液進行10秒返藍，隨后用自來水進行3 min沖洗；
步驟十四:將組織片浸入70%酒精、80%酒精、90%酒精、1000%酒精中均為5min ;再用二甲苯對組織片進行透明5min，共計3次；用中性樹膠封片；
步驟十五:之后用顯微鏡進行觀察、拍照而且分析相關陽性產(chǎn)物。觀察過敏組及對照組中MC及IgE表達的關系。
[0007]步驟十六:空白對照:滴入MC第一抗時用加PBS的組織片做對照，以確定首次滴入的一抗被洗脫完全。
[0008]其中，所述PBS緩沖液為0.01mol/L (ρΗ7.2-7.4)的PBS緩沖液；
所述第一抗體為:
1)MC第一抗體:鼠抗人MC單克隆抗體
2)IgE第一抗體:鼠抗人IgE單克隆抗體
所述MC第一抗體稀釋液為PBS緩沖液中同時加入鼠抗人MC單克隆抗體，第一抗體和PBS緩沖液的比例為1:100 ；
所述IgE第一抗體稀釋液為PBS緩沖液中同時加入鼠抗人IgE單克隆抗體，第一抗體和PBS緩沖液的比例為1:100 ；
所述抗原修復試劑I為朽1檬酸鹽0.01Μ, Ph6.0 ；
所述抗原修復試劑2為0.125 %的胰蛋白酶消化液；
所述DAB顯色液為比例為1:50-1:100配置新鮮DAB顯色液；
所述AEC顯色液為比例為1:50-1:100配置新鮮AEC顯色液； 所述通用型二抗試劑為辣根過氧化物酶進行標記的二抗(即Ig-HRP)；
所述 Tris-HCl 液為 0.01mol/L(pHl.5)的 Tris-HCl 溶液。
[0009]上述所述一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法，組織片的制作方法:
步驟一:先將石蠟標本連續(xù)組織片(每片基本為4-6Mm厚度)，用蒸餾水將所有組織片進行攤片，隨后放在60°C烤箱內(nèi)烤片2小時；浸入100% 二甲苯溶液30min，共3次；依次浸入梯度100%酒精溶液，95%酒精溶液，85%酒精溶液，75%酒精溶液，各5min ;蒸餾水洗3次，每次5min ；
步驟二:室溫下浸入濃度3%的過氧化氫溶液1min (可略)；
步驟三:再將組織片放在PBS中洗凈5min，共計3次，得到準備進行檢測的組織片。
[0010]上述所述一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法，包括以下步驟:
顯微鏡觀察:
步驟一:MC陽性細胞判斷，
MC陽性細胞核形態(tài):呈圓形或橢圓形，形狀規(guī)則，大小不等，
MC陽性細胞胞漿形態(tài):胞漿表達明顯的黃色或棕黃色陽性顆?；驈浡罴礊殛栃约毎?；
步驟二:脫顆粒肥大細胞的判定:細胞呈不規(guī)則形，可見周圍黃色或棕黃色陽性顆粒脫出；
步驟三:IgE陽性判斷，以胞漿或胞膜出現(xiàn)棕紅色染色為陽性。
[0011]上述所述一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法，包括以下步驟:
其圖像分析與結果判定:
觀察過敏組及對照組中MC及IgE表達的關系；對免疫組織化學染色后進行樹膠封片處理的組織片進行觀察，利用全能顯微鏡(Leica DMRXA2)和圖像采集系統(tǒng)(Leica頂50)，隨機選取不重復的10個高倍視野來進行實驗結果圖像采集；使用圖像分析軟件(Image-Pix)Plus 6.0)進行實驗結果的圖像分析:計錄每張圖片中脫顆粒MC數(shù)及MC總數(shù)，以10個視野MC計數(shù)的均值作為此圖片的最后平均數(shù)作為統(tǒng)計量，并計算出每張圖片10個視野的平均MC脫顆粒率(MC脫顆粒率=10個視野脫顆粒MC數(shù)/ 10個視野MC總數(shù)X 100 %)作為最后MC脫顆粒率的統(tǒng)計量；IgE計數(shù)每張圖片10個視野的陽性細胞，以10個視野計數(shù)的均值作為此圖片的最后的平均數(shù)作為統(tǒng)計量。
[0012]上述所述的方法，其特征在于，包括以下步驟:
判斷免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法所檢測的MC脫顆粒與IgE表達情況，觀察其MC脫顆粒率是否大于50%以及MC脫顆粒率與IgE表達是否呈正相關，尤其是有無共表達,如有,則表明是過敏性休克。
[0013]一種用于病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷的試劑盒，其內(nèi)容物包括:
抗原修復試劑(檸檬酸鹽0.01M, PH6.0)；
MC第一抗體:鼠抗人MC單克隆抗體； IgE第一抗體:鼠抗人IgE單克隆抗體。
本發(fā)明的優(yōu)點在于:
本發(fā)明的一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷試劑盒具有價格低、特異性好、敏感性強、準確性高、穩(wěn)定性好、簡單通用的特性。
[0014]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為過敏性休克死者大體標本(a喉頭明顯水腫，聲門關閉；b雙肺水腫)；
圖2為標本組織形態(tài)學觀察；(a過敏組喉粘膜輸送水腫HEX 200 ;b過敏組肺組織急性肺淤血水腫HE HEX 200 ；c過敏組腸組織平滑肌痙攣HEX 200)；
圖3-1為過敏性休克死者腸組織連續(xù)組織片，同一區(qū)域MC及IgE的分布，其中，A:MC的分布(AEC顯色法)；B =IgE陽性細胞的分布(DAB顯色法)(X400)；
圖3-2過敏性休克死者喉組織Simple同部位標記法染色，同一區(qū)域MC及IgE的分布，其中，A:MC的分布(AEC顯色法)；B =IgE陽性細胞的分布(DAB顯色法)。

【具體實施方式】
[0015]下面結合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細的說明。
[0016]本實施例的具體實施過程:
1.懷疑過敏性休克死亡病例病理尸檢以及取材規(guī)范與評定準則
(I)按規(guī)范尸檢方法完整取出舌、喉頭、氣管與肺，尸檢現(xiàn)場觀察并拍照記錄喉頭有無明顯水腫以及聲門開放情況，肺有無膨隆并稱重。固定后之肺大體標本置于切肺板上，將肺背側緊貼板面，左手將肺固定于板上，用力均勻，盡可能使肺大面積貼在板面。沿肺長軸自外側緣向肺門作一水平切面，觀察有無水腫液溢出。
[0017](2)組織學取材:分別對喉頭、氣管、肺與腸進行取材，肺必須包括各個肺葉，每葉至少I塊，每塊厚3mm?4mm,面積2cmX 2cm左右,將腸標本置于站板上,沿腸管縱軸、橫軸分別取材。取材的組織塊要包括病變和可疑病變。取材組織塊編號要與大體保持一致。組織學組織片采用常規(guī)石蠟組織片及蘇木素伊紅染色。
[0018](3)大體標本眼觀病變攝像記錄方法攝像器材:
翻拍架:四角對稱，斜射45°對稱燈臺架；
相機及鏡頭:單反數(shù)碼照相機配置AF35-70mmf/2.8自動變焦鏡頭；像素要求不低于M3216X2136。
[0019]光源:6400K日光色
操作方法:尸檢現(xiàn)場拍攝固定后喉頭、肺、腸大體標本情況。固定相機于攝像臺升降桿上，調(diào)整相機高度，鏡頭到標本的一般距離為800mm，可根據(jù)標本大小構圖要求適當加以調(diào)整。將肺標本表面粘液、水分充分吸干，放在閱片燈乳白玻璃上，對取材前切面拍照一次，取材標記后再拍照一次。
[0020]2.石蠟標本和組織片的制作
所有標本均用10%中性福爾馬林溶液在常溫下進行固定，一般時間為24?48小時，再按石蠟標本的制作標準進行取材。常規(guī)實驗過程為:先進行標本脫水，再行透明，最后將標本浸蠟以及石蠟包埋。最后將制作符合標準的石蠟標本進行連續(xù)組織片，片子常規(guī)厚度為4?6 μ m，40°C蒸餾水對組織片進行攤片，隨后用APES處理之后的載玻片來撈取符合標準的無刀痕以及褶皺的完整組織片。
[0021]3.HE 染色
組織片常規(guī)HE染色，確定過敏性休克及對照組喉、肺、腸組織的組織學類型及其過敏反應的病理學表現(xiàn)；
(1)先挑取符合標準的組織片，將它們放在60°C烤箱中進行I小時左右烤片；
(2)采用二甲苯溶液對標本進行脫蠟，時長為5min，共計3次；
(3)隨后依次將組織片浸入100%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精中均為5min左右，取出用自來水沖洗(計時:3min)；
(4)浸入蘇木素染液2min；
(5)將染色后的組織片放在自來水中沖洗(時長為5min)；
(6)用濃度為I%的鹽酸酒精溶液(一般按70%濃度酒精液配制而成)分化時間為6-8秒左右，隨后用自來水沖洗組織片標本3min ；
(7)用0.5%伊紅染液對組織片標本進行5秒左右染色；
(8)隨后采用70%酒精、80%酒精、90%酒精、100%酒精溶液對標本進行脫水，各時長為 2min ；
(9)再用二甲苯對組織片進行透明5min，共計3次；
(10)最后用中性樹膠封片:先擦去標本組織片周圍過剩的二甲苯液，不要讓其干涸，隨后迅速滴加中性樹膠，再用蓋玻片進行封固。
[0022]4.SIMPLE同部位標記法
采用SMPLE同部位標記檢測過敏組及對照組喉、腸、肺組織中MC、脫顆粒MC、IgE的分布；
(O先將實驗標本連續(xù)組織片(每片基本為4Mm厚度)，用蒸餾水將所有組織片進行攤片，隨后放在60°C烤箱內(nèi)烤片3小時；
(2)采用二甲苯溶液對標本進行脫蠟，時長為lOmin，共計3次；
(3)隨后依次其組織片放入浸入100%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精中均為5min左右,取出用自來水沖洗(計時:3min);
(4)再將標本組織片放在蒸餾水中洗凈5min，共計3次；
(5)室溫下用濃度3%的過氧化氫溶液對標本進行孵育12min;
(6)再用蒸餾水洗凈所有標本組織片3min，共計3次；
(7)抗原修復——IgE:先將抗原修復試劑I放入高壓鍋，煮沸后將組織片放入，冒氣后3min關火，從高壓鍋取出組織片及抗原修復試劑，自然冷卻至室溫；
(8)采用PBS緩沖液洗3次，每次5min;滴加用PBS稀釋過的IgE第一抗體在組織片上，將組織片放入濕盒，4°C過夜處理；分別用PBS洗3次，每次5min ；
(9)將所有組織片均加入通用型二抗試劑，并在37°C中孵育30min左右；用PBS溶液洗凈所有組織片3min,共計3次；
(10)采用AEC顯色液顯色(該過程將在光學顯微鏡下進行染色程度控制)，流水終止顯色后繼續(xù)沖洗1min ；
(11)蘇木素復染lmin，流水沖2min，放入1%鹽酸酒精分化液中分化6_8秒，流水沖5min ；
(12)將組織片浸入70%酒精、80%酒精、90%酒精、1000%酒精中均為5min;再用二甲苯對組織片進行透明5min，共計3次；用中性樹膠封片；
(13)用全自動的生物顯微鏡對所有組織片進行掃描拍照保存；
(14)SIMPLE法組織片褪片-將所有組織片置入60°C以上的熱水之中，用PBS液洗5min，共計3次，以洗去封片劑AEC ;隨后將其放入含有濃度80%酒精的染缸中進行操作，并在搖床上進行I小時振搖，用PBS液洗5min，共計3次；之后將組織片置入Tris-HCl液中過夜，用PBS液洗5min，共計3次；
(15)再次抗原修復一MC:將抗原修復試劑2滴加到組織片上，將組織片放入濕盒，37 °C恒溫孵育20min ；
(16)PBS洗5minX3次；滴加稀釋后的MC第一抗體組織片放入濕盒，4°C過夜處理；分別用PBS洗3次，每次5min ；
(17)將所有組織片均加入通用型二抗試劑，并在37°C中孵育30min左右；用PBS溶液洗凈所有組織片3min，共計3次；
用PBS液洗5min，共計3次；
(18)配制DAB顯色液，用DAB液進行顯色(該過程將在光學顯微鏡下進行染色程度控制)，并在該過程中不斷流水沖洗；
(19)蘇木素復染lmin，流水沖2min，放入1%鹽酸酒精分化液中分化6_8秒，流水沖5min ;用飽和碳酸鋰液進行10秒返藍，隨后用自來水進行3 min沖洗；
(20)將組織片浸入70%酒精、80%酒精、90%酒精、1000%酒精中均為5min;再用二甲苯對組織片進行透明5min，共計3次；用中性樹膠封片；
(21)之后用顯微鏡進行觀察、拍照而且分析相關陽性產(chǎn)物。觀察過敏組及對照組中MC及IgE表達的關系。
[0023](22)空白對照:滴入MC第一抗時用加PBS的組織片做對照，以確定首次滴入的一抗被洗脫完全。
[0024]5.SIMPLE同部位標記法，觀察過敏組及對照組中MC及IgE表達的關系；
(1)細胞陽性染色結果判定:將進行觀察MC、IgE在過敏性猝死死者喉、肺、腸組織中的表達情況；
A.MC陽性細胞:呈圓形或橢圓形，形狀規(guī)則，大小不等，胞漿表達明顯的黃色或棕黃色陽性顆粒或彌漫狀即為陽性細胞；脫顆粒肥大細胞的判定:細胞呈不規(guī)則形，可見周圍黃色或棕黃色陽性顆粒脫出；
B.1gE陽性細胞:以胞漿或胞膜出現(xiàn)棕紅色染色為陽性；
(2)細胞陽性標記指數(shù)的測定
對免疫組織化學染色后進行樹膠封片處理的組織片進行觀察，利用全能顯微鏡(LeicaDMRXA2)和圖像采集系統(tǒng)(Leica頂50)，隨機選取不重復的10個高倍視野來進行實驗結果圖像采集；使用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)進行實驗結果的圖像分析:計錄每張圖片中脫顆粒MC數(shù)及MC總數(shù)，以10個視野MC計數(shù)的均值作為此圖片的最后平均數(shù)作為統(tǒng)計量，并計算出每張圖片10個視野的平均MC脫顆粒率(MC脫顆粒率=10個視野脫顆粒MC數(shù)/ 10個視野MC總數(shù)X 100 %)作為最后MC脫顆粒率的統(tǒng)計量；IgE計數(shù)每張圖片10個視野的陽性細胞，以10個視野計數(shù)的均值作為此圖片的最后的平均數(shù)作為統(tǒng)計量。
[0025]6.圖像分析及免疫組化結果判定
應用Leica IM50圖像采集系統(tǒng)和Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對染色結果進行分析；
7.統(tǒng)計學分析
應用SPSS13.0對統(tǒng)計結果進行分析,采用T檢驗、Spearman相關分析和regress1n線性回歸。MC、MC脫顆粒率、IgE分布在不同組別之間的差異采用T檢驗；MC、MC脫顆粒率、IgE的相互關系及與死亡時間的探討用Spearman相關分析；腸IgE及肺MC脫顆粒率被死亡時間影響用regress1n線性回歸。顯著性標準定位為:將結果為P< 0.05的視為差異有統(tǒng)計學意義，將結果P< 0.01視為差異具有高度統(tǒng)計學意義。
[0026]本試驗共收集72例的喉、肺、小腸組織標本，所有標本均來自汕頭大學司法鑒定中心，其中20例經(jīng)臨床及病理診斷死因為過敏性休克，另52例為對照組，經(jīng)臨床及病理資料證明無過敏性疾病。52例標本死因統(tǒng)計為6例中毒、3例腦溢血、4例新生兒難產(chǎn)窒息、5例呼吸道感染至器官衰竭、12例外傷、12例心臟疾病、2例中暑、3例血管栓塞、I例自殺窒息、I例電擊死亡、I例敗血癥、2例產(chǎn)后大出血。
[0027]通過對72例的喉、肺、小腸組織標本進行MC、MC脫顆粒率、IgE相關分析，結果顯示在喉組織中MC與IgE、MC脫顆粒率與IgE表達是呈正相關關系，肺組織中MC與IgE呈正相關，腸組織中MC脫顆粒率與IgE表達是呈正相關關系。同時觀察到IgE定位于MC膜上或者MC胞漿、漿細胞胞漿中，由IgE定位的MC絕大多數(shù)處于脫顆粒狀態(tài)。
[0028]本試驗對過敏性休克死亡及電擊死亡、心梗死亡的死者組織進行MC及IgE的Simple同部位標記對比觀察，以直觀清楚的確定組織中MC與IgE的關系。結果發(fā)現(xiàn)，在過敏性休克死亡組織中MC及其脫顆?，F(xiàn)象較多，IgE常定位于脫顆粒MC的胞膜及胞質(zhì)中，在非過敏組中，IgE的表達幾乎為陰性，同時MC個數(shù)較少且脫顆?，F(xiàn)象極少。
【權利要求】
1.一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法，其特征在于: 步驟一:制作組織片； 步驟二:抗原修復——IgE:先將抗原修復試劑I放入高壓鍋，煮沸后將組織片放入，冒氣后3min關火，從高壓鍋取出組織片及抗原修復試劑1，自然冷卻至室溫； 步驟三:采用PBS緩沖液洗3次，每次5min ;滴加IgE第一抗體稀釋液在組織片上，放入濕盒中，過夜孵育； 步驟四:將所有組織片均加入通用型二抗試劑，37°C中孵育； 步驟五:采用AEC顯色液顯色(該過程將在光學顯微鏡下進行染色程度控制)； 步驟六:蘇木素復染后脫水透明，用中性樹膠封片； 步驟七:用全自動的生物顯微鏡對所有組織片進行掃描拍照保存； 步驟八=SMPLE法組織片褪片——將所有組織片置入60°C以上的熱水之中，用PBS液洗5min，共計3次，以洗去封片劑AEC ;隨后將其放入含有濃度80%酒精的染缸中進行操作，并在搖床上進行I小時振搖，用PBS液洗5min，共計3次；之后將組織片置入Tris-HCl液中過夜，用PBS液洗5min，共計3次； 步驟九:再次抗原修復一MC:將抗原修復試劑2滴加到組織片上，將組織片放入濕盒，37 °C恒溫孵育20min ； 步驟十:采用PBS緩沖液洗3次，每次5min ;滴加MC第一抗體稀釋液在組織片上，放入濕盒，過夜孵育； 步驟十一:將所有組織片均加入通用型二抗試劑，并在37°C中孵育； 步驟十二:配制DAB顯色液，用DAB液進行顯色(該過程將在光學顯微鏡下進行染色程度控制)，并在該過程中不斷流水沖洗； 步驟十三:蘇木素復染后脫水透明，用中性樹膠封片； 步驟十四:用顯微鏡進行觀察、拍照而且分析相關陽性產(chǎn)物，觀察過敏組及對照組中MC及IgE表達的關系； 步驟十五:空白對照:滴入MC第一抗時用加PBS的組織片做對照，以確定首次滴入的一抗被洗脫完全。
2.如權利要求1所述一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法，其特征在于: 所述PBS緩沖液為0.01mol/L (ρΗ7.2-7.4)的PBS緩沖液； 所述第一抗體為: 1)MC第一抗體:鼠抗人MC單克隆抗體 2)IgE第一抗體:鼠抗人IgE單克隆抗體 所述MC第一抗體稀釋液為PBS緩沖液中同時加入鼠抗人MC單克隆抗體，第一抗體和PBS緩沖液的比例為1:100 ； 所述IgE第一抗體稀釋液為PBS緩沖液中同時加入鼠抗人IgE單克隆抗體，第一抗體和PBS緩沖液的比例為1:100 ； 所述抗原修復試劑I為朽1檬酸鹽0.01Μ, Ph6.0 ； 所述抗原修復試劑2為0.125 %的胰蛋白酶消化液； 所述AEC顯色液為比例為1:50-1:100配置新鮮AEC顯色液； 所述DAB顯色液為比例為1:50-1:100配置新鮮DAB顯色液； 所述通用型二抗試劑為辣根過氧化物酶進行標記的二抗(即Ig-HRP)； 所述 Tris-HCl 液為 0.01mol/L(pHl.5)的 Tris-HCl 溶液。
3.如權利要求1所述一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法，其特征在于，組織片的制作方法: 步驟一:先將石蠟標本連續(xù)組織片(每片基本為4-6Mm厚度)，用蒸餾水將所有組織片進行攤片，隨后放在60°C烤箱內(nèi)烤片2小時；浸入100% 二甲苯溶液30min，共3次；依次浸入梯度100%酒精溶液，95%酒精溶液，85%酒精溶液，75%酒精溶液，各5min ;蒸餾水洗3次，每次5min ； 步驟二:室溫下浸入濃度3%的過氧化氫溶液1min (可略)； 步驟三:再將組織片放在PBS中洗凈5min，共計3次，得到準備進行檢測的組織片。
4.如權利要求1所述一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法，其特征在于，包括以下步驟: 顯微鏡觀察: 步驟一:MC陽性細胞判斷， MC陽性細胞核形態(tài):呈圓形或橢圓形，形狀規(guī)則，大小不等， MC陽性細胞胞漿形態(tài):胞漿表達明顯的黃色或棕黃色陽性顆?；驈浡罴礊殛栃约毎? 步驟二:脫顆粒肥大細胞的判定:細胞呈不規(guī)則形，可見周圍黃色或棕黃色陽性顆粒脫出； 步驟三:IgE陽性判斷，以胞漿或胞膜出現(xiàn)棕紅色染色為陽性。
5.如權利要求1所述一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法，其特征在于，包括以下步驟: 其圖像分析與結果判定: 觀察過敏組及對照組中MC及IgE表達的關系；對免疫組織化學染色后進行樹膠封片處理的組織片進行觀察，利用全能顯微鏡(Leica DMRXA2)和圖像采集系統(tǒng)(Leica頂50)，隨機選取不重復的10個高倍視野來進行實驗結果圖像采集；使用圖像分析軟件(Image-Pix)Plus 6.0)進行實驗結果的圖像分析:計錄每張圖片中脫顆粒MC數(shù)及MC總數(shù)，以10個視野MC計數(shù)的均值作為此圖片的最后平均數(shù)作為統(tǒng)計量，并計算出每張圖片10個視野的平均MC脫顆粒率(MC脫顆粒率=10個視野脫顆粒MC數(shù)/ 10個視野MC總數(shù)X 100 %)作為最后MC脫顆粒率的統(tǒng)計量；IgE計數(shù)每張圖片10個視野的陽性細胞，以10個視野計數(shù)的均值作為此圖片的最后的平均數(shù)作為統(tǒng)計量。
6.如權利要求5所述一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法，其特征在于，包括以下步驟: 判斷免疫組化SMPLE同部位標記診斷方法所檢測的MC脫顆粒與IgE表達情況，觀察其MC脫顆粒率是否大于50%以及MC脫顆粒率與IgE表達是否呈正相關，尤其是有無共表達,如有,則表明是過敏性休克。
7.一種病理尸檢過敏性休克的免疫組化SMPLE同部位標記診斷試劑盒，其特征在于:內(nèi)容物包括:抗原修復試劑I (檸檬酸鹽0.0lM, PH6.0)；抗原修復試劑2 (0.125 %的胰蛋白酶消化液)MC第一抗體:鼠抗人MC單克隆抗體；IgE第一抗體:鼠抗人IgE單克隆抗體；通用型第二抗體試劑；DAB顯色液；AEC顯色液。
【文檔編號】G01N1/28GK104502609SQ201410819203
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月25日 優(yōu)先權日:2014年12月25日
【發(fā)明者】蘇敏, 王曉艷, 田東萍, 蘇雪, 劉茜 申請人:汕頭大學醫(yī)學院