重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中Triton X-100殘留量的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中Triton X-100殘留量的測(cè)定方法，包括有對(duì)照品溶液配制步驟、待測(cè)品溶液配制步驟和Triton X-100測(cè)定步驟，所述待測(cè)品溶液配制步驟包括：對(duì)每組待測(cè)品中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)，甄別出蛋白質(zhì)含量大于一個(gè)閾值的待測(cè)品和蛋白質(zhì)含量小于所述閾值的待測(cè)品；分別用1份水通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行第一次洗雜；對(duì)蛋白質(zhì)含量大于所述閾值的待測(cè)品，再用1份水通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行再次洗雜；用1份體積濃度為2％～70％的甲醇溶液通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行第三次洗雜。本發(fā)明可有效去除原液中的蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)及其他干擾物質(zhì)對(duì)Triton X-100殘留量測(cè)定的影響，回收率高，能準(zhǔn)確地測(cè)定原液中的Triton X-100殘留量，其檢測(cè)限可到達(dá)1μg/ml級(jí)。
【專利說(shuō)明】重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中TritonX-100殘留量的 測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組基因工程乙型肝炎疫苗的配制技術(shù)，尤其涉及一種重組釀酒酵母 表達(dá)的HBsAg原液中TritonX-100殘留量的測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是乙型肝炎高流行區(qū)，每年平均報(bào)告發(fā)病人50多萬(wàn)例，而接種乙肝疫苗是預(yù) 防乙型肝炎最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法。利用重組釀酒酵母表達(dá)乙肝表面抗原（h印atitisB surfaceantigen,HBsAg)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)乙型肝炎疫苗，是一種容易獲取培養(yǎng)基、成本 低、生產(chǎn)率高的乙肝疫苗生產(chǎn)工藝，可滿足我國(guó)對(duì)乙肝疫苗的大量需求。
[0003] 聚乙二醇辛基苯基醚（Tritonx-100)是一種非離子型表面活性劑（或稱去污 劑），它能溶解脂質(zhì)，以增加脂蛋白的溶解性。
[0004] 重組釀酒酵母菌發(fā)酵后，經(jīng)破碎、純化，得到用于配制乙肝疫苗的HBsAg原液， HBsAg原液的蛋白質(zhì)含量為20yg/ml?250iig/ml。在所述純化工藝中，添加了Triton X-100作為蛋白抽提液或洗脫劑，而待抗原純化后，需要去除其中殘留的TritonX-100。 HBsAg原液中的TritonX-100殘留量是原液質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)之一。
[0005] 現(xiàn)行《中國(guó)藥典》中規(guī)定，在重組乙型肝炎疫苗生產(chǎn)工藝樣品中，TritonX-100殘 留量的測(cè)定方法是苯酚與TritonX-100反應(yīng)生成白色渾濁物質(zhì)，采用分光光度法測(cè)定。該 方法檢測(cè)限只能達(dá)到10Ug/ml，并且樣品中的蛋白質(zhì)對(duì)TritonX-100含量測(cè)定有干擾。
[0006] 采用高效液相色譜法，根據(jù)待測(cè)品的峰面積計(jì)算出TritonX-100的含量，是一種 較為先進(jìn)的檢測(cè)生物制品中TritonX-100殘留量的有效方法。這種方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確 性高、省時(shí)簡(jiǎn)便，已經(jīng)被應(yīng)用于測(cè)定血漿制品、抗毒素/抗血清、纖原等多種生物制品中的 TritonX-100 殘留量。
[0007] 在采用高效液相色譜法測(cè)定一些含有雜質(zhì)的樣品溶液中Tritonx-100的含量之 前，為了保護(hù)液相色譜柱和保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，還需要對(duì)樣品溶液進(jìn)行預(yù)處理，去除樣 品溶液中的干擾物質(zhì)。在現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)血漿、抗毒素/抗血清等制品，采用固相萃取柱活 化后對(duì)樣品溶液進(jìn)行上樣、洗雜、洗脫處理，可有效去除樣品溶液中的干擾物質(zhì)。
[0008] 然而，發(fā)明人在研究本發(fā)明的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，重組釀酒酵母菌表達(dá)的乙肝表面抗原， 經(jīng)純化工藝得到用于配制疫苗的HBsAg原液，其蛋白質(zhì)含量在20yg/ml?250yg/ml之 間，作為大分子物質(zhì)，高濃度的蛋白質(zhì)含量不僅會(huì)對(duì)高效液相色譜法測(cè)定TritonX-100殘 留量的準(zhǔn)確性產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，而且，現(xiàn)有技術(shù)的固相萃取法的洗雜方法，不能有效去除雜質(zhì) 干擾，同時(shí)在高效液相法測(cè)定步驟，配制對(duì)照品的溶劑是水，而待測(cè)品溶液為甲醇溶液，體 系不一致，影響準(zhǔn)確性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種重組釀酒酵母表達(dá)的HBgAs中Triton X-100殘留量的測(cè)定方法，該方法回收率高、檢測(cè)限低，能實(shí)現(xiàn)原液中TritonX-100殘留量 的準(zhǔn)確測(cè)定。
[0010] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開了以下方案：
[0011] 一種重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中Tritonx-100殘留量的測(cè)定方法，包括有 對(duì)照品溶液配制步驟、待測(cè)品溶液配制步驟和TritonX-100測(cè)定步驟，在所述待測(cè)品溶液 配制步驟中，依次通過(guò)固相萃取柱活化、上樣、洗雜和洗脫步驟，對(duì)待測(cè)品進(jìn)行固相萃取處 理，在所述上樣步驟之前，還包括：
[0012] 蛋白質(zhì)含量檢測(cè)步驟，從待檢測(cè)的HBsAg原液中，以按體積計(jì)每份為單位，取若 干組待測(cè)品后，對(duì)每組待測(cè)品中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)，甄別出蛋白質(zhì)含量大于一個(gè)閾 值的待測(cè)品和蛋白質(zhì)含量小于所述閾值的待測(cè)品，其中所述閾值的取值范圍為70yg/ ml-125ug/ml；
[0013] 而所述洗雜步驟包括：
[0014] 一次洗雜步驟，分別用1份水通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行第一次洗雜；
[0015] 二次洗雜步驟，對(duì)蛋白質(zhì)含量大于所述閾值的待測(cè)品，在所述一次洗雜步驟后，分 別再用1份水通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行再次洗雜；
[0016] 三次洗雜步驟，在所述第一洗雜步驟/第二洗雜步驟后，分別用1份體積濃度為 2%?70%的甲醇溶液通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行第三次洗雜。
[0017] 優(yōu)選地，所述閾值的取值為100yg/ml。
[0018] 優(yōu)選地，所述洗脫步驟包括：
[0019] 用90%?100%甲醇1份通過(guò)固相萃取柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，即得到待測(cè)品溶 液。
[0020] 優(yōu)選地，所述TritonX-100測(cè)定步驟包括：
[0021] 液相色譜測(cè)定步驟，分別對(duì)每組所述對(duì)照品溶液和待測(cè)品溶液進(jìn)行高效液相色譜 測(cè)定；
[0022] 方程建立和求解步驟，通過(guò)對(duì)照品溶液的峰面積與對(duì)照品溶液中TritonX-100的 濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將待測(cè)品溶液的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出 待測(cè)品中TritonX-100的殘留量。
[0023] 優(yōu)選地，在所述液相色譜測(cè)定步驟中，采用的色譜柱為WatersSymmetryShield? RP18, 5ym3. 9X150mm反相色譜柱，以甲醇水溶液為流動(dòng)相，采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器監(jiān)測(cè)， TritonX-100的分析波長(zhǎng)范圍在220nm?240nm。
[0024] 優(yōu)選地，所述的甲醇水溶液流動(dòng)相中，甲醇與水的比為70:30?85:15。
[0025] 優(yōu)選地，甲醇水溶液流動(dòng)相比為80:20時(shí)，流動(dòng)相的流速范圍在0. 6ml/?1. 0ml/ 分鐘之間。
[0026] 優(yōu)選地，所述對(duì)照品溶液配制步驟包括：
[0027] 以90%的甲醇溶液配制TritonX-100對(duì)照品溶液，制成若干組1?20iig/ml的 TritonX-100的對(duì)照品溶液。
[0028] 優(yōu)選地，所述活化步驟包括：
[0029] 選取固相萃取柱，并在該固相萃取柱中依次通過(guò)1份甲醇和1份水，對(duì)其進(jìn)行預(yù)先 活化；
[0030] 所述上樣步驟包括：
[0031] 分別將每組待測(cè)品上樣至活化后的固相萃取柱中；
[0032] 且在所述待測(cè)品溶液配制步驟中，液體通過(guò)固相萃取柱的流速不快于1ml/分鐘。
[0033] 優(yōu)選地，在所述活化步驟中，選取的固相萃取柱為WatersOasis?HLBlcc固相 萃取柱。
[0034]本發(fā)明的有益效果是：
[0035] 本發(fā)明的實(shí)施例通過(guò)對(duì)固相萃取進(jìn)行優(yōu)化，在上樣前檢測(cè)待測(cè)品中的蛋白質(zhì)含 量，甄別出蛋白質(zhì)含量高于1〇〇Ug/ml左右的待測(cè)品，并對(duì)其進(jìn)行二次洗雜，并利用反相 高效液相色譜法測(cè)定TritonX-100含量，從而達(dá)到了將TritonX-100的檢測(cè)限降低到 1Ug/ml，能準(zhǔn)確地測(cè)定原液中TritonX-100殘留量的效果。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明提供的重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中TritonX-100 殘留量的測(cè)定方法的一個(gè)實(shí)施例；本實(shí)施例實(shí)現(xiàn)一次重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中 TritonX-100殘留量的測(cè)定主要包括以下步驟：
[0037] 包括有對(duì)照品溶液配制步驟、待測(cè)品溶液配制步驟和TritonX-100測(cè)定步驟，在 所述待測(cè)品溶液配制步驟中，依次通過(guò)固相萃取柱活化、上樣、洗雜和洗脫步驟，對(duì)待測(cè)品 進(jìn)行固相萃取處理，在所述上樣步驟之前，還包括：
[0038] 蛋白質(zhì)含量檢測(cè)步驟，從待檢測(cè)的HBsAg原液中，以按體積計(jì)每份為單位，取若 干組待測(cè)品后，對(duì)每組待測(cè)品中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)，甄別出蛋白質(zhì)含量大于一個(gè)閾 值的待測(cè)品和蛋白質(zhì)含量小于所述閾值的待測(cè)品，其中所述閾值的取值范圍為70yg/ ml-125ug/ml；
[0039] 而所述洗雜步驟具體包括：
[0040]一次洗雜步驟，分別用1份水通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行第一次洗雜；[0041] 二次洗雜步驟，對(duì)蛋白質(zhì)含量大于所述閾值的待測(cè)品，在所述一次洗雜步驟后，分 別再用1份水通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行再次洗雜；
[0042] 三次洗雜步驟，在所述第一洗雜步驟/第二洗雜步驟后，分別用1份體積濃度為 2%?70%的甲醇溶液通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行第三次洗雜。
[0043] 并且，所述洗脫步驟具體包括：
[0044] 用90%?100%甲醇1份通過(guò)固相萃取柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，即得到待測(cè)品溶 液。
[0045] 另外，所述對(duì)照品溶液配制步驟可具體包括：
[0046] 以90%的甲醇溶液配制TritonX-100對(duì)照品溶液，制成若干組濃度為1?20iig/ ml的TritonX-100的對(duì)照品溶液。
[0047] 該步驟中，通過(guò)以甲醇取代現(xiàn)有技術(shù)的水作為溶劑配制對(duì)照品溶液，從而達(dá)到體 系一致化，保證了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0048] 所述活化步驟可具體包括：
[0049] 選取固相萃取柱，并在該固相萃取柱中依次通過(guò)1份甲醇和1份水，對(duì)其進(jìn)行預(yù)先 活化；
[0050] 所述上樣步驟可具體包括：
[0051] 分別將每組待測(cè)品上樣至活化后的固相萃取柱中。
[0052] 具體實(shí)現(xiàn)時(shí)，在所述待測(cè)品溶液配制步驟中，液體通過(guò)固相萃取柱的流速不快于 lml/分鐘。
[0053] 所述TritonX-100測(cè)定步驟可具體包括：
[0054] 液相色譜測(cè)定步驟，分別對(duì)每組所述對(duì)照品溶液和待測(cè)品溶液進(jìn)行高效液相色譜 測(cè)定；
[0055] 方程建立和求解步驟，通過(guò)對(duì)照品溶液的峰面積與對(duì)照品溶液中TritonX-100的 濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將待測(cè)品溶液的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出 待測(cè)品中TritonX-100的殘留量。
[0056] 在所述活化步驟中，選取的固相萃取柱為WatersOasis?HLBlcc固相萃取柱。
[0057] 在所述液相色譜測(cè)定步驟中，采用的色譜柱為WatersSymmetryShield?RP18, 5ym3. 9X150mm反相色譜柱，以甲醇水溶液為流動(dòng)相，采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器監(jiān)測(cè)， TritonX-100的分析波長(zhǎng)范圍為220nm?240nm。
[0058] 且所述的甲醇水溶液流動(dòng)相中，甲醇與水的比為70:30?85:15。
[0059] 甲醇水溶液流動(dòng)相比為80:20時(shí)，流動(dòng)相的流速范圍在0. 6ml/?1. 0ml/分鐘之 間。
[0060] 本實(shí)施例中，各物質(zhì)份均以體積計(jì)。
[0061] 作為本實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，在所述蛋白質(zhì)含量檢測(cè)步驟中，所述閾值的 取值可選取100yg/ml，即，甄別出蛋白質(zhì)含量大于100yg/ml的待測(cè)品和蛋白質(zhì)含量小于 100yg/ml的待測(cè)品；而在所述_次洗雜步驟中，對(duì)蛋白質(zhì)含量大于100Ug/ml的待測(cè)品， 在所述一次洗雜步驟后，分別再用1份水通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行再次洗雜為 佳。
[0062] 為了更進(jìn)一步闡釋本實(shí)施例為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段和效果，對(duì)本 實(shí)施例測(cè)定重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中TritonX-100殘留量的具體步驟，通過(guò)實(shí)例 數(shù)據(jù)詳細(xì)說(shuō)明如下。
[0063]實(shí)例1
[0064] 儀器：
[0065]WatersAlliance2695高效液相色譜儀，WatersPDA2996檢測(cè)器，Waters Empower軟件，梅特勒-托利多XP205電子分析天平。
[0066] 試劑與試藥：
[0067]TritonX-100對(duì)照品：購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)100M0128V;甲醇：HPLC級(jí)，購(gòu)自 Merck公司；水：超純水。
[0068]流程：
[0069] 在對(duì)照品溶液配制步驟中，將TritonX-100對(duì)照品溶解于90%甲醇溶液中，制成 系列濃度分別為1Ug/ml、2. 5yg/ml、5yg/ml、10yg/ml、20yg/ml的對(duì)照品溶液。
[0070] 在活化步驟中，選取WatersOasis?HLBlcc固相萃取柱，先用lml甲醇通過(guò)，再 用lml水通過(guò)。
[0071] 在蛋白質(zhì)含量檢測(cè)步驟中，檢測(cè)到待測(cè)品原液A中的蛋白質(zhì)含量為20iig/ml;待 測(cè)品原液B中的蛋白質(zhì)含量為250iig/ml;
[0072]以原液A為稀釋液，配制成TritonX-100含量為2yg/ml的待測(cè)品PC-原液A; [0073]以原液B為稀釋液，配制成TritonX-100含量為2iig/ml的待測(cè)品PC-原液B。 [0074] 在上樣步驟中，取上述待測(cè)品各1ml，通過(guò)預(yù)先活化好的固相萃取柱。
[0075] 在洗雜步驟中，對(duì)原液A和PC-原液A用1ml水清洗各1次后，或者對(duì)原液B和 PC-原液B用lml水清洗各2次后，用體積濃度為2 %的甲醇溶液lml對(duì)上述待測(cè)品各清洗 1次。
[0076]在洗脫步驟中，用1ml甲醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液即為待測(cè)品溶液。
[0077] 其中，固相萃取中的各步操作，需控制液體流速，流速應(yīng)不快于1ml/分鐘。
[0078] 在TritonX-100測(cè)定步驟中，分別對(duì)所述對(duì)照品溶液配制步驟獲得的對(duì)照品溶液 和待測(cè)品溶液配制步驟獲得的待測(cè)品溶液進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定后，通過(guò)對(duì)照品溶液的 峰面積與對(duì)照品溶液中TritonX-100的濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，并將待測(cè) 品溶液的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出待測(cè)品中的TritonX-100殘留量分別為：原液 八和原液8為〈11^/1111，？(：-原液六為1.841^/1111，？(：-原液8為1.9〇1^/1111。其中，色譜 柱為WatersSymmetryShield?RP18, 5iim3.9X150mm反相色譜柱，甲醇水溶液流動(dòng)相比 70 :30,流速為0. 6ml/分鐘，采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器（PDA)監(jiān)測(cè)，TritonX-100的分析波長(zhǎng) 為 230nm。
[0079]實(shí)例2
[0080] 儀器：
[0081] WatersAlliance2695高效液相色譜儀，WatersPDA2996檢測(cè)器，Waters Empower軟件，梅特勒-托利多XP205電子分析天平。
[0082] 試劑與試藥：
[0083] TritonX-100對(duì)照品，購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)100M0128V;甲醇：HPLC級(jí)，購(gòu)自 Merck公司；水：超純水。
[0084] 流程：
[0085] 在對(duì)照品溶液配制步驟中，將TritonX-100對(duì)照品溶解于90%甲醇溶液中，制成 系列濃度分別為1Ug/ml、2. 5yg/ml、5yg/ml、10yg/ml、20yg/ml的對(duì)照品溶液。
[0086] 在活化步驟中，選取WatersOasis?HLBlcc固相萃取柱，先用1ml甲醇通過(guò)，再 用lml水通過(guò)。
[0087] 在蛋白質(zhì)含量檢測(cè)步驟中，檢測(cè)到待測(cè)品原液C中的蛋白質(zhì)含量為20iig/ml;待 測(cè)品原液D中的蛋白質(zhì)含量為250yg/ml;
[0088] 以原液C為稀釋液，配制成TritonX-100含量為2yg/ml的待測(cè)品PC-原液C;
[0089] 以原液D為稀釋液，配制成TritonX-100含量為2yg/ml的待測(cè)品PC-原液D。
[0090] 在上樣步驟中，取上述待測(cè)品1ml，通過(guò)預(yù)先活化好的固相萃取柱。
[0091] 在洗雜步驟中，對(duì)原液C和PC-原液C用lml水清洗各1次后，或者對(duì)原液D和 PC-原液D用lml水清洗各2次后，用體積濃度為70%的甲醇溶液lml對(duì)上述待測(cè)品各清 洗1次。
[0092] 在洗脫步驟中，用90%甲醇溶液lml洗脫，收集洗脫液，洗脫液即為待測(cè)品溶液。
[0093] 其中，固相萃取中的各步操作，需控制液體流速，流速應(yīng)不快于lml/分鐘。
[0094] 在TritonX-100測(cè)定步驟中，分別對(duì)所述對(duì)照品溶液配制步驟獲得的對(duì)照品溶液 和待測(cè)品溶液配制步驟獲得的待測(cè)品溶液進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定后，通過(guò)對(duì)照品溶液 的峰面積與對(duì)照品溶液中TritonX-100的濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將待測(cè) 品溶液的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出待測(cè)品中的TritonX-100殘留量分別為：原液 C和原液D為〈1yg/ml，PC-原液C為1. 87yg/ml，PC-原液D為1. 90yg/ml。其中，色譜 柱為WatersSymmetryShield?RP18, 5um3.9X150mm反相色譜柱，甲醇水溶液流動(dòng)相比 為80 :20,流速為1. 0ml/分鐘，采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器（PDA)監(jiān)測(cè)，TritonX-100的分析波 長(zhǎng)為240nm。
[0095]實(shí)例 3
[0096]儀器：
[0097]WatersAlliance2695 高效液相色譜儀，WatersPDA2996 檢測(cè)器，Waters Empower軟件，梅特勒-托利多XP205電子分析天平。
[0098] 試劑與試藥：
[0099]TritonX-100對(duì)照品：購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)100M0128V;甲醇：HPLC級(jí)，購(gòu)自 Merck公司；水：超純水。
[0100] 流程：
[0101] 在對(duì)照品溶液配制步驟中，將TritonX-100對(duì)照品溶解于90%甲醇溶液中，制成 系列濃度分別為1Ug/ml、2. 5yg/ml、5yg/ml、10yg/ml、20yg/ml的對(duì)照品溶液；
[0102] 在活化步驟中，選取WatersOasis?HLBlcc固相萃取柱，先用1ml甲醇通過(guò)，再 用lml水通過(guò)。
[0103] 在蛋白質(zhì)含量檢測(cè)步驟中，檢測(cè)到待測(cè)品原液E中的蛋白質(zhì)含量為20iig/ml;待 測(cè)品原液F中的蛋白質(zhì)含量為250yg/ml;
[0104] 以原液E為稀釋液，配制成TritonX-100含量為10yg/ml的待測(cè)品PC-原液E;
[0105] 以原液F為稀釋液，配制成TritonX-100含量為10yg/ml的待測(cè)品PC-原液F。
[0106] 在上樣步驟中，取上述待測(cè)品各1ml，通過(guò)預(yù)先活化好的固相萃取柱。
[0107] 在洗雜步驟中，對(duì)原液E和PC-原液E用lml水清洗各1次后，或者對(duì)原液F和 PC-原液F用lml水清洗各2次后，用體積濃度為5 %的甲醇溶液lml對(duì)上述待測(cè)品各清洗 1次。
[0108] 在洗脫步驟中，用甲醇溶液lml洗脫，收集洗脫液，洗脫液即為待測(cè)品溶液。
[0109] 其中，固相萃取中的各步操作，需控制液體流速，流速應(yīng)不快于lml/分鐘。
[0110] 在TritonX-100測(cè)定步驟中，分別對(duì)所述對(duì)照品溶液配制步驟獲得的對(duì)照品溶液 和待測(cè)品溶液配制步驟獲得的待測(cè)品溶液進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定后，通過(guò)對(duì)照品溶液的 峰面積與對(duì)照品溶液中TritonX-100的濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將待測(cè)品 溶液的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出待測(cè)品中的TritonX-100殘留量分別為：原液E 和原液F為〈1iig/ml，PC-原液E為9. 56iig/ml，PC-原液F為9. 73iig/ml。其中，色譜柱 為WatersSymmetryShield?RP18,5iim3.9X150mm反相色譜柱，甲醇水溶液流動(dòng)相比為 85:15,流速為0.6ml/分鐘，采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器（PDA)監(jiān)測(cè)，TritonX-100的分析波長(zhǎng) 為 220nm。
[0111] 通過(guò)上述各實(shí)例所測(cè)定的TritonX-100殘留量數(shù)據(jù)可知，本實(shí)施例達(dá)到了回收率 高、檢測(cè)限低，能實(shí)現(xiàn)原液中TritonX-100殘留量的準(zhǔn)確測(cè)定的效果。
[0112] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中Triton X-IOO殘留量的測(cè)定方法，包括有對(duì) 照品溶液配制步驟、待測(cè)品溶液配制步驟和Triton X-100測(cè)定步驟，在所述待測(cè)品溶液配 制步驟中，依次通過(guò)固相萃取柱活化、上樣、洗雜和洗脫步驟，對(duì)待測(cè)品進(jìn)行固相萃取處理， 其特征在于，在所述上樣步驟之前還包括： 蛋白質(zhì)含量檢測(cè)步驟，從待檢測(cè)的HBsAg原液中，以按體積計(jì)每份為單位，取若干組待 測(cè)品后，對(duì)每組待測(cè)品中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)，甄別出蛋白質(zhì)含量大于一個(gè)閾值的待測(cè) 品和蛋白質(zhì)含量小于所述閾值的待測(cè)品，其中所述閾值的取值范圍為70μg/ml-125μg/ ml； 而所述洗雜步驟包括： 一次洗雜步驟，分別用1份水通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行第一次洗雜； 二次洗雜步驟，對(duì)所述蛋白質(zhì)含量大于所述閾值的待測(cè)品，在所述一次洗雜步驟后，分 別再用1份水通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行再次洗雜； 三次洗雜步驟，在所述第一洗雜步驟/第二洗雜步驟后，分別用1份體積濃度為2%? 70 %的甲醇溶液通過(guò)固相萃取柱，對(duì)每組待測(cè)品進(jìn)行第三次洗雜。
2.如權(quán)利要求1所述的重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中Triton X-100殘留量的測(cè) 定方法，其特征在于，所述閾值的取值為100 μ g/ml。
3.如權(quán)利要求1或2所述的重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中Triton X-100殘留量 的測(cè)定方法，其特征在于，所述洗脫步驟包括： 用90%?100%甲醇1份通過(guò)固相萃取柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，即得到待測(cè)品溶液。
4.如權(quán)利要求3所述的重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中Triton X-100殘留量的測(cè) 定方法，其特征在于，所述Triton X-100測(cè)定步驟包括： 液相色譜測(cè)定步驟，分別對(duì)每組所述對(duì)照品溶液和待測(cè)品溶液進(jìn)行高效液相色譜測(cè) 定； 方程建立和求解步驟，通過(guò)對(duì)照品溶液的峰面積與對(duì)照品溶液中TritonX-100的濃度 進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將待測(cè)品溶液的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出待測(cè) 品中TritonX-100的殘留量。
5. 如權(quán)利要求4所述的重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中TritonX-100殘 留量的測(cè)定方法，其特征在于，在所述液相色譜測(cè)定步驟中，采用的色譜柱為Waters SymmetryShield?RP18,5ym3. 9X150mm反相色譜柱，以甲醇水溶液為流動(dòng)相，采用二級(jí) 管陣列檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，TritonX-100的分析波長(zhǎng)范圍在220nm?240nm。
6. 如權(quán)利要求5所述的重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中TritonX-100殘留量的測(cè) 定方法，其特征在于，所述的甲醇水溶液流動(dòng)相中，甲醇與水的配比為70:30?85:15。
7.如權(quán)利要求6所述的重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中Triton X-100殘留量的 測(cè)定方法，其特征在于，甲醇水溶液流動(dòng)相比為80:20時(shí)，流動(dòng)相的流速范圍在0.6ml? I. Oml/分鐘之間。
8.如權(quán)利要求1所述的重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中Triton X-100殘留量的測(cè) 定方法，其特征在于，所述對(duì)照品溶液配制步驟包括： 以90 %的甲醇溶液配制TritonX-100對(duì)照品溶液，制成若干組1?20μg/ml的TritonX-100的對(duì)照品溶液。
9. 如權(quán)利要求1所述的重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中TritonX-IOO殘留量的測(cè) 定方法，其特征在于，所述活化步驟包括： 選取固相萃取柱，并在該固相萃取柱中依次通過(guò)1份甲醇和1份水，對(duì)其進(jìn)行預(yù)先活 化； 所述上樣步驟包括： 分別將每組待測(cè)品上樣至活化后的固相萃取柱中； 且在所述待測(cè)品溶液配制步驟中，液體通過(guò)固相萃取柱的流速不快于Iml/分鐘。
10. 如權(quán)利要求9所述的重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg原液中TritonX-100殘留量的測(cè) 定方法，其特征在于，在所述活化步驟中，選取的固相萃取柱為WatersOasis'?HLBIcc固 相萃取柱。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104458969SQ201410854555
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】饒洪沖, 朱征宇, 段琰, 黃龍 申請(qǐng)人:深圳康泰生物制品股份有限公司