一種金黃色葡萄球菌腸毒素d的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本實(shí)用新型涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，屬于免疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。該試紙條由樣品墊、涂覆金標(biāo)標(biāo)記抗SED抗體5F2（CGMCCNo.7212）的金標(biāo)墊，在檢測(cè)線、質(zhì)控線分別包被有抗SED抗體10F1（CGMCCNo.7213）和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜構(gòu)成，依次按樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊粘附在PVC底板上。該試紙條操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，檢測(cè)全過(guò)程只需5分鐘，不受環(huán)境條件的干擾，特異性好，檢測(cè)靈敏度高，最低檢測(cè)限為0.25ng/mL。本實(shí)用新型適用于海關(guān)、企業(yè)、醫(yī)院、檢驗(yàn)檢疫單位等，可實(shí)現(xiàn)食品或臨床樣本中金黃色葡萄球菌腸毒素D的快速檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙
條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，可以實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌腸毒素D的快速檢測(cè)診斷，適用于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、食物中毒的快速檢測(cè)與應(yīng)急處理，屬于免疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種常見(jiàn)的食源性致病菌,雖然近年來(lái)不斷有新型的金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxin, SE)被發(fā)現(xiàn),但腸毒素SEA、SEB、SEC、SED, SEE引起的中毒占金黃色葡萄球菌食物中毒的95%，葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒以A型居多，D型次之。從生牛乳、生肉及乳酪中分離的金黃色葡萄球菌以產(chǎn)生D型腸毒素為主。
[0003]在食品加工過(guò)程中，經(jīng)過(guò)熱處理可以殺滅金黃色葡萄球菌，然而一旦菌體產(chǎn)生外分泌的腸毒素，那么存在于食物中的腸毒素非常穩(wěn)定，100°c 30min不被破壞，攝入人體后可以抵抗腸胃液中蛋白酶的分解，并引起人體的嘔吐、腹瀉等癥狀。2011年我國(guó)公布速凍面米制品新國(guó)標(biāo)GB19295—2011，金黃色葡萄球菌由原來(lái)的不得檢出變?yōu)橄蘖繖z出，因此為了杜絕食品中金黃色葡萄球菌活菌數(shù)合格而腸毒素超標(biāo)的情況，腸毒素的快速檢測(cè)對(duì)于保障食品安全具有更加重要的意義。
[0004]近年來(lái)，ELISA憑借其靈敏、快速、特異性好、易于推廣的特點(diǎn)越來(lái)越多地用于腸毒素的檢測(cè)，但膠體金試紙條具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高、不需要借助專(zhuān)門(mén)儀器、適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，因此對(duì)于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、食物中毒的快速檢測(cè)具有重要的意義。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0005]本實(shí)用新型目的在于提供一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，操作簡(jiǎn)單，快速方便，靈敏度高，穩(wěn)定性好，成本低廉。
[0006]本實(shí)用新型適用于海關(guān)、企業(yè)、醫(yī)院、檢驗(yàn)檢疫單位等，可實(shí)現(xiàn)食品或臨床樣本中金黃色葡萄球菌腸毒素D的快速檢測(cè)。
[0007]本實(shí)用新型的技術(shù)方案，一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，包括PVC底板，在PVC底板兩端分別設(shè)有樣品墊和吸水墊；
[0008]PVC底板中部設(shè)置有硝酸纖維素膜檢測(cè)層，在硝酸纖維素膜檢測(cè)層與樣品墊之間設(shè)置有金標(biāo)墊；所述金標(biāo)墊一端與樣品墊相連接疊放，另一端疊放于硝酸纖維素膜檢測(cè)層上；
[0009]所述硝酸纖維素膜檢測(cè)層上依次設(shè)置有檢測(cè)線和質(zhì)控線。
[0010]所述金標(biāo)墊包被有金標(biāo)標(biāo)記的抗SED抗體5F2 (CGMCC N0.7212)。
[0011]所述檢測(cè)線上包被有抗SED抗體10F1 (CGMCC N0.7213)。
[0012]所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgG。[0013]所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備方法，金黃色葡萄球菌腸毒素D縮寫(xiě)為SED，步驟如下:
[0014](I)抗SED特異性單克隆抗體的制備:
[0015]以北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供的重組表達(dá)的SED為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)免疫、細(xì)胞融合、篩選，共篩選到10個(gè)單克隆抗體細(xì)胞株；
[0016]免疫程序如下:第一周進(jìn)行首免，IOyg/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第四周進(jìn)行二免，8yg/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第六周進(jìn)行三免，6yg/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第七周尾部采血測(cè)效價(jià)，選擇效價(jià)最高的小鼠；第八周進(jìn)行沖刺免疫，4 μ g/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后眼眶采血后進(jìn)行融合。篩選采用間接ELISA進(jìn)行，共篩選到10個(gè)細(xì)胞株。
[0017](2)特異性SED雙抗體檢測(cè)抗體的篩選:
[0018]將步驟(1)純化后的10株單克隆抗體細(xì)胞株分別標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行雙抗體夾心法配對(duì)，確定特異性免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條所需抗SED抗體；其中5F2為金標(biāo)抗體，IOFl為包被抗體；
[0019](3)金黃色葡萄球菌腸毒素D免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備:
[0020]a、空白膠體金的制備:
[0021]采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200mL去離子水和2mL質(zhì)量濃度為1%的氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4mL質(zhì)量濃度為1%的檸檬酸鈉，繼續(xù)加熱15~20分鐘，至呈亮紅色，然后室溫中冷卻，4°C冷藏保存；
[0022]b、膠體金標(biāo)記抗體的制備:
[0023]空白膠體金溶液用0.1M的K2CO3調(diào)節(jié)pH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度步驟(2)制備的抗體，每毫升空白膠體金溶液加入30 μ g抗體5F2(CGMCC N0.7212)，繼續(xù)攪拌30分鐘，離心，吸取上清液，用金標(biāo)抗體保存液重旋；
[0024]C、金標(biāo)墊的制備:
[0025]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器，將標(biāo)記好膠體金的抗SED抗體5F2 (CGMCCN0.7212)均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6μL7(:πι，37τ:烘干過(guò)夜，封袋備用；
[0026]d、包被膜的制備:
[0027]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器，將稀釋好的抗SED抗體IOFl (CGMCC N0.7213)均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測(cè)線；將稀釋好的羊抗鼠IgG均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，噴液量為0.6μ L /cm, 37 °C烘干過(guò)夜，封袋備用；
[0028]將PVC底板、硝酸纖維素膜檢測(cè)層、樣品墊、金標(biāo)墊、檢測(cè)線、質(zhì)控線和吸水墊組合，即得產(chǎn)品金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條。
[0029]其適用于海關(guān)、企業(yè)、醫(yī)院、檢驗(yàn)檢疫單位，可實(shí)現(xiàn)食品或臨床樣本中金黃色葡萄球菌腸毒素D的快速檢測(cè),最低檢測(cè)限為0.25ng/mL。
[0030]本實(shí)用新型試紙條的工作原理:采用膠體金免疫層析技術(shù)，選用SED特異性抗體作為固相物，利用雙抗體夾心法原理檢測(cè)樣品中是否含有SED。當(dāng)待檢樣品中含有SED時(shí)，抗原先和膠體金標(biāo)記的抗SED抗體(5F2)結(jié)合，由于層析作用復(fù)合物沿包被膜向前移動(dòng)，當(dāng)遇到檢測(cè)線上的抗SED抗體(10F1)時(shí)，形成抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物,在檢測(cè)線上富集，形成紅色沉淀線。[0031]本實(shí)用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0032]1、檢測(cè)速度快，全過(guò)程只需要5分鐘即可，可以試驗(yàn)大批量樣品的快速檢測(cè)；
[0033]2、靈敏度高，最低檢測(cè)限為0.25ng/mL ；
[0034]3、操作簡(jiǎn)便，無(wú)需經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，易于推廣；
[0035]4、不需要儀器，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；
[0036]5、過(guò)程簡(jiǎn)單，直接上樣檢測(cè)，樣本量少。
[0037]生物材料樣品保藏:
[0038]1、一株單克隆細(xì)胞株，細(xì)胞株12號(hào)，株號(hào)為5F2，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，登記編號(hào)為CGMCC N0.7212，保藏曰期為2013年I月23日。
[0039]2、一株單克隆細(xì)胞株，細(xì)胞株13號(hào)，株號(hào)為10F1，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，登記編號(hào)為CGMCC N0.7213，保藏曰期為2013年I月23日。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1是本實(shí)用新型試紙條結(jié)構(gòu)主視圖。
[0041]圖2是本實(shí)用新型試紙條結(jié)構(gòu)俯視圖。
[0042]附圖標(biāo)記說(shuō)明:1、PVC底板；2、硝酸纖維素膜檢測(cè)層；3、樣品墊；4、金標(biāo)墊；5、檢測(cè)線(T線)；6、質(zhì)控線(C線)；7、吸水墊。
【具體實(shí)施方式】
[0043]實(shí)施例1
[0044]如圖1-2所示，一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，包括PVC底板1，在PVC底板I兩端分別設(shè)有樣品墊3和吸水墊7 ；
[0045]PVC底板I中部設(shè)置有硝酸纖維素膜檢測(cè)層2，在硝酸纖維素膜檢測(cè)層2與樣品墊3之間設(shè)置有金標(biāo)墊4 ;所述金標(biāo)墊4 一端與樣品墊3相連接疊放,另一端疊放于硝酸纖維素膜檢測(cè)層2上；
[0046]所述硝酸纖維素膜檢測(cè)層2上依次設(shè)置有檢測(cè)線(T線)5和質(zhì)控線(C線)6。
[0047]所述金標(biāo)墊4包被有金標(biāo)標(biāo)記的抗SED抗體5F2。所述檢測(cè)線(T線)5上包被有抗SED抗體IOFl。所述質(zhì)控線(C線)6上包被有羊抗鼠IgG。
[0048]實(shí)施例2
[0049]所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備方法，金黃色葡萄球菌腸毒素D縮寫(xiě)為SED，其步驟是:
[0050](I)抗SED特異性單克隆抗體的制備:
[0051]以重組表達(dá)的SED (北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進(jìn)行首免，IOyg /只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第四周進(jìn)行二免，8yg /只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第六周進(jìn)行三免，6yg /只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第七周尾部采血測(cè)效價(jià)，選擇效價(jià)最高的小鼠；第八周進(jìn)行沖刺免疫，4yg /只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后眼眶采血后進(jìn)行融合。篩選采用間接ELISA進(jìn)行，共篩選到10個(gè)細(xì)胞株。
[0052](2 )特異性SED雙抗體檢測(cè)抗體的篩選
[0053]將純化后的10株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行雙抗體夾心法配對(duì)，確定特異性免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條所需要抗SED抗體。其中5F2為金標(biāo)抗體，IOFl為包被抗體。
[0054](3)金黃色葡萄球菌腸毒素D免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備:
[0055]a、空白膠體金的制備:
[0056]采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200mL去離子水和2mL 1%氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4mL 1%檸檬酸鈉，繼續(xù)加熱15~20分鐘，至呈亮紅色，然后室溫中冷卻，4 C冷減保存；
[0057]b、膠體金標(biāo)記抗體的制備:
[0058]空白膠體金溶液用0.1M K2CO3調(diào)節(jié)PH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度抗體，每毫升膠體金加入30 μ g抗體5F2，繼續(xù)攪拌30分鐘，離心，吸取上清，用金標(biāo)抗體保存液重旋；
[0059]C、金標(biāo)墊的制備:
[0060]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器(HM3055)，將標(biāo)記好膠體金的抗SED抗體5F2均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6 μ L /cm, 37 °C烘干過(guò)夜，封袋備用；
[0061]d、包被膜的制備:
[0062]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器(HM3055)，將稀釋好的抗SED抗體IOFl均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測(cè)線；將稀釋好的羊抗鼠IgG均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，噴液量為0.6μL7(:πι，37τ:烘干過(guò)夜，封袋備用。
[0063]將PVC底板1、硝酸纖維素膜檢測(cè)層2、樣品墊3、金標(biāo)墊4、檢測(cè)線5、質(zhì)控線6和吸水墊7組合，即得產(chǎn)品金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條。
[0064]本實(shí)用新型試紙條的工作原理:采用膠體金免疫層析技術(shù)，選用SED特異性抗體作為固相物，利用雙抗體夾心法原理檢測(cè)樣品中是否含有SED。當(dāng)待檢樣品中含有SED時(shí)，抗原先和膠體金標(biāo)記的抗SED抗體(5F2)結(jié)合，由于層析作用復(fù)合物沿包被膜向前移動(dòng)，當(dāng)遇到檢測(cè)線上的抗SED抗體(I OFl)時(shí)，形成抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物,在檢測(cè)線上富集，形成紅色沉淀線。
[0065]檢測(cè)時(shí)如樣品為陰性，則試紙條只有質(zhì)控線C線顯色；如果樣品為陽(yáng)性，腸毒素含量值大于0.25ng/mL，則試紙條質(zhì)控線C線、檢測(cè)線T線均顯色。如果試紙條C線不顯色，則說(shuō)明試紙條質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題。
【權(quán)利要求】
1.一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，其特征在于:包括PVC底板(I)，在PVC底板(I)兩端分別設(shè)有樣品墊(3 )和吸水墊(7 ); PVC底板(I)中部設(shè)置有硝酸纖維素膜檢測(cè)層(2)，在硝酸纖維素膜檢測(cè)層(2)與樣品墊(3)之間設(shè)置有金標(biāo)墊(4);所述金標(biāo)墊(4) 一端與樣品墊(3)相連接疊放，另一端疊放于硝酸纖維素膜檢測(cè)層(2)上； 所述硝酸纖維素膜檢測(cè)層(2)上依次設(shè)置有檢測(cè)線(5)和質(zhì)控線(6)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述金標(biāo)墊(4)包被有金標(biāo)標(biāo)記的抗SED抗體5F2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述檢測(cè)線(5)上包被有抗SED抗體IOFl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述質(zhì)控線(6)上包被有羊抗鼠IgG。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK203732543SQ201420066330
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月14日
【發(fā)明者】徐麗廣, 胥傳來(lái), 孔德昭, 匡華, 馬偉, 宋珊珊, 劉麗強(qiáng) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)