用于檢測(cè)pnh克隆的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開(kāi)了一種用于檢測(cè)PNH克隆的試劑盒，其包括盒體(1)、盒蓋(3)和設(shè)置在盒體(1)內(nèi)的襯墊(2)，所述襯墊(2)上設(shè)有小孔，裝有GlyA?FITC抗體的試劑管(4)、裝有CD59?PE抗體的試劑管(5)、裝有FLAER抗體的試劑管(6)、裝有CD24?PE抗體的試劑管(7)，裝有CD33?APC抗體的試劑管(8)裝有CD14?APC-CY7抗體的試劑管(9)，裝有CD45?PerCP抗體的試劑管(10)，裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管(11)，裝有PBS緩沖液的試劑管(12)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。本實(shí)用新型結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理，檢測(cè)步驟簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，靈敏度高，便于在臨床推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)PNH克隆的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于檢測(cè)PNH克隆的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種特殊的獲得性克隆性造血干細(xì)胞疾病，該疾病是由于PIGA基因體細(xì)胞突變，導(dǎo)致連接細(xì)胞膜的GPI相關(guān)錨蛋白缺失所致。最初PNH的檢測(cè)主要集中檢測(cè)紅細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn):如Ham實(shí)驗(yàn)和蔗糖溶血實(shí)驗(yàn)。這兩種檢測(cè)手段都提示紅細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血敏感度增加。但二者都不是特異性檢測(cè)，且操作不方便。流式細(xì)胞術(shù)是檢測(cè)GPI相關(guān)錨蛋白缺失的方法之一，同時(shí)也是診斷PNH所必需的檢測(cè)指標(biāo)。目前常用的檢測(cè)方法為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紅細(xì)胞及白細(xì)胞表面CD55和CD59的缺失情況。雖然CD55和CD59被廣泛用于檢測(cè)血細(xì)胞中的PNH克隆細(xì)胞，有數(shù)據(jù)表明，二者聯(lián)合應(yīng)用也可能無(wú)法檢測(cè)出微量PNH克隆細(xì)胞。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0003]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本實(shí)用新型的目的在于提供一種用于檢測(cè)PNH克隆的試劑盒，可以快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高靈敏性檢測(cè)。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采取的技術(shù)方案是:一種用于檢測(cè)PNH克隆的的試劑盒，其包括盒體(I)、盒蓋(3)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(2)，所述襯墊(2)上設(shè)有小孔，裝有GlyA FITC抗體的試劑管(4)、裝有CD59 PE抗體的試劑管(5)、裝有FLAER抗體的試劑管￠)、裝有CD24 PE抗體的試劑管(7)，裝有CD33 APC抗體的試劑管(8)裝有CD14APC-CY7抗體的試劑管(9)，裝有CD45 PerCP抗體的試劑管(10)，裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管(11)，裝有PBS緩沖液的試劑管(12)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。
[0005]其中，所述襯墊(2)上設(shè)有9個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊(2)上分成3排平行排列。
[0006]通過(guò)以上技術(shù)方案，本實(shí)用新型的有益效果如下:
[0007](I)本實(shí)用新型的試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理，方便攜帶、保存，不易受污染。
[0008](2)本實(shí)用新型的試劑盒在檢測(cè)PNH克隆時(shí)檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果分析方法簡(jiǎn)單、直觀，便于在臨床推廣應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0010]圖中，1-盒體，3-盒蓋，2-襯墊，4-裝有GlyA FITC抗體的試劑管，5_裝有CD59 PE抗體的試劑管，6-裝有FLAER抗體的試劑管，7-裝有CD24 PE抗體的試劑管，8-裝有CD33APC抗體的試劑管，9-裝有CD14 APC-CY7抗體的試劑管，10-裝有CD45 PerCP抗體的試劑管，11-裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管，12-裝有PBS緩沖液的試劑管。
[0011]圖2為采用本實(shí)用新型的試劑盒的人體內(nèi)正常紅細(xì)胞的示意圖；
[0012]圖3為采用本實(shí)用新型的試劑盒的人體內(nèi)正常白細(xì)胞的示意圖；
[0013]圖4為采用本實(shí)用新型的試劑盒的PNH克隆患者的紅細(xì)胞的示意圖；
[0014]圖5為采用本實(shí)用新型的試劑盒的PNH克隆患者的白細(xì)胞的示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步描述，本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本實(shí)用新型的范圍構(gòu)成任何限制。
[0016]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0017]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]如圖1所示，本實(shí)用新型提供了一種用于檢測(cè)PNH克隆的試劑盒，包括盒體1、盒蓋3和設(shè)置在盒體I內(nèi)的襯墊2，所述襯墊2上設(shè)有9個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊2上分成三排平行排列，裝有GlyA FITC抗體的試劑管4、裝有⑶59 PE抗體的試劑管5、裝有FLAER抗體的試劑管6、裝有⑶24PE抗體的試劑管7，裝有⑶33 APC抗體的試劑管8，裝有⑶14APC-CY7抗體的試劑管9，裝有CD45 PerCP抗體的試劑管10，裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管11，裝有PBS緩沖液的試劑管12被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。
[0019]本發(fā)明采用流式細(xì)胞術(shù)高靈敏性地檢測(cè)PNH克隆，從而更好地輔助臨床診斷。數(shù)據(jù)表明，檢測(cè)白細(xì)胞GPI相關(guān)錨蛋白缺失的最好的試劑為含有熒光標(biāo)記的無(wú)活性嗜水氣單胞菌溶素前體的變異體，即FLAER，可特異結(jié)合于GPI錨連蛋白。與其余試劑相比，F(xiàn)LAER的靈敏度更高，它還可以與其它單克隆試劑聯(lián)合使用，提高特異性，從而使結(jié)論更加準(zhǔn)確。對(duì)于紅細(xì)胞檢測(cè)靈敏性的提高，我們?cè)谥巴ㄟ^(guò)細(xì)胞大小和顆粒性設(shè)門(mén)的基礎(chǔ)上，再用GlyA進(jìn)一步標(biāo)記紅細(xì)胞，利用敏感性相對(duì)較高的CD59確定有無(wú)紅細(xì)胞PNH克隆。
[0020]檢測(cè)步驟如下:
[0021](I)取四支流式專用管，分別標(biāo)注為R-C、R-T、W-C、W-T，并注明標(biāo)本編號(hào)(R_C、W_C均為對(duì)照管)；
[0022](2)各管內(nèi)抗體組合如下:
[0023]表I抗體組合
[0024]

管號(hào) |PerCP Ifitc [pe [apc~Iapc-cy7
FeGlyA
FtGlyA CD59

~CD45
W2~CD45CD24 CD33 CD14
[0025](3)取標(biāo)本10 μ 1，用PBS稀釋至100 μ 1，向R_C、R_T管內(nèi)分別加入標(biāo)本30 μ 1，室溫避光孵育20分鐘，孵育完成后向2管中分別加入PBS 1000 μ 1，以1500rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘后，棄去上清，重復(fù)2次,然后在2管中分別加入0.2ml PBS重懸后上機(jī)。
[0026](4)對(duì)樣本進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，控制細(xì)胞濃度在4-6 X 106/ml，向W_C、ff-Τ管內(nèi)加入標(biāo)本70 μ I，低速渦旋混勻，室溫避光孵育20分鐘；
[0027](5)向W-C、W-T管中加入紅細(xì)胞裂解液1000 μ 1，低速渦旋混勻，室溫避光裂解紅細(xì)胞10分鐘；
[0028](6)裂解結(jié)束后，以1500rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘；
[0029](7)兩管內(nèi)加入1000 μ IPBS洗滌，以1500rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘。
[0030](8)在W-T管中加入FLAER抗體2 μ 1，室溫避光孵育15分鐘。
[0031](9)孵育完成后加入1000 μ IPBS洗滌，以1500rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘。兩管中分別加入0.2ml PBS重懸，低速渦旋混勻，24h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。
[0032](10)上機(jī)檢測(cè)。
[0033](11)分析R-T管內(nèi)有無(wú)⑶59陰性或弱陽(yáng)性紅細(xì)胞，ff-Τ管內(nèi)有無(wú)FLAER-⑶24雙陰粒細(xì)胞及FLAER-⑶14雙陰單核細(xì)胞。
[0034]圖2為正常人體紅細(xì)胞的示意圖，左圖為空白對(duì)照，右圖P3門(mén)內(nèi)為III型細(xì)胞，P4門(mén)內(nèi)為II型細(xì)胞，P5門(mén)內(nèi)為I型細(xì)胞。
[0035]圖3為正常人體白細(xì)胞的示意圖，左圖根據(jù)CD33的熒光輕度分別圈出粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，P5門(mén)內(nèi)為粒細(xì)胞，P3門(mén)內(nèi)為單核細(xì)胞，Q2-1門(mén)內(nèi)為正常粒細(xì)胞，⑶24和FLAER均陽(yáng)性，Q2門(mén)內(nèi)為正常單核細(xì)胞，⑶14和FLAER均為陽(yáng)性。
[0036]圖4為PNH患者紅細(xì)胞的示意圖，左圖為空白對(duì)照，右圖P3門(mén)內(nèi)為III型細(xì)胞，P4門(mén)內(nèi)為II型細(xì)胞，P5門(mén)內(nèi)為I型細(xì)胞。
[0037]圖5為PNH患者白細(xì)胞的示意圖，左圖根據(jù)CD33的熒光輕度分別圈出粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，P5門(mén)內(nèi)為粒細(xì)胞，P3門(mén)內(nèi)為單核細(xì)胞，Q2-1門(mén)內(nèi)為正常粒細(xì)胞，⑶24和FLAER均陽(yáng)性，Q3-1門(mén)內(nèi)為粒細(xì)胞PNH克隆，CD24和FLAER均陰性，Q2門(mén)內(nèi)為正常單核細(xì)胞，CD14和FLAER均為陽(yáng)性，Q3門(mén)內(nèi)為單核細(xì)胞PNH克隆，⑶14和FLAER均為陰性。
[0038]結(jié)果判斷依據(jù):
[0039]R-T管中⑶59弱陽(yáng)性細(xì)胞為II型細(xì)胞，⑶59陰性細(xì)胞為III型細(xì)胞，II型細(xì)胞和III型細(xì)胞之和為紅細(xì)胞PNH克隆。W-T管中FLAER和⑶24雙陰性細(xì)胞為粒細(xì)胞PNH克隆，F(xiàn)LAER和CD14雙陰性細(xì)胞為單核細(xì)胞PNH克隆。
[0040]上面已經(jīng)舉例說(shuō)明了本實(shí)用新型的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本實(shí)用新型的精神和范圍下可以對(duì)本實(shí)用新型技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本實(shí)用新型的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)PNH克隆的試劑盒，其特征在于包括盒體(I)、盒蓋(3)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(2)，所述襯墊(2)上設(shè)有小孔，裝有GlyA FITC抗體的試劑管(4)、裝有CD59PE抗體的試劑管(5)、裝有FLAER抗體的試劑管(6)、裝有CD24 PE抗體的試劑管(7)、裝有CD33 APC抗體的試劑管(8)裝有CD14 APC-CY7抗體的試劑管(9)、裝有CD45 PerCP抗體的試劑管(10)、裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管(11)、裝有PBS緩沖液的試劑管(12)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。
2.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述襯墊(2)上設(shè)有9個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊(2)上分成3排平行排列。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK204008664SQ201420429778
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】劉麗媛, 吳純斌, 秦曉明, 王顯鳳, 王緒華, 梁超, 陳忠, 方國(guó)偉, 黃士昂 申請(qǐng)人:北京海思特臨床檢驗(yàn)所有限公司