心肌肌鈣蛋白i-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶聯(lián)檢試紙條的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型提供了一種定量檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶聯(lián)檢試紙條，所述試紙條包括底板和在底板上依次搭接粘貼的樣品墊、第一結(jié)合墊、第二結(jié)合墊、第三結(jié)合墊、包被膜及吸水紙，所述第一結(jié)合墊上同時(shí)包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的心肌肌鈣蛋白I第一抗體和生物素標(biāo)記的識(shí)別不同表位的心肌肌鈣蛋白第二抗體，所述第二結(jié)合墊包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的肌紅蛋白第一抗體，所述第三結(jié)合墊包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的肌酸激酶同工酶第一抗體。本實(shí)用新型的試紙條能夠?qū)崿F(xiàn)心肌肌鈣蛋白I-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶的三項(xiàng)聯(lián)檢，且具有靈敏度高，使用便捷等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】心肌肌鈣蛋白卜肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶聯(lián)檢試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及一種用于定量檢測(cè)心肌肌鈣蛋白1-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶的三項(xiàng)聯(lián)檢熒光層析試紙條。

【背景技術(shù)】
[0002]心肌肌媽蛋白I (Cardiac Troponin I，簡(jiǎn)稱cTnl)是心肌細(xì)胞死亡的特異及敏感的標(biāo)志物，其可在心肌損傷時(shí)進(jìn)入血液中，而未發(fā)現(xiàn)在健康的或者受損傷的骨骼肌或者其他組織中表達(dá)。cTnl可在胸痛發(fā)作后3到6小時(shí)內(nèi)在患者血液中被檢測(cè)到，并在16到30小時(shí)內(nèi)達(dá)到峰值，血液樣品中cTnl濃度的升高可持續(xù)到癥狀出現(xiàn)后的5到8天。目前，cTnl作為心肌細(xì)胞死亡的標(biāo)記物已經(jīng)在臨床診斷中廣泛應(yīng)用，如:對(duì)心肌損傷的診斷、AMI后溶栓治療的指示、對(duì)圍術(shù)期心肌梗死的診斷、對(duì)心肌炎的診斷以及與骨骼肌損傷的鑒別診斷等。
[0003]肌紅蛋白(Myoglobin，簡(jiǎn)稱Myo)是一個(gè)含有血紅素的由153個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)肌肉組織中氧氣的儲(chǔ)存。作為心肌損傷的標(biāo)記物，肌紅蛋白作為已經(jīng)被應(yīng)用了三十多年。肌紅蛋白在患者癥狀出現(xiàn)I到3小時(shí)后出現(xiàn)于其血液中，8到12小時(shí)之內(nèi)達(dá)到峰值。與心肌肌鈣蛋白I(cTnl)相比，肌紅蛋白缺乏心肌特異性。由于肌紅蛋白大量存在于骨骼肌組織中，即使輕度的骨骼肌損傷都能導(dǎo)致血液中肌紅蛋白濃度的顯著升高。因此，肌紅蛋白與cTnl —起被用于臨床實(shí)踐中以提高急性心肌梗死診斷的特異性。
[0004]肌酸激酶(Creatine Kinase，簡(jiǎn)稱CK)主要存在于骨骼肌、心肌和腦組織中，有三種形式的同工酶:CK-MM、CK-MB和CK-BB。CK及其同工酶CK-MB是臨床診斷急性心肌梗死常用的酶學(xué)指標(biāo)，并利用其增高的時(shí)間與梯度觀察患者的病情變化、治療效果及愈后。肌酸激酶同工酶CK-MB主要存在于人體心肌細(xì)胞內(nèi)，正常人血清中絕大部分為CK-MM的活性，只有少量的CK-MB，CK-MB占CK總活力少于5%。當(dāng)炎癥或梗死等原因引起心肌細(xì)胞受損或壞死，使得大量的CK-MB釋放到血液中，會(huì)使血清中的CK-MB增高。一般情況下，CK-MB在急性心肌梗死發(fā)病后4-8小時(shí)內(nèi)增高，24小時(shí)達(dá)到峰值，2-3天后恢復(fù)正常。CK-MB作為常用的心肌損傷標(biāo)志物在臨床檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0005]摶術(shù)問(wèn)題
[0006]鑒于心肌損傷后cTn1、Myo和CK-MB釋放動(dòng)力學(xué)的差異，cTn1、Myo和C-MB三項(xiàng)聯(lián)檢對(duì)于急性心肌梗死的判斷具有協(xié)同互補(bǔ)作用，比單獨(dú)cTnl檢測(cè)具有更有助于急性心肌梗死的早期判斷，從而提高心梗的診斷率并制定出相應(yīng)的治療方案。因此，亟待需要開發(fā)出一種定量檢測(cè)心肌肌鈣蛋白1-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶的三項(xiàng)聯(lián)檢熒光層析試紙條。_7] 技術(shù)方案
[0008]本實(shí)用新型提供了一種心肌肌鈣蛋白1-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶聯(lián)檢試紙條，其特征在于，所述試紙條包括:
[0009]I)用于接受來(lái)自全血、血漿或血清樣品的樣品墊；
[0010]2)同時(shí)包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的心肌肌鈣蛋白I第一抗體和生物素標(biāo)記的識(shí)別不同表位的心肌肌鈣蛋白第二抗體的第一結(jié)合墊；
[0011]3)包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的肌紅蛋白第一抗體的第二結(jié)合墊；
[0012]4)包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的肌酸激酶同工酶第一抗體的第三結(jié)合墊；
[0013]5)包被有相間隔的三條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線的包被膜，其中所述三條檢測(cè)線依次固定有親和素、識(shí)別不同表位的肌紅蛋白第二抗體及識(shí)別不同表位的肌酸激酶同工酶第二抗體，所述質(zhì)控線固定有抗鼠IgG的抗體；
[0014]6)用于提供檢測(cè)所需的毛細(xì)作用力的吸水紙；和
[0015]7)底板，其中所述底板上依次搭接粘貼的樣品墊、第一結(jié)合墊、第二結(jié)合墊、第三結(jié)合墊、包被膜及吸水紙。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述兩種不同粒徑焚光微球的粒徑范圍均在50nm至500nm之間。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一結(jié)合墊、第二結(jié)合墊、第三結(jié)合墊材質(zhì)為玻璃纖維素膜或者聚酯膜。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述包被膜為硝酸纖維素膜。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試紙條的寬度在0.2cm至0.5cm之間。
[0020]有益效果
[0021]本實(shí)用新型所提供的一種定量檢測(cè)心肌肌鈣蛋白1-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶的三項(xiàng)聯(lián)檢熒光層析試紙條兼顧了低值靈敏度和檢測(cè)的線性范圍，其對(duì)于急性心肌梗死的判斷具有協(xié)同互補(bǔ)作用，比單項(xiàng)檢測(cè)具有更有助于急性心肌梗死的早期判斷。另外，該試劑條制備方法簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)，有利于大規(guī)模推廣應(yīng)用，具備廣闊的市場(chǎng)前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1是本實(shí)用新型所述一種定量檢測(cè)心肌肌鈣蛋白1-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶的三項(xiàng)聯(lián)檢熒光層析試紙條的側(cè)視示意圖；
[0023]圖2是本實(shí)用新型所述一種定量檢測(cè)心肌肌鈣蛋白1-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶的三項(xiàng)聯(lián)檢熒光層析試紙條的俯視示意圖；
[0024]附圖標(biāo)記表示為:1-樣品墊、2-第一結(jié)合墊、3第二結(jié)合墊、4-第三結(jié)合墊、5-包被膜、6-吸水紙、7-底板、8-檢測(cè)線(cTnI)、9-檢測(cè)線(Myo)UO-檢測(cè)線(CK-MB)和11-質(zhì)控線。

【具體實(shí)施方式】
[0025]為了促進(jìn)對(duì)于本實(shí)用新型的心肌肌鈣蛋白1-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶三項(xiàng)聯(lián)檢的原理理解，以下將參照在附圖中說(shuō)明并描述于以下的說(shuō)明書中的實(shí)施方案。應(yīng)理解由此不意圖限制本實(shí)用新型的范圍。
[0026]圖1為一種定量檢測(cè)心肌肌鈣蛋白1-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶的三項(xiàng)聯(lián)檢熒光層析試紙條的側(cè)視示意圖。
[0027]如圖1所示，本實(shí)用新型的三項(xiàng)聯(lián)檢熒光層析試紙條包括底板6和在底板7上順序搭接粘結(jié)的樣品墊1、第一結(jié)合墊2、第二結(jié)合墊3、第三結(jié)合墊4、包被膜5和吸水層6。
[0028]樣品墊I用于接受來(lái)自全血、血漿或血清樣品，其可由選自玻璃纖維素膜或者聚酯膜、棉纖的材料制成。樣品墊I可以起到過(guò)濾樣品中的顆粒性不溶物。因此，與市售的部分試紙條相比，采用單獨(dú)樣品墊I的設(shè)計(jì)有助于提高檢測(cè)靈敏度。
[0029]第一結(jié)合墊2、第二結(jié)合墊3和第三結(jié)合墊4由玻璃纖維素膜或者聚酯膜制成。第一結(jié)合墊2上同時(shí)包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的心肌肌鈣蛋白I第一抗體和生物素標(biāo)記的識(shí)別不同表位的心肌肌鈣蛋白第二抗體。第二結(jié)合墊2上包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的肌紅蛋白第一抗體。第三結(jié)合墊3上包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的肌酸激酶同工酶第一抗體。將針對(duì)不同目標(biāo)蛋白的抗體分別包被于不同的結(jié)合墊上，可以有效降低了抗體之間的相互影響，由此提高了檢測(cè)的靈敏度。
[0030]在本實(shí)用新型的試紙條中，對(duì)心肌肌鈣蛋白的檢測(cè)采用雙抗體夾心結(jié)合生物素-親和素級(jí)聯(lián)放大的方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)肌紅蛋白和肌酸激酶同工酶的檢測(cè)采用雙抗體夾心的方法進(jìn)行檢測(cè)。在雙抗體夾心法中，同時(shí)使用分別識(shí)別目標(biāo)蛋白不同表位的兩種抗體來(lái)特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白，由此提高了檢測(cè)的靈敏性。
[0031]進(jìn)一步，小粒徑熒光微球標(biāo)記的抗體使得檢測(cè)的線性范圍可覆蓋高值區(qū)域，大粒徑熒光微球標(biāo)記的抗體有利于低值的檢測(cè)以達(dá)到靈敏度的要求。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述兩種不同粒徑焚光微球的粒徑范圍均在50nm至500nm之間，優(yōu)選10nm至400nm之間，更優(yōu)選10nm至300nm之間，最優(yōu)選分別為10nm和300nm。因此，本實(shí)用新型的試劑條可同時(shí)滿足心肌肌鈣蛋白1、肌紅蛋白和肌酸激酶同工酶測(cè)定對(duì)高靈敏度和寬檢測(cè)線性范圍的要求。
[0032]包被膜5包被有相間隔的三條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線。三條檢測(cè)線8、9和10(參見(jiàn)圖2)依次固定有親和素、識(shí)別不同表位的肌紅蛋白第二抗體及識(shí)別不同表位的肌酸激酶同工酶第二抗體。質(zhì)控線11固定有抗鼠IgG的抗體。
[0033]檢測(cè)線8、9和10之間的距離可以在0.1cm至0.6cm之間。在一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)線8、9和10之間的距離在0.2cm至0.5cm之間，優(yōu)選在0.2cm至0.4cm之間。檢測(cè)線10和質(zhì)控線11之間的距離可以在0.05cm至0.8cm之間。在一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)線10和質(zhì)控線11之間的距離在0.1cm至0.6cm之間，優(yōu)選在0.3cm至0.5cm之間。質(zhì)控線11用于確定反應(yīng)體系是否成立，并通過(guò)計(jì)算檢測(cè)線8、9和10與質(zhì)控線11的熒光信號(hào)值以精確進(jìn)行定量。
[0034]吸水層6用于提供檢測(cè)所需的毛細(xì)作用力，其可由選自由棉絨、玻纖的材料制成，優(yōu)選由棉絨制成。
[0035]需要說(shuō)明，圖1的各個(gè)層之間的搭接方式，例如一層逐漸高于一層或高低變化的搭接方式僅是示例性說(shuō)明，諸如采用其它高低變化等搭接方式同樣在本實(shí)用新型要求保護(hù)的試紙條的范圍內(nèi)。
[0036]試紙條的整體長(zhǎng)度在8cm至12cm之間，整體寬度在0.2cm至0.5cm之間，優(yōu)選在0.2cm至0.3cm之間，最優(yōu)選為0.3cm。本實(shí)用新型的試紙條在提供靈敏度和檢測(cè)線性范圍的同時(shí)，通過(guò)降低試紙條的長(zhǎng)度和/或?qū)挾瓤山档涂贵w的用量，大大節(jié)約了生產(chǎn)成本。
[0037]圖2是本實(shí)用新型所述一種定量檢測(cè)心肌肌鈣蛋白1-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶的三項(xiàng)聯(lián)檢熒光層析試紙條的俯視示意圖。對(duì)圖2中與圖1相同的內(nèi)容不再贅述。
[0038]以下將結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本實(shí)用新型。
[0039]實(shí)施例
[0040]下述實(shí)施例中，所述心肌肌鈣蛋白I第一抗體、心肌肌鈣蛋白I第二抗體、肌紅蛋白第一抗體、肌紅蛋白第二抗體、肌酸激酶同工酶第一抗體、肌酸激酶同工酶第二抗體、抗鼠IgG抗體、熒光微球、親和素、生物素、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、N，N' - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、吡啶、牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、海藻糖、玻璃纖維素膜、聚酯膜、硝酸纖維素膜、高強(qiáng)度吸水紙均為市售產(chǎn)品。
[0041]所述一種定量檢測(cè)心肌肌鈣蛋白1-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶的三項(xiàng)聯(lián)檢熒光層析試紙條的制備方法為:
[0042]I)樣品墊的制備
[0043]將玻璃纖維素膜或者聚酯膜放入樣品墊處理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)中浸泡處理3_5小時(shí)后，于35_39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干3_5小時(shí)。
[0044]2)第一結(jié)合墊的制備
[0045]A、第一結(jié)合墊的預(yù)處理
[0046]將玻璃纖維素膜或者聚酯膜放入結(jié)合墊處理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)中浸泡處理3_5小時(shí)后，于35_39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干3_5小時(shí)。
[0047]B、標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球的制備
[0048]將心肌肌鈣蛋白I第一抗體以0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液4°C透析過(guò)夜，調(diào)整濃度為2mg/ml-5mg/ml。
[0049]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)活化緩沖液洗滌小粒徑熒光微球，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)使二者終濃度均為15-60mmol，室溫反應(yīng)20-30分鐘，充分洗滌熒光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液復(fù)溶后加入透析過(guò)的心肌肌鈣蛋白I第一抗體，使心肌肌鈣蛋白I第一抗體與熒光微球的質(zhì)量比為1: 8至1: 60，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液室溫封閉30分鐘，充分洗滌熒光微球，用含有1% BSA和0.1% Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液的保存液復(fù)溶至原體積。
[0050]使用0.05M，pH4.5-5.0的2- (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)活化緩沖液洗滌大粒徑熒光微球，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)使二者終濃度均為15-60mmol，室溫反應(yīng)20-30分鐘，充分洗滌熒光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液復(fù)溶后加入透析過(guò)的心肌肌鈣蛋白I第一抗體，使心肌肌鈣蛋白I第一抗體與熒光微球的質(zhì)量比為1: 20至1: 80，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液室溫封閉30分鐘，充分洗滌熒光微球，用含有1% BSA和0.1% Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液的保存液復(fù)溶至原體積。
[0051]將上述標(biāo)記心肌肌鈣蛋白I第一抗體的兩種不同粒徑的熒光微球按1: 10到10: I的比例進(jìn)行混勻，即制備出標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球。
[0052]C、生物素化抗體的制備
[0053]將心肌肌鈣蛋白I第二抗體以0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液4°C透析過(guò)夜，調(diào)整濃度為5mg/ml-10mg/ml。
[0054]生物素的預(yù)活化:準(zhǔn)確稱取300mg生物素溶解于8ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫條件下加入183mg的N-輕基琥泊酰亞胺(NHS)，304mg的N，N' - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)及0.1ml的吡啶，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。過(guò)濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的尿素，濾液濃縮后通過(guò)硅膠柱色譜純化，在異丙醇中重結(jié)晶得到的白色固體即為預(yù)活化的生物素。
[0055]用二甲基甲酰胺(DMF)溶解預(yù)活化的生物素，使其終濃度為0.05M，并加入到透析過(guò)的心肌肌鈣蛋白I第二抗體中，使得心肌肌鈣蛋白I第二抗體與生物素的摩爾比為I: 10-1: 25，室溫反應(yīng)I小時(shí)，以0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液4°C透析過(guò)夜。
[0056]D、第一結(jié)合墊的制備
[0057]將上述步驟B制備獲得的標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球與步驟C制備獲得的生物素化抗體充分混勾，使用定量噴膜儀以2 μ l/cm-8 μ 1/cm均勾噴涂于上述步驟A中預(yù)處理過(guò)的玻璃纖維素膜或者聚酯膜上，于35_39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2-4小時(shí)，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0058]3)第二結(jié)合墊的制備
[0059]A、第二結(jié)合墊的預(yù)處理
[0060]將玻璃纖維素膜或者聚酯膜放入結(jié)合墊處理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)中浸泡處理3_5小時(shí)后，于35_39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干3_5小時(shí)。
[0061]B、標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球的制備
[0062]將肌紅蛋白第一抗體以0.1Μ，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液4°C透析過(guò)夜，調(diào)整濃度為 2mg/ml-5mg/ml。
[0063]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)活化緩沖液洗滌小粒徑熒光微球，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)使二者終濃度均為15-60mmol，室溫反應(yīng)20-30分鐘，充分洗滌熒光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液復(fù)溶后加入透析過(guò)的肌紅蛋白第一抗體，使肌紅蛋白第一抗體與熒光微球的質(zhì)量比為1: 8至I: 60，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液室溫封閉30分鐘，充分洗滌熒光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液的保存液復(fù)溶至原體積。
[0064]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)活化緩沖液洗滌大粒徑熒光微球，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)使二者終濃度均為15-60mmol，室溫反應(yīng)20-30分鐘，充分洗滌熒光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液復(fù)溶后加入透析過(guò)的肌紅蛋白第一抗體，使肌紅蛋白第一抗體與熒光微球的質(zhì)量比為1: 20至I: 80，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液室溫封閉30分鐘，充分洗滌熒光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液的保存液復(fù)溶至原體積。
[0065]將上述標(biāo)記肌紅蛋白第一抗體的兩種不同粒徑的熒光微球按1: 10到10: I的比例進(jìn)行混勻，即制備出標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球。
[0066]C、第二結(jié)合墊的制備
[0067]將上述步驟B制備獲得的標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球混合物使用定量噴膜儀以2 μ l/cm-8 μ 1/cm均勻噴涂于上述步驟A中預(yù)處理過(guò)的玻璃纖維素膜或者聚酯膜上，于35-39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2-4小時(shí)，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0068]4)第三結(jié)合墊的制備
[0069]A、第三結(jié)合墊的預(yù)處理
[0070]將玻璃纖維素膜或者聚酯膜放入結(jié)合墊處理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)中浸泡處理3_5小時(shí)后，于35_39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干3_5小時(shí)。
[0071 ] B、標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球的制備
[0072]將肌酸激酶同工酶第一抗體以0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液4°C透析過(guò)夜，調(diào)整濃度為2mg/ml-5mg/ml。
[0073]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)活化緩沖液洗滌小粒徑熒光微球，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)使二者終濃度均為15-60mmol，室溫反應(yīng)20-30分鐘，充分洗滌熒光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液復(fù)溶后加入透析過(guò)的肌酸激酶同工酶第一抗體，使肌酸激酶同工酶第一抗體與熒光微球的質(zhì)量比為1: 8至1: 60，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液室溫封閉30分鐘，充分洗滌熒光微球，用含有1% BSA和0.1% Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液的保存液復(fù)溶至原體積。
[0074]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)活化緩沖液洗滌大粒徑熒光微球，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)使二者終濃度均為15-60mmol，室溫反應(yīng)20-30分鐘，充分洗滌熒光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液復(fù)溶后加入透析過(guò)的肌酸激酶同工酶第一抗體，使肌酸激酶同工酶第一抗體與熒光微球的質(zhì)量比為1: 20至1: 80，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液室溫封閉30分鐘，充分洗滌熒光微球，用含有1% BSA和0.1% Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液的保存液復(fù)溶至原體積。
[0075]將上述標(biāo)記第一抗體的兩種不同粒徑的熒光微球按1: 10到10: I的比例進(jìn)行混勻，即制備出標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球。
[0076]C、第三結(jié)合墊的制備
[0077]將上述步驟B制備獲得的標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球混合物使用定量噴膜儀以2 μ l/cm-8 μ 1/cm均勻噴涂于上述步驟A中預(yù)處理過(guò)的玻璃纖維素膜或者聚酯膜上，于35-39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2-4小時(shí)，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0078]5)包被膜的制備
[0079]A、檢測(cè)線(用于cTnl檢測(cè))的制備:使用包被液(含有0.1_10 %海藻糖的0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)將親和素稀釋到lmg/ml-5mg/ml的濃度，使用定量噴膜儀以1.2 μ 1/cm均勻噴涂于硝酸纖維素膜上，于35-39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2-4小時(shí)。
[0080]B、檢測(cè)線(用于Myo檢測(cè))的制備:將肌紅蛋白第二抗體以0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液4 °C透析過(guò)夜，使用包被液(含有0.1-10 %海藻糖的0.01-0.02Μ，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)將透析后的肌紅蛋白第二抗體稀釋到0.2mg/ml-4mg/ml的濃度，使用定量噴膜儀以1.2 μ Ι/cm均勾噴涂于硝酸纖維素膜上，于35_39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2-4小時(shí)。
[0081]C、檢測(cè)線(用于CK-MB檢測(cè))的制備:將肌酸激酶同工酶第二抗體以0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液4 °C透析過(guò)夜，使用包被液(含有0.1-10 %海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)將透析后的肌酸激酶同工酶第二抗體稀釋到0.2mg/ml-4mg/ml的濃度，使用定量噴膜儀以1.2 μ 1/cm均勻噴涂于硝酸纖維素膜上，于35-39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2-4小時(shí)。
[0082]D、質(zhì)控線的制備:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)將抗小鼠IgG稀釋到0.5mg/ml-3mg/ml的濃度，使用定量噴膜儀以
0.8 μ 1/cm均勻噴涂于硝酸纖維素膜上，于35-39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2_4小時(shí)。
[0083]E、包被膜的制備:用封閉液(含有1-10% BSA和1_10 %海藻糖的0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)將含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜封閉1_2小時(shí)，取出后置35-39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2-4小時(shí)，封袋備用。
[0084]6)試紙條的組裝
[0085]在濕度小于30%，溫度20_30°C條件下進(jìn)行試紙條的組裝。底板選用PVC材料，在底板同一面的方向順次連接且相鄰部位部分重疊的樣品墊、第一結(jié)合墊、第二結(jié)合墊、第三結(jié)合墊、包被膜及吸水紙。在包被膜粘覆底板時(shí)，檢測(cè)線的位置靠近結(jié)合墊，質(zhì)控線的位置靠近吸水紙。吸水紙為高強(qiáng)度吸水紙。組裝好后裁剪成試紙條。
【權(quán)利要求】
1.一種心肌肌鈣蛋白1-肌紅蛋白-肌酸激酶同工酶聯(lián)檢試紙條，其特征在于，所述試紙條包括: 1)用于接受來(lái)自全血、血漿或血清樣品的樣品墊； 2)同時(shí)包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的心肌肌鈣蛋白I第一抗體和生物素標(biāo)記的識(shí)別不同表位的心肌肌鈣蛋白第二抗體的第一結(jié)合墊； 3)包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的肌紅蛋白第一抗體的第二結(jié)合墊； 4)包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的肌酸激酶同工酶第一抗體的第三結(jié)合墊； 5)包被有相間隔的三條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線的包被膜，其中所述三條檢測(cè)線依次固定有親和素、識(shí)別不同表位的肌紅蛋白第二抗體及識(shí)別不同表位的肌酸激酶同工酶第二抗體，所述質(zhì)控線固定有抗鼠IgG的抗體； 6)用于提供檢測(cè)所需的毛細(xì)作用力的吸水紙；和 7)底板，其中所述底板上依次搭接粘貼的樣品墊、第一結(jié)合墊、第二結(jié)合墊、第三結(jié)合墊、包被膜和吸水紙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述兩種不同粒徑熒光微球的粒徑范圍均在50nm至500nm之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述第一結(jié)合墊、第二結(jié)合墊、第三結(jié)合墊材質(zhì)為玻璃纖維素膜或者聚酯膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述包被膜為硝酸纖維素膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述試紙條的寬度在0.2cm至0.5cm之間。
【文檔編號(hào)】G01N33/573GK204228719SQ201420674056
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】戈軍, 宋芳, 朱世偉, 王義娜, 岳洋, 李鼎鋒, 劉勇 申請(qǐng)人:江蘇達(dá)駿生物科技有限公司