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關(guān)于聯(lián)邦資助研發(fā)下所作出發(fā)明的權(quán)利的聲明

不適用。

發(fā)明背景

導(dǎo)電聚合物作為電極涂層在生物分子電子學(xué)中有很大的前景，并提供高導(dǎo)電性。然而，其特征是固有的機(jī)械性能差。水凝膠與導(dǎo)電聚合物的結(jié)合可能起到調(diào)節(jié)和改善機(jī)械性能的作用，也提供了一個(gè)防污表面以及水溶性生物活性劑的儲存庫。除此之外，電活性聚合物和生物相容性水凝膠的共混物提供了具有增強(qiáng)的靈敏度和更高的生物分子固定化的三維結(jié)構(gòu)，因此是用于開發(fā)生物傳感器的有前景的材料。

在所有已知的導(dǎo)電聚合物中，聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)表現(xiàn)出非常低的固有細(xì)胞毒性，植入后無炎癥反應(yīng)，從而使得它們適合生物傳感和生物工程應(yīng)用。聚乙二醇(PEG)是一種以優(yōu)良的防污性能而著稱的生物相容聚合物。在組織工程學(xué)和生物傳感器的開發(fā)中，PEG已廣泛用于減少多余蛋白質(zhì)吸附和細(xì)胞黏附。我們相信，PEDOT和PEG性能的組合可提供有前景的生物傳感材料。

發(fā)明簡述

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種傳感器，該傳感器具有底板；至少一個(gè)接觸所述底板的電極；覆蓋所述電極的納米多孔膜；以及選自下組的生物識別部分(biorecognition element)：肽、抗體、酶、和適體，其中所述生物識別部分共價(jià)結(jié)合到所述電極，或共價(jià)結(jié)合到嵌入所述納米多孔膜中的PEDOT無規(guī)共聚物，所述PEDOT無規(guī)共聚物具有式I結(jié)構(gòu)：

其中，各R獨(dú)立地選自下組：–OH和所述生物識別部分，其中至少一個(gè)R為生物識別部分，并且x和y獨(dú)立地為從約1到約1000的整數(shù)，其中x和y之和為約2到約1000的整數(shù)。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于檢測生物樣本中疾病標(biāo)記的方法，包括將本發(fā)明傳感器與生物樣本接觸，并且檢測所述疾病標(biāo)記到生物識別部分的結(jié)合，從而檢測所述疾病標(biāo)記。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種導(dǎo)電水凝膠，包括共價(jià)交聯(lián)的聚(乙二醇)(PEG)水凝膠；和嵌入所述PEG水凝膠的聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)無規(guī)共聚物；所述PEDOT無規(guī)共聚物具有式I結(jié)構(gòu)：

其中，各R獨(dú)立地選自下組：–OH和生物識別部分，所述生物識別部分選自下組：肽、抗體、酶、和適體，其中至少一個(gè)R為生物識別部分，并且x和y獨(dú)立地為從約1到約1000的整數(shù)，其中x和y之和為約2到約1000的整數(shù)。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明所述導(dǎo)電聚合物的方法，包括：在適于形成PEG水凝膠的聚合條件下，將PEG-二丙烯酸酯與光引發(fā)劑接觸；在足以形成嵌入到所述PEG水凝膠中的聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)無規(guī)共聚物的電聚合條件下，將所述PEG水凝膠與含有3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)和2,3-二氫噻吩并[3,4-b][1,4]二噁烷-2-羧酸(EDOT-COOH)的溶液接觸，所述聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)無規(guī)共聚物具有式I：

其中，各R為–OH，并且x和y各自為從約1到約1000的整數(shù)，其中x和y之和為約2到約1000的整數(shù)；并且，在足以將生物識別部分共價(jià)結(jié)合至所述PEDOT無規(guī)共聚物的條件下，將所述水凝膠與所述生物識別部分接觸，從而形成式I的PEDOT無規(guī)共聚物，其中至少一個(gè)R為選自下組的生物識別部分：肽、抗體和適體，從而制備本發(fā)明的導(dǎo)電水凝膠。

附圖簡述

圖1顯示了圖形化電極的裝配以及多孔聚乙二醇水凝膠的聚合作用。

圖2A-2C顯示了EDOT/EDOT-COOH到聚乙二醇水凝膠中的聚合作用。

圖3A和3B顯示了聚乙二醇水凝膠電極的循環(huán)伏安曲線(掃描速率50mV/s,1X PBS)，(3A)為無PEDOT摻入，(3B)為有PEDOT摻入。

圖4A和4B顯示固定了抗體的PEDOT-聚乙二醇水凝膠對不同重組體濃度的響應(yīng)。圖4A顯示了隨著重組B-IFN-γ濃度的增加，在PEDOT-聚乙二醇水凝膠的循環(huán)伏安圖中，表現(xiàn)出還原峰值的抑制。圖4B顯示了作為重組B-IFN-γ濃度的函數(shù)的還原電流值。

圖5顯示了帶有板上(on-plate)電極設(shè)計(jì)和部件的多孔板陣列。(1)底層-圖形化電極。這些包括，工作電極、反電極和參比電極。(2)第二層(藍(lán)色)，納米多孔膜，防止來自生理液體中的細(xì)胞吸附到電極上。(3)激光切割的塑料微孔，粘合到之前的底板上，以及(4)塑料密封，以防止檢測中的生理液體蒸發(fā)。

圖6A-6C顯示了八孔板電極陣列構(gòu)造物，其帶有接觸墊和連接導(dǎo)線(圖6A)以及絲網(wǎng)印刷的具有Ag/AgCl漿的參比電極，紅色圓圈表明每個(gè)孔板包括工作電極、反電極和參比電極(圖6B)。納米多孔膜和PDMS微孔膜部件(圖6C)。

圖7A和7B。圖7A顯示了通過PEG的光聚合和在制備的PEG內(nèi)的PEDOT的電聚合而制備PEDOT/PEG導(dǎo)電水凝膠。圖7B顯示，牛IFN-γ與固定了抗體的導(dǎo)電水凝膠的結(jié)合，導(dǎo)致電化學(xué)信號下降。

圖8A-8C顯示了電極特征。圖8A顯示了圖形化Au電極陣列，以及EDOT/PEG導(dǎo)電水凝膠電聚合之前(圖8B)和之后(圖8C)的電極，所述導(dǎo)電水凝膠通過PEG的光聚合和PEDOT在制備的PEG內(nèi)的電聚合(在ITO電極上)而制備(比例尺：500μm)。

圖9A-9D顯示了SEM圖像，展現(xiàn)如下表面形態(tài)：金電極(圖9A)、PEG(圖9B)、PEDOT(圖9C)和PEDOT/PEG(圖9D)導(dǎo)電水凝膠。

圖10A-10D顯示了導(dǎo)電水凝膠的表征：(圖10A)循環(huán)伏安曲線(CV)顯示了僅PEG和PEDOT/PEG表面的對比。PEDOT/PEG基質(zhì)的循環(huán)伏安曲線表現(xiàn)出PEDOT固有的氧化和還原，與僅PEG基質(zhì)相比電流值增強(qiáng)100倍。(圖10B)在Au表面上電聚合的PEDOT和PEDOT/PEG的循環(huán)伏安曲線。(圖10C)固定有B-INF-γ抗體的導(dǎo)電聚合水凝膠表面用不同濃度的重組牛IFN-γ激發(fā)，并記錄循環(huán)伏安曲線。IFN-γ的捕獲引起了I_p值的下降。(圖10D)基于B-INF-γ的濃度比I_p值得到校正曲線。

圖11A-11E顯示了導(dǎo)電水凝膠傳感器的性能測試。(圖11A)用全血激發(fā)PEDOT/PEG時(shí)，電化學(xué)電流峰值沒有改變。(圖11B)非特異性細(xì)胞因子或(圖11C)人INF-γ確實(shí)在傳感器上顯示出明顯的電化學(xué)信號。(圖11D)電化學(xué)信號的下降響應(yīng)于血漿樣本中的牛IFN-γ。ELISA結(jié)果和電化學(xué)信號下降之間的關(guān)聯(lián)。(圖11E)從牛PBMCs中細(xì)胞釋放的牛IFN-γ的實(shí)時(shí)監(jiān)測。

圖12A-12C顯示了PEDOT(圖12A)、PEG(圖12B)和PEDOT+PEG(圖12C)的AFM力學(xué)。

圖13A-13D顯示了PEDOT沉積的優(yōu)化，作為所施加的電荷的函數(shù)。

圖14A-14B顯示了通過甲苯胺藍(lán)染色試驗(yàn)進(jìn)行的導(dǎo)電水凝膠上羧酸基團(tuán)的定量。

圖15A-15B顯示了不同濃度的牛INF-γ下ITO電極上的熒光圖像。

圖16A-16B顯示了摻入了牛血/PBS(1:1)的INF-γ檢測。

圖17顯示了本發(fā)明傳感器的示意圖，包括參比電極、工作電極和反電極的位置。

圖18A-18B顯示了本發(fā)明生物傳感器(100)的不同實(shí)施方式(橫截面)，包括底板(110)、電極(120)、帶有生物識別部分(140)的納米多孔膜(130)，以及位于底板上的自組裝單分子層(monolayer)(150)。

圖19A-19B顯示了本發(fā)明的生物傳感器(200)的不同實(shí)施方式(橫截面)，包括底板(210)、電極(220)、納米多孔膜(230)，其中生物識別部分(240)通過電極上的自組裝單分子層(250)連接至電極。

發(fā)明詳述

I.綜述

本發(fā)明提供一種用于生物物質(zhì)檢測和疾病檢測的傳感器。所述傳感器包括生物識別部分，該生物識別部分附著于覆蓋電極的導(dǎo)電聚合物，從而該生物識別部分與生物物質(zhì)的結(jié)合導(dǎo)致檢測到的電極電勢發(fā)生變化，因此檢測到結(jié)合活動(dòng)(binding event)。該傳感器能夠不使用標(biāo)簽而進(jìn)行檢測。此外，導(dǎo)電聚合物，PEDOT-聚乙二醇水凝膠，具有改進(jìn)的力學(xué)性能，并且由于共價(jià)結(jié)合至底板表面，其能夠更好地抵抗與電極的層離。

II.定義

“底板”指的是適于支撐本發(fā)明傳感器的任意固體材料。適當(dāng)?shù)牡装蹇砂ɡ绻?、二氧化硅和銦錫氧化物等材料。適當(dāng)?shù)牡装宓睦影ǖ幌抻?，玻?包括可控孔度玻璃)、聚合物(例如，聚苯乙烯、聚氨基甲酸乙酯、聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)、硅橡膠、石英、乳膠、過渡金屬、磁性材料、二氧化硅、氮化硅、砷化鎵、及其衍生物。除表面上的活性位置之外，底板材料通常對各種可能經(jīng)受的化學(xué)反應(yīng)條件具有耐受性。本發(fā)明中使用的底板可以是光滑的或粗糙的。光滑表面是該表面上具有極少的造成粗糙的特征。粗糙表面是該表面上具有大量的產(chǎn)生摩擦的特征。本發(fā)明的底板包括第一底板和第二底板。所述底板可以是平的或不平的，柔性的或剛性的。此外，所述底板可以是多孔的、網(wǎng)狀的或織物狀的。所述底板可以是不透明或透明的，并且可以透射或反射光，或兩者兼有。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明中可使用其他底板。

“電極”指的是用于與電路的一部分相接觸的電導(dǎo)體。所述電路通?？砂ㄈ舾梢黄鹱饔玫碾姌O，如工作電極、反電極和參比電極。工作電極是系統(tǒng)中感興趣的反應(yīng)或相互作用發(fā)生的電極。反電極在所進(jìn)行的測量中協(xié)助工作電極。參比電極提供穩(wěn)定的電極電勢，相對于該電極電勢測量工作電極和反電極的電勢。

“膜”指的是層，該層允許材料和流體從一個(gè)位置通過膜移動(dòng)到另一位置。由于孔的尺寸限制，所述膜可阻止一些材料的移動(dòng)。當(dāng)所述孔是納米大小時(shí)，所述膜可以是納米多孔膜。

“接觸”指的是讓至少兩種不同對象緊密靠近，使得第一對象的至少一個(gè)表面的一部分與第二對象的至少一個(gè)表面的一部分相接觸。

“共價(jià)結(jié)合”指的是本發(fā)明底板和一部分水凝膠之間共價(jià)鍵的形成。

“生物識別部分”指的是能夠特異結(jié)合至另一種生物物質(zhì)的生物物質(zhì)。

“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可互換使用，指的是氨基酸殘基的聚合物。所有該三個(gè)術(shù)語適用于氨基酸聚合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文所用，該術(shù)語涵蓋了任意長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白，其中氨基酸殘基通過共價(jià)肽鍵連接。

如本文所用，“抗體”包括與特定抗原具有免疫反應(yīng)性的免疫球蛋白分子，包括多克隆抗體和單克隆抗體。該術(shù)語還包括基因工程化形式，例如嵌合抗體(例如，人源化鼠抗體)和綴合抗體(例如，雙特異性抗體)。該術(shù)語“抗體”還包括抗體的抗原結(jié)合形式，包括具有抗原結(jié)合能力的片段(例如，F(xiàn)ab’、F(ab’)₂、Fab、Fv和rIgG。另請參閱，Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL).另請參閱，例如，Kuby，J.，Immunology,3^rd Ed.,W.H.Freeman&Co，紐約(1998)。該術(shù)語也指重組單鏈Fv片段(scFv)。術(shù)語抗體還包括二價(jià)或雙特異性分子、雙抗體、三抗體和四抗體。二價(jià)和雙特異性分子描述于例如Kostelny等J Immunol 148:1547,Pack和Pluckthun(1992)生物化學(xué)31:1579,Hollinger等,1993,supra,Gruber等.(1994)J Immunol:5368,Zhu等.(1997)Protein Sci 6:781,Hu等.(1996)Cancer Res.56:3055,Adams等.(1993)Cancer Res.53:4026,和McCartney,等.(1995)Protein Eng.8:301。

與特定抗原具有免疫反應(yīng)性的抗體可通過重組方法產(chǎn)生，例如在噬菌體或類似載體的重組抗體庫中選擇，參見，例如Huse等，Science 246:1275-1281(1989)；Ward等，Nature 341:544-546(1989)；和V金ghan等，Nature Biotech.14:309-314(1996)，或通過用抗原或編碼抗原的DNA免疫動(dòng)物。

典型地，免疫球蛋白具有重鏈和輕鏈。每條重鏈和輕鏈含有恒定區(qū)和可變區(qū)(這些區(qū)域也稱為“結(jié)構(gòu)域”)。輕鏈和重鏈可變區(qū)包括由三個(gè)高度可變區(qū)(也稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDRs”)中斷的四個(gè)“框架”區(qū)。已定義框架區(qū)和CDRs的范圍。物種內(nèi)不同輕鏈或重鏈的框架區(qū)序列是相對保守的?？贵w的框架區(qū)，即作為組分的輕鏈和重鏈的組合框架區(qū)，用于在三維空間中定位和對齊CDRs。

CDRs主要負(fù)責(zé)結(jié)合至抗原表位。每條鏈的CDRs通常稱作CDR1、CDR2和CDR3，順序編號從N末端開始，并且通常還通過特定的CDR所位于的鏈來識別。因此，V_H CDR3位于其被發(fā)現(xiàn)的抗體中的重鏈的可變結(jié)構(gòu)域，而V_L CDR1是來自于其被發(fā)現(xiàn)的抗體中的輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的CDR1。

提及“V_H”或“VH”指的是抗體的免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、或Fab的重鏈。提及“V_L”或“VL”指的是免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的輕鏈。

短語“單鏈Fv”或“scFv”指的是抗體，其中傳統(tǒng)的兩條鏈抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)已結(jié)合形成一條鏈。典型地，接頭肽插入到兩條鏈之間，以允許適當(dāng)折疊和活躍結(jié)合位點(diǎn)的產(chǎn)生。

“嵌合抗體”是免疫球蛋白分子，其中(a)恒定區(qū)或其一部分，被改變、替代或交換，從而抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))連接至不同的或改變的類別、效應(yīng)因子功能和/或物種的恒定區(qū)，或者連接至為嵌合抗體賦予了新特性的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或者(b)可變區(qū)或其一部分，用具有不同的或改變的抗原特異性的可變區(qū)來改變、替代或交換。

“人源化抗體”是免疫球蛋白分子，其包括來自非人類免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被具有期望的特異性、親和性和能力的非人物種(供體抗體)(例如小鼠、大鼠、或兔)CDR殘基所取代。在一些實(shí)例中，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應(yīng)的非人類殘基取代。人源化抗體還可包含既不在受體抗體也不在引入的CDR或框架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化抗體會包含至少一個(gè)、典型地為兩個(gè)可變區(qū)的基本上所有(的區(qū)域)，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)域相當(dāng)于非人類免疫球蛋白的區(qū)域，所有或基本上所有的框架(FR)區(qū)域是人免疫球蛋白共有序列的那些。最佳地，人源化抗體還包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，典型地為人免疫球蛋白的(Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))。人源化可基本上遵循Winter與其同事的方法(Jones等，Nature321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239:1534-1536(1988))，通過用嚙齒動(dòng)物的CDRs或CDR序列代替人抗體的相應(yīng)序列。因此，這類人源化抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中實(shí)質(zhì)上少于完整人可變區(qū)(的區(qū)域)(substantially less than an intact human variable domain)被來自非人物種的相應(yīng)序列取代。

“表位”或“抗原決定簇”指的是抗原上的位點(diǎn)，抗體結(jié)合于該位點(diǎn)。表位可以由連續(xù)氨基酸或通過蛋白的三級折疊而并列的非連續(xù)氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的表位在暴露于變性溶劑時(shí)通常能夠保持，而由三級折疊形成的表位在變性溶劑處理下通常會丟失。表位通常在獨(dú)特的空間構(gòu)象中包括至少3個(gè)，更通常地，至少5個(gè)或8-10個(gè)氨基酸。測定表位空間構(gòu)象的方法包括：例如，X-光晶體學(xué)和二維核磁共振。參見，例如，分子生物學(xué)中表位作圖方法(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology)，卷.66，Glenn E.Morris,Ed(1996)。

“酶”指的是生物催化劑。

“適體”指的是可結(jié)合至特定靶分子的寡核苷酸或肽。

“3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)”指的是如下化學(xué)結(jié)構(gòu)：

“2,3-二氫噻吩并[3,4-b][1,4]二噁烷-2-羧酸(EDOT-COOH)”指的是如下化學(xué)結(jié)構(gòu)：

“PEDOT無規(guī)共聚物”指的是聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)共聚物，其中EDOT和EDOT-COOH共聚在一起形成PEDOT，所述PEDOT具有在共聚物中隨機(jī)分布的EDOT-COOH：

“自組裝單分子層”指的是單層的物質(zhì)例如有機(jī)化合物，組裝在底板表面上。自組裝單層可從各種材料形成，例如在硅上的硅烷或在金上的硫醇。

“氧化還原報(bào)告部分(Redox reporting moiety)”指的是能夠響應(yīng)于電勢的變化而產(chǎn)生可測量信號的任意部分。電流的可測量的變化可被關(guān)聯(lián)到目標(biāo)分析物的濃度。

“硫醇部分”指的是“-SH”基團(tuán)。

“PEG”指的是聚乙二醇和聚環(huán)氧乙烷聚合物。PEG可具有從小于1000道爾頓至大于100,000道爾頓的任意適當(dāng)?shù)姆肿恿?。PEG也可用各種基團(tuán)在α端或ω端進(jìn)行官能化。例如，PEG可用一個(gè)或多個(gè)丙烯酸酯基團(tuán)官能化。當(dāng)用兩個(gè)丙烯酸酯基團(tuán)官能化PEG時(shí)，形成聚乙二醇-二丙烯酸酯。PEG可通過PEG鏈的交聯(lián)以及水摻入交聯(lián)的聚合物基質(zhì)而形成水凝膠。

如本文所用，術(shù)語“水凝膠”指的是高度相互依賴的和相互連接的雙相基質(zhì)，所述基質(zhì)具有既有親水性又有疏水性的固體組分(通常為聚合物，更通常為高度交聯(lián)的聚合物)。此外，所述基質(zhì)含有通過分子間力保留在基質(zhì)中的液體組分(例如水)。疏水性質(zhì)為基質(zhì)提供了一定程度的水不溶性，而親水性質(zhì)提供了透水性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，幾種不同類型的聚合物可組合使用以形成本發(fā)明方法中可用的水凝膠。

“微量滴定孔板”指的是具有用于測試目的的多個(gè)孔的板，其中電極在每個(gè)孔的底部。每個(gè)電極可被孔邊界包圍，所述孔邊界限定了圍繞電極的壁。每個(gè)孔可被孔蓋覆蓋。

“疾病標(biāo)記”指的是特定疾病的存在或相對風(fēng)險(xiǎn)的可測量的指標(biāo)。疾病標(biāo)記可以是遺傳的，或通過病人血液或身體內(nèi)某種組分相對于正常濃度的相對濃度來表示。所述疾病標(biāo)記也可以是病人體內(nèi)特定器官或過程的相對功能(相對于該器官或過程的正常功能)。

“生物樣本”指的是患者身體的任意樣本，包括組織、器官、液體等。

“峰還原電流”指的是正被還原的電化學(xué)物質(zhì)的表觀電位上的電流。

“方波伏安法”指的是電化學(xué)中采用的波形，電勢(電壓)不以線性方式而以鋸齒形的方式掃描。這種電勢掃描方法使電容性電流最小化，對于電流微小變化的靈敏測量是優(yōu)選的。

“結(jié)核病”指的是由分枝桿菌例如結(jié)核分枝桿菌(myobacterium tuberculosis)引起的疾病。

“丙型肝炎”指的是由丙型肝炎病毒(黃病毒科(Flaviviridae)的成員)引起的疾病。

“γ干擾素”和“IFN-γ”指的是結(jié)合II型IFN受體的II型干擾素，干擾宿主細(xì)胞的病毒感染。IFN-γ調(diào)節(jié)多種生物功能，如抗病毒反應(yīng)、細(xì)胞生長、免疫應(yīng)答和腫瘤抑制，并且可以介導(dǎo)多種人類疾病。

“光引發(fā)劑”指的是照射后啟動(dòng)聚合過程的化合物。光引發(fā)劑可產(chǎn)生酸(光-酸產(chǎn)生劑或PAG)或自由基，以及其他引發(fā)物質(zhì)。所述酸、自由基或其他引發(fā)物質(zhì)，之后引發(fā)聚合作用。

“電聚合條件”指的是電啟動(dòng)而非化學(xué)啟動(dòng)的聚合過程。電聚合的條件包括以充分的電流和/或電荷應(yīng)用電勢至預(yù)聚合混合物以引發(fā)聚合。電聚合條件可隨制備的聚合物變化。

“嵌入(embedded)”指的是導(dǎo)電聚合物在納米多孔膜中的插層(intercalation)，其中所述導(dǎo)電聚合物沒有共價(jià)連接到納米多孔膜。

III.導(dǎo)電生物傳感器

本發(fā)明提供一種生物傳感器，用于檢測可指示特定疾病的生物物質(zhì)。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種傳感器，該傳感器具有底板；至少一個(gè)接觸所述底板的電極；覆蓋所述電極的納米多孔膜；以及選自下組的生物識別部分：肽、抗體、酶、和適體，其中所述生物識別部分共價(jià)結(jié)合到所述電極上，或共價(jià)結(jié)合到嵌入所述納米多孔膜中的PEDOT無規(guī)共聚物，所述PEDOT無規(guī)共聚物具有式I結(jié)構(gòu)：

其中，各R獨(dú)立地選自下組：–OH和所述生物識別部分，其中至少一個(gè)R為生物識別部分，并且x和y獨(dú)立地為從約1到約1000的整數(shù)，其中x和y之和為約2到約1000的整數(shù)。

圖18A-18B顯示了本發(fā)明的生物傳感器(100)的不同實(shí)施方式(橫截面)，包括底板(110)、電極(120)、帶有生物識別部分(140)的納米多孔膜(130)，以及位于底板上的自組裝單分子層(150)。圖19A-19B也顯示了本發(fā)明的生物傳感器(200)的不同實(shí)施方式(橫截面)，包括底板(210)、電極(220)、納米多孔膜(230)，其中生物識別部分(240)通過電極上的自組裝單分子層(250)連接至電極。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分(240)可直接連接至電極(220)，無需介入的自組裝單分子層(參見圖19B)。

本發(fā)明的底板可以是適于支撐電極并結(jié)合聚乙二醇水凝膠的任何底板。適當(dāng)?shù)牡装宓睦涌梢允遣Ａ?、絕緣體、陶瓷、半導(dǎo)體、金屬、聚合物等。代表性的底板包括玻璃。在一些實(shí)施方式中，所述底板可以是玻璃。

本發(fā)明的生物傳感器可以包括任何適當(dāng)數(shù)目和類型的接觸底板的電極(120)。例如，所述生物傳感器可包括工作電極、反電極和參比電極。所述電極可由任何適當(dāng)?shù)膶?dǎo)電材料制成。例如，所述電極可由金屬制成，例如但不限于金、銀、鉑、銅等。其他的電極材料包括金屬鹽，例如氯化銀。在一些實(shí)施方式中，所述生物傳感器包括工作電極、反電極和參比電極。在一些實(shí)施方式中，所述電極由金制成。

本發(fā)明的電極可相對于彼此以任何適當(dāng)?shù)男问絹矶ㄏ?。例如，所述電極可以是圓形的，由另一個(gè)電極環(huán)繞一個(gè)電極。此外，所述電極可以是任何適當(dāng)?shù)男螤?，如方形、圓形、或環(huán)面形。

在一些實(shí)施方式中，所述電極是微圖形化的金電極。在一些實(shí)施方式中，所述傳感器包括中央工作電極、環(huán)繞的反電極、和參比電極。在一些實(shí)施方式中，所述工作電極是金電極。在一些實(shí)施方式中，所述參比電極是銀/氯化銀電極。

本發(fā)明的生物傳感器也可包括覆蓋電極的納米多孔膜。所述納米多孔膜可從任何適當(dāng)?shù)牟牧蟻碇苽洹＠?，納米多孔膜可以是聚合物、無機(jī)材料(例如陶瓷)或氧化物(例如氧化鋁)、或其他類似材料。所述納米多孔膜可以是導(dǎo)電的或不導(dǎo)電的。所述納米多孔膜可具有任何合適尺寸的孔，如從10nm至100μm。所述納米多孔膜可以是任何適當(dāng)?shù)暮穸?，例如?0nm至10mm。在一些實(shí)施方式中，所述納米多孔膜可以是氧化鋁。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的生物傳感器不包括納米多孔膜。

所述納米多孔膜也可以是導(dǎo)電水凝膠。任何適當(dāng)?shù)膶?dǎo)電水凝膠都可用于本發(fā)明。所述水凝膠可由任何適當(dāng)?shù)牟牧现苽?，例如聚乙二?PEG)。所述PEG可用可交聯(lián)基團(tuán)(例如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或其他可聚合基團(tuán))官能化。所述PEG可以是任何適當(dāng)?shù)姆肿恿俊＠?，所述PEG可具有約1kDs、2、3、4、5、6、7、8、9或10kDa的分子量。所述PEG也可具有至多約100kDa的分子量。在一些實(shí)施方式中，所述PEG可以是具有約6kDa分子量的聚乙二醇-二丙烯酸酯。

在一些實(shí)施方式中，聚乙二醇水凝膠可共價(jià)連接至底板。例如，所述底板可用自組裝單分子層修飾，所述自組裝單分子層能夠在制備PEG水凝膠的聚合過程中共價(jià)結(jié)合至PEG-二丙烯酸酯。在一些實(shí)施方式中，所述底板用含丙烯酸酯官能團(tuán)的自組裝單分子層修飾。納米多孔膜共價(jià)連接至底板可減少納米多孔膜的層離，提高本發(fā)明生物傳感器的穩(wěn)定性和壽命。

導(dǎo)電水凝膠還可包括導(dǎo)電聚合物。任何適當(dāng)?shù)膶?dǎo)電聚合物基質(zhì)均適用于本發(fā)明的生物傳感器。例如，導(dǎo)電聚合物可以包括聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)聚合物。本發(fā)明也可使用其它的導(dǎo)電聚合物，包括但不限于，聚吡咯、聚噻吩等。

所述導(dǎo)電水凝膠可通過任何適當(dāng)?shù)姆绞絹碇苽?。例如，可以首先使用乙烯聚合方法制備聚乙二醇水凝膠，隨后使用電聚合方法制備PEDOT聚合物。乙烯聚合方法包括酸催化的或自由基引發(fā)的聚合。在一些實(shí)施方式中，PEG的聚合可以是光引發(fā)的。PEDOT聚合物可以是幾個(gè)EDOT單體單元(包括EDOT和EDOT-COOH)的共聚物。當(dāng)EDOT單體共聚時(shí)，能夠形成PEDOT無規(guī)共聚物。PEDOT共聚物可以是任何適當(dāng)?shù)姆肿恿?，具有任何適當(dāng)分布的EDOT和EDOT-COOH共聚單體。例如，EDOT和EDOT-COOH共聚單體的比例可以從約1000:1至約1:1000、或者約500:1、100:1、50:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:50、1:100或約1:1000。也可使用其他比例的單體。

在一些實(shí)施方式中，PEDOT無規(guī)共聚物可具有式I結(jié)構(gòu)：

其中，各R獨(dú)立地選自下組：–OH和生物識別部分，其中至少一個(gè)R為生物識別部分，并且，x和y獨(dú)立地為從約1到約1000的整數(shù)，其中x和y之和為約2到約1000的整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，x與y的比例從約10:1到約1:10。在一些實(shí)施方式中，x與y的比例為約1:4。

PEDOT無規(guī)共聚物可在聚乙二醇水凝膠制備之前或之后制備。在一些實(shí)施方式中，PEDOT無規(guī)共聚物在聚乙二醇水凝膠制備之后制備，通過將EDOT和EDOT-COOH單體沉積在聚乙二醇水凝膠中并將聚乙二醇水凝膠暴露于電聚合傳導(dǎo)(conductions)，從而將PEDOT無規(guī)共聚物制備在聚乙二醇水凝膠中，但不共價(jià)連接到聚乙二醇水凝膠。

本發(fā)明包括任何適當(dāng)?shù)纳镒R別部分。例如，所述生物識別部分可以包括抗體、適體、駱駝科動(dòng)物抗體(camelid)、肽、蛋白或其它生物物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分可以是肽、抗體、酶或適體。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分可以是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分可以是酶。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分可以是適體。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分可以是IFN-γ。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分可以是牛-IFN-γ。

本發(fā)明中可使用任何適當(dāng)?shù)倪m體或酶作為生物識別部分。本發(fā)明中的適體可對炎癥細(xì)胞因子具有特異性，所述炎癥細(xì)胞因子包括但不限于TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21和TGF-β。所述適體也可對細(xì)胞表面標(biāo)志物具有特異性，所述細(xì)胞表面標(biāo)志物包括但不限于CD4、CD8、CD36、CD 14、CD45和EpCAM。所述適體也可對病原體組分具有特異性，所述病原體組分包括但不限于HIV、HBV、HCV和性傳播疾病(STDs)。適體還可對存在于細(xì)胞外囊泡的跨膜蛋白例如CD63具有特異性。任何氧化還原酶可用作本發(fā)明中的生物識別部分。所述酶的主要類別包括但不限于：氧化還原酶(例如過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶)和NADH依賴性酶。

其他生物識別部分包括肽。所述肽可以是結(jié)合至疾病標(biāo)記，或作為蛋白酶底物的任何適當(dāng)?shù)碾摹４祟愲脑试S本發(fā)明的生物傳感器檢測蛋白酶活性。

所述生物識別部分可以連接到導(dǎo)電聚合物，或直接連接到電極。在一些實(shí)施方式中，生物識別部分可以連接到導(dǎo)電聚合物。當(dāng)所述導(dǎo)電聚合物為PEDOT無規(guī)共聚物時(shí)，所述生物識別部分可連接到PEDOT無規(guī)共聚物的羧酸基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分被共價(jià)結(jié)合到嵌入在納米多孔膜內(nèi)的PEDOT無規(guī)共聚物，其中所述納米多孔膜包括具有約1000Da至約10,000Da分子量的PEG鏈的聚乙二醇水凝膠。

在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分可共價(jià)連接到電極上。當(dāng)所述生物識別部分共價(jià)連接到電極時(shí)，所述電極可被能夠共價(jià)連接到生物識別部分的自組裝單分子層修飾。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分共價(jià)連接到電極上以在電極上形成生物識別部分的自組裝單分子層。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分為具有氧化還原報(bào)告部分和硫醇部分的適體，其中所述硫醇部分共價(jià)連接到金工作電極。

本發(fā)明的生物傳感器可具有一個(gè)生物識別部分或幾個(gè)不同的生物識別部分。例如，PEDOT導(dǎo)電聚合物可被幾個(gè)不同的生物識別部分官能化。這允許同時(shí)檢測幾種不同的疾病標(biāo)記，并且當(dāng)檢測幾種不同的疾病標(biāo)記之一時(shí)有更大的靈活性。類似地，當(dāng)所述生物識別部分直接連結(jié)到電極上時(shí)，每個(gè)電極可用一種生物識別部分或幾種不同的生物識別部分修飾。參見，例如Liu等,“從相同適體-官能化的電極中檢測細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子”Biosensors and Bioelectronics 2015,64,43-50，以整體引用的方式納入本文。

本發(fā)明的生物傳感器可包括多種其他組分。例如，所述生物傳感器可包括微量滴定孔板、孔蓋，等等。在一些實(shí)施方式中，所述生物傳感器還包括用于容納生物傳感器的微量滴定孔板。在一些實(shí)施方式中，所述生物傳感器還包括孔蓋，所述孔蓋包含一個(gè)或多個(gè)接觸底板的壁，所述壁限定了圍繞電極的孔邊界。

IV.檢測疾病標(biāo)記的方法

本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明生物傳感器通過檢測疾病標(biāo)記來檢測疾病的方法。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種檢測生物樣本中的疾病標(biāo)記的方法，包括將本發(fā)明傳感器與生物樣本接觸，并且檢測所述疾病標(biāo)記與生物識別部分的結(jié)合，從而檢測所述疾病標(biāo)記。

所述檢測可通過任何適當(dāng)?shù)难b置或設(shè)備來進(jìn)行。例如，所述檢測可包括檢測由本發(fā)明生物傳感器產(chǎn)生的電信號的變化。不受理論的束縛，當(dāng)所述疾病標(biāo)記結(jié)合到生物識別部分時(shí)，納米多孔膜中的電信號產(chǎn)生變化，并且該變化通過導(dǎo)電聚合物從生物識別部分傳送到電極。

在一些實(shí)施方式中，檢測疾病標(biāo)記與生物識別部分的結(jié)合包括測量PEDOT無規(guī)共聚物的峰值還原電流。在一些實(shí)施方式中，利用方波伏安法檢測所述疾病標(biāo)記與生物識別部分的結(jié)合。

任何適當(dāng)?shù)募膊?biāo)記都可用于檢測。例如，所述疾病標(biāo)記可以是來自患者的肽、蛋白、抗體、酶、細(xì)胞、組織等。在一些實(shí)施方式中，所述疾病標(biāo)記可以是干擾素。在一些實(shí)施方式中，所述疾病標(biāo)記可以是γ干擾素。其他疾病標(biāo)記包括外體(exosomes)、細(xì)胞外囊泡(EVs)。所述細(xì)胞外囊泡包含使用特定適體可檢測到的跨膜蛋白。示例性的跨膜蛋白包括但不限于CD63。其他疾病標(biāo)記包括蛋白酶，例如但不限于，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)MMP2、MMP4和MMP9，以及尿激酶(uPA)。

所述疾病標(biāo)記可以指示任何疾病的存在，例如癌癥、病毒感染、細(xì)菌感染、心臟疾病、自身免疫性疾病等。代表性的病毒感染包括但不限于：HIV、HBV、HCV、皰疹、水痘帶狀皰疹病毒、艾巴氏病毒(Epstein-barr)、巨細(xì)胞病毒、乳頭瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花病毒、柯薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)炎、犀牛病毒、SARS、黃熱病、登革熱、西尼羅河、風(fēng)疹、流行性感冒，埃博拉、馬爾堡病、麻疹、流行性腮腺炎、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、狂犬病、及其他。代表性的細(xì)菌感染包括但不限于，肺結(jié)核、破傷風(fēng)、傷寒、白喉、梅毒和麻風(fēng)病。代表性癌癥包括但不限于，白血病、CNS、腎臟、非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌或腸癌。其它疾病

在一些實(shí)施方式中，所述疾病標(biāo)記表明由肺結(jié)核或丙肝感染。在一些實(shí)施方式中，所述疾病標(biāo)記包括IFN-γ。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分包括干擾素-γ(IFN-γ)抗體。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分包括特異于IFN-γ的適體。

V.導(dǎo)電水凝膠

本發(fā)明還提供用于本發(fā)明生物傳感器的導(dǎo)電水凝膠。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種導(dǎo)電水凝膠，包括共價(jià)交聯(lián)的聚(乙二醇)(PEG)水凝膠；和嵌入所述PEG水凝膠的聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)無規(guī)共聚物，所述PEDOT無規(guī)共聚物具有式I結(jié)構(gòu)：

其中，各R獨(dú)立地選自下組：–OH和生物識別部分，所述生物識別部分選自下組：肽、抗體、酶、和適體，其中至少一個(gè)R為生物識別部分，并且，x和y獨(dú)立地為從約1到約1000的整數(shù)，其中x和y之和為約2到約1000的整數(shù)。

在一些實(shí)施方式中，所述聚乙二醇水凝膠包括具有從約1000Da至約10,000Da分子量的PEG鏈。在一些實(shí)施方式中，所述聚乙二醇水凝膠包括具有約6000Da分子量的PEG鏈。在一些實(shí)施方式中，x與y的比例從約10:1到約1:10。在一些實(shí)施方式中，x與y的比例為約1:4。在一些實(shí)施方式中，所述共價(jià)交聯(lián)的聚(乙二醇)水凝膠由聚乙二醇-二丙烯酸酯制備。

VI.制備導(dǎo)電水凝膠生物傳感器的方法

本發(fā)明的導(dǎo)電水凝膠可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行制備。例如，可以首先制備聚乙二醇水凝膠，然后導(dǎo)電聚合物，例如PEDOT，可在聚乙二醇水凝膠中進(jìn)行聚合，從而導(dǎo)電聚合物嵌入聚乙二醇水凝膠中但不共價(jià)連接到聚乙二醇水凝膠。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明導(dǎo)電水凝膠的方法，包括：在適于形成聚乙二醇水凝膠的聚合條件下，將聚乙二醇-二丙烯酸酯與光引發(fā)劑接觸；在足以形成嵌入到聚乙二醇水凝膠中的聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)無規(guī)共聚物的電聚合條件下，將聚乙二醇水凝膠與含有3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)和2,3-二氫噻吩并[3,4-b][1,4]二噁烷-2-羧酸(EDOT-COOH)的溶液接觸，所述聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)無規(guī)共聚物具有式I：

其中，各R為–OH，并且，x和y各自為從約1到約1000的整數(shù)，其中x和y之和為約2到約1000的整數(shù)；并且在足以將生物識別部分共價(jià)結(jié)合至PEDOT無規(guī)共聚物的條件下，將水凝膠與生物識別部分接觸，從而形成式I的PEDOT無規(guī)共聚物，其中至少一個(gè)R為選自下組的生物識別部分：肽、抗體、和適體，從而制備本發(fā)明的導(dǎo)電水凝膠。

所述聚乙二醇-二丙烯酸酯可以是具有下式的任何適當(dāng)?shù)木垡叶?二丙烯酸酯：

所述聚乙二醇-二丙烯酸酯的聚乙二醇部分可具有任意適當(dāng)?shù)娜缟纤龅姆肿恿?。在一些?shí)施方式中，所述聚乙二醇-二丙烯酸酯具有從約1000Da至約10,000Da的分子量。在一些實(shí)施方式中，所述聚乙二醇-二丙烯酸酯具有約6000Da的分子量。

所述聚乙二醇水凝膠可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行制備。例如，采用適當(dāng)?shù)目删酆匣鶊F(tuán)可在一端或兩端官能化PEG。適當(dāng)?shù)目删酆匣鶊F(tuán)包括但不限于，丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、苯乙烯、氰基丙烯酸酯及其他。聚乙二醇水凝膠的聚合可在自由基聚合、或酸或堿聚合條件下進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所述聚合反應(yīng)在自由基聚合條件下進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，所述形成聚乙二醇水凝膠的聚合條件包括照射聚乙二醇-二丙烯酸酯。

當(dāng)用光引發(fā)劑照射聚乙二醇-二丙烯酸酯來制備聚乙二醇水凝膠時(shí)，所述照射可在各種條件下進(jìn)行。例如，可照射所述聚乙二醇水凝膠從1秒至超過1分鐘，包括2、3、4、5、10、15、20、30、40和50秒。本發(fā)明也可考慮照射更長時(shí)間。照射的波長和強(qiáng)度取決于使用的光引發(fā)劑、光引發(fā)劑濃度和聚乙二醇水凝膠中期望交聯(lián)的程度。

所述光引發(fā)劑可以是本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)墓庖l(fā)劑。例如，所述光引發(fā)劑可以是偶氮二異丁腈、苯甲酰過氧化氫、樟腦醌、或1-[4-(2-羥乙氧基)-苯基]-2-羥基-2-甲基-1-丙基-1-酮(2959，來自汽巴(Ciba))。

所述導(dǎo)電聚合物可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行聚合，例如電聚合。如上所討論的，所述導(dǎo)電聚合物可以是單聚合物或共聚物。代表性的聚合物包括聚噻吩、聚吡咯和聚苯撐(polyphenylenes)。當(dāng)所述導(dǎo)電聚合物為聚噻吩基聚合物時(shí)，可以使用任何適當(dāng)?shù)泥绶曰鶈误w。代表性的噻吩單體包括但不限于，噻吩、3-甲基噻吩、3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)、和2,3-二氫噻吩并[3,4-b][1,4]二噁烷-2-羧酸(EDOT-COOH)。所述EDOT-COOH單體包括可用生物識別部分官能化的羧酸官能團(tuán)。

在一些實(shí)施方式中，所述導(dǎo)電聚合物為聚噻吩聚合物。在一些實(shí)施方式中，所述導(dǎo)電聚合物為PEDOT共聚物。當(dāng)所述導(dǎo)電聚合物為PEDOT共聚物時(shí)，所述EDOT和EDOT-COOH單體可以任意適當(dāng)?shù)娜缟纤龅谋壤嬖?。在一些?shí)施方式中，所述EDOT和EDOT-COOH以從約10:1至約1:10的比例存在。在一些實(shí)施方式中，所述EDOT和EDOT-COOH以約1:4的比例存在。

導(dǎo)電聚合物可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法用生物識別部分進(jìn)行修飾。例如，當(dāng)所述導(dǎo)電聚合物為使用EDOT-COOH的PEDOT共聚物時(shí)，所述生物識別部分可采用酰胺形成化學(xué)(amide formation chemistry)連接到PEDOT共聚物?；钚怎サ闹苽洌缤ㄟ^EDC化學(xué)，是公知的并且可用于本發(fā)明中。

所述生物識別部分可以是如上所述任何適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分為抗體。在一些實(shí)施方式中，所述生物識別部分為適體。

VII.實(shí)施例

實(shí)施例1：制備PEDOT-聚乙二醇水凝膠

為了開發(fā)免疫傳感器，我們構(gòu)建了一種新穎的復(fù)合型導(dǎo)電水凝膠，其包括導(dǎo)電的羧基官能化PEDOT和高分子量PEG。羧基官能化提供生物偶聯(lián)能力。通過在微型化金電極的頂端聚合PEG，隨后使用水性微乳液將PEDOT共聚物電聚合到多孔PEG凝膠中來制備生物界面。所述PEDOT/PEG共聚物是組分可調(diào)的(compositionally tunable)，并且其在電極表面陣列上的沉積是可控的。位于導(dǎo)電聚合物鏈上的COOH基團(tuán)通過活性酯基團(tuán)用B-IFN-γ抗體調(diào)整(tailored)。固定有抗體的導(dǎo)電水凝膠電極用于對緩沖液和牛血漿中的B-IFN-γ進(jìn)行無標(biāo)記電化學(xué)檢測。B-IFN-γ至抗體的結(jié)合由于電子傳遞障礙而導(dǎo)致電化學(xué)信號降低。這種關(guān)閉信號(signal-off)的傳感方法不需要任何外部的氧化還原標(biāo)記用于檢測。

制造傳感表面的過程開始于在電極頂端光聚合聚乙二醇水凝膠。隨后，PEDOT共聚物在聚乙二醇水凝膠內(nèi)電聚合。由于其固有特性，沉積有導(dǎo)電水凝膠的電極在被氧化時(shí)呈現(xiàn)出微弱的藍(lán)光，而還原時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色(圖7A)。使用掃描電子顯微鏡法(SEM)研究導(dǎo)電聚合物和導(dǎo)電水凝膠表面的形態(tài)學(xué)特征。如從SEM圖像所見(圖7B)，PEDOT在金電極上的沉積表現(xiàn)出粗顆粒形態(tài)，紫外線聚合的聚乙二醇水凝膠表現(xiàn)出多孔形態(tài)。PEDOT在PEG內(nèi)的電聚合填充了PEG內(nèi)的孔。金表面上單獨(dú)的PEDOT聚合反應(yīng)受到機(jī)械性能差的影響。

重要的是，凝膠內(nèi)的PEDOT分子在施加電壓時(shí)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并具有特征性的氧化還原峰。未摻入和摻入了導(dǎo)電性PEDOT的聚乙二醇水凝膠的循環(huán)伏安曲線顯示出比常規(guī)聚乙二醇水凝膠增強(qiáng)的導(dǎo)電水凝膠電性能(圖10A)。PEG中導(dǎo)電聚合物的摻入表現(xiàn)出了更強(qiáng)的氧化還原電流值，增強(qiáng)近100倍。PEDOT強(qiáng)烈的固有的氧化還原特性進(jìn)一步用于生物傳感應(yīng)用。PEDOT/聚乙二醇水凝膠與PEDOT表現(xiàn)出類似的CV特性，這證明了PEG沒有影響PEDOT的電化學(xué)行為(圖10B)。

通過改變電聚合反應(yīng)施加的電荷來優(yōu)化PEDOT在PEG凝膠內(nèi)的沉積。如從作為沉積電荷的函數(shù)的氧化還原行為的數(shù)據(jù)可以看出，我們可以確認(rèn)，電荷8×10^-4C時(shí)氧化還原性能增強(qiáng)，而較低和較高的電荷(或PEDOT膜的厚度)導(dǎo)致差的氧化還原峰和還原電流(圖13A-13D)。

PBS中的預(yù)聚物聚乙二醇水凝膠溶液、5％聚乙二醇-二丙烯酸酯和1％光引發(fā)劑(Irgacure 2959)涂覆在圖形化玻片的金電極上。這些玻片通過電極頂部的定位光掩模暴露于紫外輻射(60mJ/cm²)5秒鐘。在圖形化金電極頂部的制備的聚乙二醇水凝膠然后在10mM的EDOT-COOH水溶液(含有2.5mM EDOT、0.05MSDS和0.1M LiClO₄)中以用于電聚合反應(yīng)的分批次方式孵育。使用CHI 6044d電化學(xué)分析儀(CH Instruments,Inc.奧斯汀，德克薩斯)，在恒定的1.1V電壓下，以電流測量方式(amperometrically)將該單體溶液電聚合到多孔聚乙二醇水凝膠中。所得聚合物在施加8×10^-4C電荷至聚合物膜時(shí)具有增強(qiáng)的氧化還原性能。

抗體通過PEDOT上存在的羧基基團(tuán)而共價(jià)連接。活化羧基以共價(jià)固定抗體。導(dǎo)電聚合物水凝膠陣列用在去離子水中的0.2mM EDC和0.05mM NHS孵育15分鐘。所述陣列用PBS漂洗，并在4℃用PBS中的50μg/mL牛INF-γ抗體孵育過夜。使用CHI儀器在導(dǎo)電聚合物水凝膠陣列上進(jìn)行電化學(xué)檢測。使用循環(huán)伏安法在-0.7V和0.4V的范圍內(nèi)檢測牛INF-γ的結(jié)合。每次測量中在-0.35V測量峰值電流(I_p)，將信號作為濃度相對電流值的函數(shù)做圖。

為了固定B-IFN-γ抗體分子，存在于導(dǎo)電聚合物上的COOH基團(tuán)用標(biāo)準(zhǔn)EDC-NHS化學(xué)激活。在1.1V電壓，保持恒定電荷8×10^-4C，使EDOT-COOH和EDOT在含十二烷基硫酸鈉(SDS)的LiClO₄水溶液中的混合物以電流測量方式聚合在PEG水凝膠層中。該方法得到了在聚乙二醇水凝膠內(nèi)的相互連接的聚合物結(jié)構(gòu)。COOH基團(tuán)的數(shù)目通過甲苯胺藍(lán)O(TBO)染色定量。^[24-25]得到在633nm處的COOH基團(tuán)TBO吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖14A-14B)。COOH基團(tuán)的密度估計(jì)為3.6×10¹⁶分子/cm²，這比裸金表面上電化學(xué)沉積的PEDOT-COOH/PEDOT中得到的COOH值(1.7×10¹⁶分子/cm²)約高兩倍。

使用EDC-NHS，將抗-牛IFN-γ抗體共價(jià)固定在導(dǎo)電聚合物水凝膠內(nèi)的羧化PEDOT鏈上。使用循環(huán)伏安法在PBS中研究固定有抗體的導(dǎo)電聚合物水凝膠的響應(yīng)性。這種高導(dǎo)電性水凝膠基質(zhì)甚至在PBS中都有響應(yīng)，沒必要使用外部的氧化還原指示劑。固定有抗體的導(dǎo)電聚合物水凝膠的表面用不同濃度的重組B-IFN-γ激發(fā)，并記錄循環(huán)伏安曲線。含抗體的凝膠對B-IFN-γ的捕獲阻礙了電子通過聚合物鏈傳遞，并引起氧化還原峰下降(圖11C)。PEDOT還原峰響應(yīng)于不同濃度的B-IFN-γ(而產(chǎn)生)的下降形成了該分析物電化學(xué)傳感的基礎(chǔ)。

我們獲得了重組B-IFN-γ濃度vs.電極上抗體官能化的導(dǎo)電水凝膠的還原電流的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖11D)。我們相信，電化學(xué)絕緣的靶分子與抗體官能化的PEDOT鏈的結(jié)合阻礙了電荷轉(zhuǎn)移性能和PEDOT的導(dǎo)電性，這導(dǎo)致了還原電流的抑制。此外，在ITO電極上進(jìn)行了夾心法分析以使固定化的B-IFN-γ圖像化。所述電極隨后用重組B-IFN-γ孵育，之后用生物素化的二次抗體和熒光團(tuán)偶聯(lián)的鏈霉親和素孵育。使用熒光顯微鏡檢測熒光。用熒光素標(biāo)記的抗體孵育顯示了重組B-IFN-γ和固定了抗體的導(dǎo)電水凝膠的結(jié)合(圖15A：熒光圖像)。

實(shí)施例2：制備傳感器

如先前報(bào)道，使用照相平印術(shù)(photolithography)和濕法刻蝕方法制備金和ITO圖形化電極。微圖案化玻璃片(包括金表面頂部的光阻材料)用氧等離子體處理10分鐘，并在氮?dú)鈿夥障拢?3-丙烯酰氧基丙基)三氯甲硅烷在甲苯中的0.05％的溶液中孵育約1小時(shí)，以獲得玻璃區(qū)的硅烷自組裝單分子層。該過程在下面進(jìn)行更詳細(xì)的描述。

正性抗蝕劑(S1813)旋轉(zhuǎn)涂布(2000轉(zhuǎn)，30秒)于用15nm鉻黏附層和100nm金層涂覆的玻璃片上，導(dǎo)致形成光阻材料厚層。光阻材料涂布的玻璃片在熱板上115℃軟化烘烤1分鐘，然后放置與光掩模接觸，并暴露在365nm紫外光源下。所述底板然后放入顯影液中(MF319)。顯影步驟之后，金涂覆的玻璃片浸于金蝕刻液中，隨后浸于鉻蝕刻液中。從不受光阻材料保護(hù)的區(qū)域中選擇性地除去金屬，形成直徑為1500μm的金微圖形。重要的是，蝕刻后不馬上除去金微電極頂部的光阻材料層，而是在硅烷改性方法過程中將其用于保護(hù)底層的金區(qū)域，從而不喪失導(dǎo)電性。

帶有光阻材料涂覆的金電極的底板用(3-丙烯酰氧基丙基)三氯甲硅烷修飾。硅烷修飾后，在丙酮中對底板進(jìn)行超聲處理以除去光阻材料。

然后在電極頂部制備實(shí)施例1中描述的包含PEDOT-聚乙二醇水凝膠的納米多孔膜，并且納米多孔膜附著到底板上。然后，還是進(jìn)行實(shí)施例1的過程，將生物識別部分附著到PEDOT-聚乙二醇水凝膠。

實(shí)施例3：肺結(jié)核檢測

將抗體(牛-IFN-γ)官能化的PEDOT導(dǎo)電水凝膠置于實(shí)施例2設(shè)置的電化學(xué)孔中。將在1X PBS中制備的不同濃度的靶物質(zhì)(重組干擾素γ)引入電化學(xué)孔中，孵育約20分鐘。記錄循環(huán)伏安曲線。

如圖8A所示，每個(gè)感應(yīng)電極(金微電極上的抗體官能化的導(dǎo)電水凝膠)通過金接觸墊連接至穩(wěn)壓器。以這種方式，每個(gè)感應(yīng)電極分別通過穩(wěn)壓器尋址(addressed)。

感測晶片上具有導(dǎo)電凝膠的金電極為工作電極，并且分別通過穩(wěn)壓器尋址。我們使用了外部Ag/AgCl參考電極和鉑絲反電極。這些分別浸在如圖所示設(shè)置的電化學(xué)孔中的電解質(zhì)溶液中，并連接到穩(wěn)壓器。

為了測試導(dǎo)電水凝膠生物電極的特異性，所述傳感器用非特異性細(xì)胞因子和蛋白(包括TGF-β、IL-6、TNF-α和IgG)激發(fā)。我們觀察到對于非特異性細(xì)胞因子(圖11A)和人IFN-γ(圖11B)極小的信號下降。這個(gè)結(jié)果表明，我們的傳感器可檢測到非特異性細(xì)胞因子混合物中的B-IFN-γ。為了證明我們的傳感器對細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)的可行性，我們想要檢測含血清培養(yǎng)基和全血中的信號響應(yīng)。如圖11C所示，與單獨(dú)RPMI培養(yǎng)基相比，添加全血造成了可忽略的信號損失。固定了抗體的導(dǎo)電水凝膠傳感器用已知的B-IFN-γ激發(fā)，該B-IFN-γ(1:1)摻入到不含TB的牛血/PBS中(圖16A-16B)。牛血的加入與PBS相比，產(chǎn)生了～20％的信號損失，然而，盡管有信號損失，加入系列濃度的B-IFN-γ后仍然檢測到變化。使用從牛血樣本中純化的牛血漿樣本，我們比較了我們的導(dǎo)電聚合物水凝膠與ELISA方法的結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)了ELISA結(jié)果和電化學(xué)信號間的關(guān)聯(lián)(圖11D)。對于從牛血細(xì)胞中釋放的B-IFN-γ的實(shí)時(shí)監(jiān)測，固定了抗體的導(dǎo)電水凝膠用牛外周血單核細(xì)胞(PBMCs)進(jìn)行激發(fā)。在促有絲分裂刺激下，發(fā)現(xiàn)了電化學(xué)電流的改變(圖11E)。作為對照，所述電流在有受刺激的細(xì)胞、缺乏抗體的導(dǎo)電水凝膠或固定有抗體的、細(xì)胞未受刺激的導(dǎo)電水凝膠上沒有變化。因此，在本研究中，我們可以確認(rèn)我們的傳感器對B-IFN-γ有特異性和響應(yīng)性。

盡管為清晰理解的目的，已通過說明和實(shí)施例描述了前述發(fā)明的一些細(xì)節(jié)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，某些變化和修改可在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)實(shí)施。此外，本文提供的各參考文獻(xiàn)通過引用全文納入本文，就好像每篇參考文獻(xiàn)單獨(dú)通過引用納入的程度一樣。本申請與本文提供的參考文獻(xiàn)之間存在沖突時(shí)，以本申請為準(zhǔn)。