本發(fā)明涉及一種可與光學(xué)顯微鏡一起使用的溶液，特別涉及一種可令生物材料(例如，動(dòng)物組織或器官、或是生物工程膠原蛋白支架)變成透明的組織透明溶液。

背景技術(shù)：

雖然在圖像處理時(shí)，可使用熒光追蹤劑或重組熒光蛋白來(lái)標(biāo)定細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的次級(jí)結(jié)構(gòu)，但由于組織本身不透光，因此僅能擷取有限深度的組織影像。組織不透光性也是生物工程領(lǐng)域中一項(xiàng)為人關(guān)注的議題。組織工程中會(huì)大量使用諸如膠原蛋白支架這類的生物工程材料，來(lái)進(jìn)行傷口重建或愈合。但是，膠原蛋白支架一般是不透光的，這也使得若要搭配使用光學(xué)顯微鏡于活體外檢視這些膠原蛋白支架及其他可能與這些膠原蛋白支架反應(yīng)的大分子和/或細(xì)胞時(shí)，變得不容易。傳統(tǒng)上會(huì)將厚度大的樣本切成薄片，以便以肉眼或儀器檢視組織內(nèi)各目標(biāo)分子。之后，再透過(guò)3D方式重建影像，并從中獲取相關(guān)信息。但是，這種重建過(guò)程往往效率不彰且結(jié)果不夠精確。因此過(guò)去十年間發(fā)展出幾種能夠讓生物材料變成肉眼「可看透(see-through)」的試劑，包括江安世所發(fā)明的FocusClear溶液(參見(jiàn)美國(guó)專利6,472,616 B1)、Miyawaki等人所發(fā)明的SCALEVIEW-A2溶液(參見(jiàn)美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)20130045503A1)，鐘等人所發(fā)明的CLARITY技術(shù)(Nature(2013)497,332-337)和Hans-Urich Dodt等人所發(fā)明的苯甲醇-苯甲酸苯甲酯(BABB)溶液(Nature Methods(2007)4(4),331-336)。所有上述這些溶液或技術(shù)，在組織變成透明后都還能保存重組熒光蛋白的訊號(hào)，因此能有效地改善可擷取組織3D影像的深度。然而，上述這些溶液或技術(shù)仍有缺點(diǎn)。舉例來(lái)說(shuō)，F(xiàn)ocusClear溶液會(huì)讓生物樣本體積縮小，且無(wú)法有效地讓深度超過(guò)0.5微米的組織變成透明。SCALEVIEW-A2溶液則需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，如從數(shù)周到數(shù)月，才能讓組織透明；同時(shí)還會(huì)讓組織體積膨脹，使得樣本結(jié)構(gòu)變得極端脆弱。此外，SCALEVIEW-A2溶液也無(wú)法讓微小組織，例如昆蟲(chóng)腦部，變成透明。至于BABB溶液，則是會(huì)造成不可逆的組織萎縮，再者，由于BABB仰賴有機(jī)溶劑，因此也會(huì)讓傳統(tǒng)免疫熒光化學(xué)反應(yīng)、傳統(tǒng)親脂性碳氰染料或熒光追蹤劑(如霍亂毒素次單元B)中的熒光訊號(hào)被淬熄。至于CLARITY技術(shù)本身則繁瑣耗時(shí)，費(fèi)時(shí)數(shù)天至數(shù)周，還需要特制的設(shè)備(例如，電泳式組織透明設(shè)備)，方能讓組織透明化。由于電泳式組織透明設(shè)備會(huì)將大部分細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層移除，因此，CLARITY技術(shù)的主要缺點(diǎn)是無(wú)法觀察到樣品完整的結(jié)構(gòu)外貌。此外，CLARITY技術(shù)也無(wú)法讓諸如膠原蛋白支架這種生物材料變成透明。尤有甚者，因CLARITY技術(shù)涉及使用丙酰胺這類已知具致癌及強(qiáng)力神經(jīng)毒性的有毒成分，因此會(huì)伴隨著有毒廢棄物的生成。

本發(fā)明目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，并提供一種新穎的組織透明試劑，其可迅速令組織器官及生物材料透明，且使用上安全、便利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明內(nèi)容至少部分是基于意外發(fā)現(xiàn)由特定物質(zhì)所組成的溶液，可令生物材料(例如，哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)的組織或器官，或是生物工程材料(例如，膠原蛋白支架))變成透明，因此可讓原先已使用染料或熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)定的生物材料，在組織透明化后仍可被追蹤。

基于上述，本發(fā)明目的之一是提供一種可令生物材料變成透明的新穎溶液。此溶液的特征在于包含：

一具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一活性化合物

一具有式(II)結(jié)構(gòu)的第二活性化合物

或所述具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一活性化合物和所述具有式(II)結(jié)構(gòu)的第二活性化合物的組合；

一足夠量的溶劑，以使該第一或第二活性化合物溶解于其中并形成該溶液；

其中：

R₁、R₂、R₃、R₄及R₈分別是氫或具有至少兩個(gè)羥基取代基的C_1-6烷基；

R₅是有或無(wú)至少一個(gè)羥基-取代基的C_1-3烷基或-CH₂OCH₃；

R₆及R₇分別是乙酰基或C_1-3烷基；

X₁、X₂及X₃分別是一鹵素，選自由氯、溴和碘組成的群組中；

Y是具有至少一個(gè)羥基取代基的C_1-3烷基或

該溶液的pH值小于11；且

該溶液的滲透壓介于200至3,500mOSm/L間，此處的mOSm為毫滲透摩爾，簡(jiǎn)稱毫滲，為滲透壓?jiǎn)挝弧?/p>

較佳是，該溶液的pH值小于11；且該溶液的滲透壓介于250至1,000mOSm/L間。

依據(jù)特定實(shí)施方式，上述具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一活性化合物可以是以下任一種：

依據(jù)其他特定實(shí)施方式，上述具有式(II)結(jié)構(gòu)的第一活性化合物可以是以下任一種：

較佳是，上述具有式(I)或(II)結(jié)構(gòu)的第一或第二活性化合物在該溶液中的濃度至少為10％(w/v)。

該溶液還可非必要的包含一種抗凍劑或是保濕劑。所述抗凍劑可以是糖、甘油或二甲基亞砜(DMSO)，且其在在該溶液中的濃度介于5％至30％(w/v)間。較佳是，當(dāng)組織表面具有角蛋白時(shí)，所述抗凍劑是DMSO。保濕劑可以是玻尿酸或多元醇，且其在在該溶液中的濃度介于5％至30％(w/v)間。

本發(fā)明內(nèi)容也涵蓋一種能夠可逆式地令生物材料變透明的方法。所述方法包含以下步驟：以上述本發(fā)明溶液來(lái)處理該生物材料一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以使該生物材料變成透明。所述生物材料可以是哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)的組織或器官，或是一種以生物工程方式生產(chǎn)的膠原蛋白支架。所述生物材料原先已以染料或熒光蛋白之類的影像追蹤物進(jìn)行標(biāo)定，使得在組織透明化后仍可于光學(xué)顯微鏡下追蹤該生物材料上的影像追蹤物。

下述附隨圖示繪示出本發(fā)明內(nèi)容的一或多種實(shí)施方式。本發(fā)明內(nèi)容的其他特征或優(yōu)點(diǎn)可由發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明中得知。

須知以上的說(shuō)明和以下的詳細(xì)說(shuō)明及圖示均為例示，用以闡述本發(fā)明概念，并非用以限制本發(fā)明范疇。

附圖說(shuō)明

下述圖示為本說(shuō)明書(shū)的一部份，且用以進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明內(nèi)容的某些實(shí)施例，在參照本說(shuō)明書(shū)所示的特定實(shí)施方式并根據(jù)該些圖示說(shuō)明，將使本發(fā)明更明顯易懂。

圖1為各種生物材料依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容一特定實(shí)施方式處理后的照片，包括小鼠的腦、心臟、小腸、肝臟、肺臟、胰臟、胃和耳朵，蒼蠅頭部以及膠原蛋白膜；

圖2為依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容一特定實(shí)施方式，先以凝集素-Alexa Fluor 488和碘化丙碇標(biāo)定，再施以透明處理的小鼠小腸的共軛焦照片；

圖3是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容一特定實(shí)施方式，先以DilC₁₈(3)標(biāo)定，再施以透明處理的小鼠腦部的共軛焦照片；

圖4為是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容一特定實(shí)施方式，先以酪胺酸羥基酶(TH)-Gal4標(biāo)定，再施以透明處理，接著以抗-TH抗體進(jìn)行免疫染色的蒼蠅腦部的共軛焦照片；

圖5是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容一特定實(shí)施方式，讓小鼠腦部自透明處理中恢復(fù)后的照片；

圖6是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容一特定實(shí)施方式，分別以本發(fā)明溶液、FocusClear溶液、SCALEVIEW-A2溶液或BABB溶液處理后的小鼠腦部體積變化的照片；及

圖7是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容一特定實(shí)施方式，分別以本發(fā)明溶液、FocusClear溶液、SCALEVIEW-A2溶液或BABB溶液處理后的小鼠腦部組織透明化的時(shí)間線圖。

具體實(shí)施方式

下述伴隨圖式的說(shuō)明的目的在于說(shuō)明本發(fā)明內(nèi)容，并非用以將本發(fā)明限于特定實(shí)施方式。

本發(fā)明內(nèi)容大致是關(guān)于由特定物質(zhì)所組成的溶液，可令生物材料(例如，哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)的組織或器官，或是生物工程材料(例如，膠原蛋白支架))變成透明，因此可讓原先已使用染料或熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)定的生物材料，在組織透明化后仍可被追蹤。

基于上述，本發(fā)明目的之一是提供一種可令生物材料變成透明的新穎溶液。此溶液的特征在于包含：

一具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一活性化合物

一具有式(II)結(jié)構(gòu)的第二活性化合物

或所述一具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一活性化合物和所述一具有式(II)結(jié)構(gòu)的第二活性化合物的組合；

一足夠量的溶劑，以使該第一或第二活性化合物溶解于其中并形成該溶液；

其中：

R₁、R₂、R₃、R₄及R₈分別是氫或具有至少兩個(gè)羥基取代基的C_1-6烷基；

R₅是有或無(wú)至少一個(gè)羥基-取代基的C_1-3烷基或是-CH₂OCH₃；

R₆及R₇分別是乙?；駽_1-3烷基；

X₁、X₂及X₃分別是一鹵素，選自由氯、溴和碘組成的群組中；

Y是具有至少一個(gè)羥基取代基的C_1-3烷基或是

該溶液的pH值小于11；且

該溶液的滲透壓介于200至3,500mOSm/L間。

除非另作說(shuō)明，否則「烷基」一詞在此是指具有1-20個(gè)碳原子(例如，1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1)的直鏈或支鏈碳?xì)浠衔?。具?-4個(gè)碳原子的烷基稱為「低碳數(shù)烷基」。烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正-丁基、第三-丁基、異丁基、2-異丙基-3-甲基丁基、戊基、戊烷-2-基、己基、異己基、庚基、庚烷-2-基、4,4-二甲基戊基、辛基、2,2,4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。除非另作說(shuō)明，否則每一烷基都可非必要的包含有取代基，也就是說(shuō)每一烷基可以有(有取代基的烷基)或無(wú)(沒(méi)有取代基的烷基)一或多個(gè)取代基。當(dāng)以「有取代基的」一詞來(lái)描述一個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)或基團(tuán)時(shí)，意思是指該化學(xué)結(jié)構(gòu)或基團(tuán)上的氫原子被另外一個(gè)原子、化學(xué)結(jié)構(gòu)或官能基所替代，這些官能基包括但不限于，羥基、醛基、烷氧基、烷基(如甲基、乙基、丙基、異丙基、正-丁基、第三-丁基等)、鹵素、-CH₂OCH₃-或是

依據(jù)一特定實(shí)施方式，上述具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一活性化合物可以是以下任一種：

依據(jù)其他特定實(shí)施方式，上述具有式(II)結(jié)構(gòu)的第一活性化合物可以是以下任一種：

本發(fā)明溶液可透過(guò)以下方式制備：將具有式(I)或(II)結(jié)構(gòu)的第一或第二活性化合物或其二者的組合與足夠量的溶劑(如，水或鹽溶液(如，生理食鹽水、PBS、HBSS等))混合，并攪拌至每一化合物完全溶解于該溶劑中為止。具有式(I)或(II)結(jié)構(gòu)的第一或第二活性化合物或其二者的組合在溶液中的用量，端視所欲處理的生物材料的厚度而定。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于厚度較低的生物材料來(lái)說(shuō)，所需該具有式(I)或(II)結(jié)構(gòu)的第一或第二活性化合物或其二者的組合的用量會(huì)較少，反之，若生物材料的厚度較高，就須增加該具有式(I)或(II)結(jié)構(gòu)的第一或第二活性化合物或其二者的組合的用量。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明溶液所能處理生物材料的厚度高達(dá)5毫米，且具有式(I)或(II)結(jié)構(gòu)的第一或第二活性化合物在該溶液中的濃度較佳是至少為10％(w/v)。一旦該具有式(I)或(II)結(jié)構(gòu)的第一或第二活性化合物或其二者的組合已完全溶解于溶劑中后，即可調(diào)整其pH值與滲透壓。本發(fā)明溶液的pH值較佳是小于11，例如10、9、8、7、6或5；更佳是小于9，例如8、7、6或5；最佳是介于6至9之間。本發(fā)明溶液的滲透壓較佳是介于200至3,500mOSm/L間；更佳是介于220至2,000mOSm/L間；最佳是介于250至1,000mOSm/L間。

本發(fā)明溶液還可非必要的包含一種抗凍劑或是保濕劑。所述抗凍劑可以是糖(如，葡萄糖、果糖、海藻糖或蔗糖)、甘油或二甲基亞砜(DMSO)，且其在在該溶液中的濃度介于5％至30％(w/v)間。較佳是，當(dāng)組織表面具有角蛋白時(shí)，所述抗凍劑是DMSO。保濕劑可以是玻尿酸或多元醇(例如，三元醇、甘油或山梨醇)，且其在在該溶液中的濃度介于5％至30％(w/v)間。

本發(fā)明內(nèi)容也涵蓋一種能夠讓生物材料變透明的方法。所述方法包含以下步驟：以上述本發(fā)明溶液來(lái)處理該生物材料一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間，例如至少0.1、0.5、1、2、3、4、5或6小時(shí)，較佳是至少0.5、1、2、3、4、5、6或7天，以使該生物材料變成透明。所述生物材料可以是植物或動(dòng)物的組織或器官，較佳是動(dòng)物的組織或器官，例如昆蟲(chóng)、魚(yú)、兩棲動(dòng)物、鳥(niǎo)、和哺乳動(dòng)物；更佳是哺乳動(dòng)物的組織或器官。所述哺乳動(dòng)物包括，但不限于，諸如小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠和除人類以外的靈長(zhǎng)類等實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物；諸如狗、貓類的寵物動(dòng)物；諸如牛、馬、羊等農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物；和人類。較佳是來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或器官。依據(jù)本發(fā)明一特定實(shí)施方式，所述生物材料是小鼠的腦、心臟、小腸、肝臟、肺臟、胰臟、胃和耳朵，蒼蠅頭部或是以生物工程方式制造的膠原蛋白膜。

所述生物材料在透明化處理前可先以染料(如，碘化丙碇或長(zhǎng)鏈脂肪性碳氰化物染料)、熒光蛋白(如，酪胺酸羥基酶(TH)-Gal4)或抗體(如，抗酪胺酸羥基酶抗體)之類的影像追蹤物進(jìn)行標(biāo)定，使得當(dāng)該生物材料被施以本發(fā)明的透明化處理后，仍可于光學(xué)顯微鏡下追蹤該生物材料上的該影像追蹤物。本發(fā)明的透明化處理較佳是在室溫(約25℃)至約50℃的溫度下實(shí)施。

此外，本發(fā)明的透明化處理乃是一種可逆式過(guò)程，代表當(dāng)經(jīng)過(guò)本發(fā)明的透明處理而變成透明的生物材料(也即，經(jīng)過(guò)本發(fā)明溶液處理一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間而變成透明的生物材料)，被浸泡在適當(dāng)緩沖溶液中一段時(shí)間，使得原先被吸附或包埋在生物材料中的該具有式(I)或(II)結(jié)構(gòu)的第一或第二活性化合物或其二者的組合被釋出到緩沖溶液中，后將可再次恢復(fù)到原先不透明的狀態(tài)。可達(dá)成這種恢復(fù)不透明狀態(tài)的緩沖液或鹽溶液包括任何一種具平衡濃度的鹽溶液(如，PBS、HBSS或TBS)、人工腦脊髓液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)、和細(xì)胞培育基質(zhì)(例如，非必要胺基酸溶液(MEM)、Dulbecco氏DMEM、和Ham氏F-12)。在一較佳實(shí)施方式中，將一透明生物材料(如，小鼠的小腸)浸泡在PBS溶液中約1小時(shí)后，該生物材料即又恢復(fù)到原先不透明狀態(tài)。此外，以本發(fā)明溶液進(jìn)行透明處理，并不會(huì)讓生物材料中的蛋白質(zhì)失去其抗原性質(zhì)，意思是說(shuō)變成透明的生物材料中的蛋白質(zhì)在經(jīng)過(guò)恢復(fù)過(guò)程后，會(huì)再度恢復(fù)到其未經(jīng)透明處理前的狀態(tài)。

盡管此處采用約略的數(shù)值來(lái)界定本發(fā)明較寬范圍的數(shù)值范圍與參數(shù)，但已盡可能精確地記載特定實(shí)驗(yàn)例中的數(shù)值。然而，任何數(shù)值不可避免地包含了因?yàn)閭€(gè)別試驗(yàn)、測(cè)量方法中可能會(huì)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差所導(dǎo)致的誤差。此外，本文所述的「約(about)」一詞通常系指實(shí)際數(shù)值在一特定數(shù)值或范圍的正負(fù)10％、5％、1％或0.5％之內(nèi)?；蛘呤牵讣s」一詞代表實(shí)際數(shù)值落在平均值的可接受標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)，視本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者的考慮而定。除了實(shí)驗(yàn)例之外，或除非另有明確的說(shuō)明，當(dāng)可理解此處所用的所有范圍、數(shù)量、數(shù)值與百分比(例如用以描述材料用量、時(shí)間長(zhǎng)短、溫度、操作條件、數(shù)量比例及其他相似者)均經(jīng)過(guò)「約」的修飾。因此，除非另有相反的說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)與附隨申請(qǐng)專利范圍所揭示的數(shù)值參數(shù)皆為約略的數(shù)值，且可視需求而更動(dòng)。至少應(yīng)將這些數(shù)值參數(shù)理解為所指出的有效位數(shù)與套用一般進(jìn)位法所得到的數(shù)值。

除非另有所指，否則此處及附隨的申請(qǐng)專利范圍所用之「一(“a”或”an”)」及「該(“the”)」皆包含其復(fù)數(shù)形式。

以下將透過(guò)實(shí)驗(yàn)例說(shuō)明本發(fā)明內(nèi)容，該些實(shí)驗(yàn)例僅為了闡述本發(fā)明，而非用以限定本揭示內(nèi)容的范圍。本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的技術(shù)特征可以任何形式加以組合應(yīng)用。各技術(shù)特征可以能用以達(dá)到相同、相等或相似的替代方法加以替換。

實(shí)施例

材料與方法

透明處理

先以內(nèi)含4％多聚甲醛的冰冷的磷酸緩沖液(PBS,pH7.4)來(lái)處理待測(cè)者(如，來(lái)自昆蟲(chóng)或小鼠)，使其被系統(tǒng)性地固定。接著，以適當(dāng)工具小心地從待測(cè)者身上將想要進(jìn)行透明處理的組織或器官，例如腦、心臟、胃臟、胰臟、小腸、肝臟、肺臟、耳朵或頭部等(以下稱為「樣本」)取出，并浸泡在上述冰冷的固定液中，同時(shí)在4℃下于震蕩器上輕輕地?fù)u晃隔夜。接下來(lái)，在1小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，于室溫下以內(nèi)含0.5％Triton X-100的磷酸緩沖液(PBST)清洗樣本3次，整個(gè)充滿清洗過(guò)程都是在震蕩器上進(jìn)行，并輕輕地?fù)u晃樣本。進(jìn)行透明處理時(shí)，先將樣本轉(zhuǎn)移到充滿實(shí)施例1的透明處理溶液的工作隔室中，并將樣本浸泡在其中。接著，以紙巾或蓋玻片覆蓋工作隔室，使得工作隔室中的溶液不會(huì)揮發(fā)至干，同時(shí)須避光。接著，將工作隔室放置在震蕩器上，并于35℃下輕輕地?fù)u晃2-12小時(shí)(時(shí)間長(zhǎng)短端視樣本的厚度而定)，直到樣本變成透明為止。接著，在工作隔室中加入新鮮的透明處理溶液，并以Neo-Mount(Merck)將工作隔室密封，等待1小時(shí)后即可放在顯微鏡下觀察。

實(shí)施例1制備本發(fā)明的組織透明溶液

本發(fā)明可令組織透明的溶液是依據(jù)表1所示配方，在室溫下將各組成分于溶劑中混合溶解后而制成。

表1組織透明溶液配方

實(shí)施例2經(jīng)過(guò)實(shí)施例1的組織透明溶液處理后的各生物材料的顯微影像

2.1本發(fā)明溶液可使源自嚙齒動(dòng)物或昆蟲(chóng)的組織或器官透明化

依據(jù)材料與方法中揭示「透明處理」的步驟，將小鼠的腦、心臟、胃臟、胰臟、小腸、肝臟、肺臟、和耳朵、蒼蠅頭部，和以生物工程方式制成的膠原蛋白支架分別浸泡在實(shí)施例1的配方2溶液中，使變成透明。結(jié)果示于第1圖的照片中。如第1圖的照片所示，實(shí)施例1揭示溶液確實(shí)可有效地使源自小鼠或昆蟲(chóng)的組織或器官，或是膠原蛋白支架變成透明。

2.2透明化處理不會(huì)影響預(yù)先以有機(jī)染料標(biāo)定的小鼠小腸的熒光訊號(hào)

在此實(shí)施方式中，小鼠小腸在接受透明處理前已事先以熒光染料進(jìn)行標(biāo)定。

簡(jiǎn)言之，先以凝集素-Alexa Fluor 488共軛物(購(gòu)自Invitrogen,USA)對(duì)小鼠進(jìn)行標(biāo)定，接著如「材料與方法」所述步驟，透過(guò)心臟盥洗方式以內(nèi)含4％多聚甲醛的冰冷的磷酸緩沖液進(jìn)行系統(tǒng)性固定。然后，將小鼠小腸取出，以N-乙酰-L-半胱胺酸溶液(0.4N)移除小腸中物質(zhì)，以0.5％PBST清洗3次后，于室溫下在震蕩器上以1.0％PBST震蕩隔夜以對(duì)小腸進(jìn)行通透化處理。接著，于4℃下讓小腸與碘化丙碇(PI,50μg/mL)溶液作用約30-60分鐘，再于室溫下以0.5％PBST清洗小腸3次，然后依照「材料與方法」所述步驟，以實(shí)施例1中配方2的透明溶液對(duì)小腸進(jìn)行透明化處理。第2圖為將此透明處理后的小鼠小腸共軛焦照片，可在傳統(tǒng)熒光顯微鏡下分別觀察到凝集素-Alexa Fluor 488共軛物與碘化丙碇的熒光訊號(hào)，代表以本發(fā)明透明溶液對(duì)組織施以透明化處理，并不會(huì)影響原先以染料或重組熒光蛋白標(biāo)定的組織的熒光訊號(hào)。

2.3透明化處理不會(huì)影響預(yù)先以親脂性細(xì)胞膜染料標(biāo)定的小鼠小腸的訊號(hào)

在此實(shí)施方式中，小鼠小腸在接受透明處理前，已事先以一種可水平擴(kuò)散并標(biāo)定整個(gè)細(xì)胞的長(zhǎng)鏈親脂陽(yáng)離子型吲哚羰花青熒光染料進(jìn)行標(biāo)定。

簡(jiǎn)言之，依據(jù)「材料與方法」所述步驟將小鼠小腸固定，再依實(shí)施例2.2所述步驟移除小腸中物質(zhì)，接著以0.5％PBST清洗3次后，于室溫下在震蕩器上于相同溶液中震蕩隔夜，以對(duì)小腸進(jìn)行通透化處理。接著，于室溫下讓小腸與DilC₁₈(3)(1,1’-二(十八烷基)-3,3’,3’,-四甲基吲哚羰花青過(guò)氯酸酯,1μg/mL)溶液作用隔夜，再于室溫下以PBS清洗小腸3次，然后依照「材料與方法」所述步驟，以實(shí)施例1中配方2的透明溶液對(duì)小腸進(jìn)行透明化處理。第3圖為將此透明處理后的小鼠小腸共軛焦照片。

2.4透明化處理不會(huì)影響預(yù)先以抗-酪胺酸羥基酶(TH)抗體及熒光蛋白標(biāo)定的蒼蠅腦部的訊號(hào)

在此實(shí)施方式中，小鼠小腸在接受透明處理前，已事先以一種熒光染料及抗-TH抗體進(jìn)行標(biāo)定。

簡(jiǎn)言之，將蒼蠅頭部切下浸泡在內(nèi)含4％多聚甲醛的冰冷的磷酸緩沖液中，然后微波處理(2,450MHz,1,100瓦)約90秒(伴隨連續(xù)旋轉(zhuǎn))，重復(fù)此微波處理3次。在室溫下以1％PBST和10％正常山羊血清清洗約30分鐘，然后真空脫氣(在真空室中將壓力減少至270mmHg并維持該壓力10分鐘，以移除組織中的空氣)。重復(fù)此真空脫氣處理6次。于4℃下以1％PBST和10％％正常山羊血清處理蒼蠅頭部隔夜，然后以1:100的小鼠抗-TH單株抗體溶液處理，接著于4℃下以1:250有生物素標(biāo)定的山羊抗小鼠IgG二次抗體處理約2天。以1％PBST清洗3次后，再于4℃下以1:500的Alexa Fluor 635鏈霉親和素處理腦部隔夜。經(jīng)過(guò)密集清洗后，將腦部組織轉(zhuǎn)移到一盛裝有實(shí)施例1(配方1)透明溶液的工作腔室中，讓腦部組織浸泡在其中約3分鐘。接著，以蓋玻片覆蓋腔室，并以Neo-Mount(Merck)將腔室密封，避光約1小時(shí)或直到Neo-Mount完全干燥為止。第4圖為以胺酸羥基酶(TH)-Gal4標(biāo)定，再施以透明處理，接著以抗-TH抗體進(jìn)行免疫染色的蒼蠅腦部的共軛焦照片。

實(shí)施例3復(fù)原經(jīng)透明化處理后的組織

在此實(shí)施方式中，依據(jù)實(shí)施例2.1所述方式將小鼠小腸固定并進(jìn)行透明處理，接著，將小腸移回到PBS中，浸泡約1小時(shí)候，可看到小腸組織逐漸由透明恢復(fù)到不透明狀態(tài)(第5圖)。

實(shí)施例4以其他透明溶液處理組織的比較實(shí)驗(yàn)例

4.1組織容積變化

在此實(shí)施方式中，是以實(shí)施例1的本發(fā)明透明溶液與其他幾種已知可使組織透明的溶液，包括，F(xiàn)ocusClear溶液(參見(jiàn)美國(guó)專利6,472,616 B1)、SCALEVIEW-A2溶液(參見(jiàn)美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)20130045503A1)、和苯甲醇-苯甲酸苯甲酯(BABB)溶液(參見(jiàn)Nature Methods(2007)4(4),331-336)，來(lái)處理小鼠腦部，然后分別測(cè)量經(jīng)各溶液處理后，小鼠腦部體積變化的情形。

為了測(cè)量在透明化處理后，組織膨脹和/或收縮的情況，將厚度約1毫米的小鼠腦部分別浸泡在實(shí)施例1的本發(fā)明透明溶液(配方2)、FocusClear溶液或SCALEVIEW-A2溶液中約7天，BABB溶液中約5天；然后測(cè)量組織體積改變的多寡。結(jié)果顯示在第6圖中。

可觀察到以本發(fā)明透明溶液(配方2)處理過(guò)的小鼠腦部，體積并沒(méi)有明顯改變；相反的，以FocusClear溶液處理后的小鼠腦部，體積縮減約5％；以BABB溶液處理，體積縮減程度則高達(dá)約35％。至于，SCALEVIEW-A2溶液則會(huì)使腦組織體積出現(xiàn)140％的線性膨脹。

4.2組織透明速率

在此實(shí)施方式中，比較了各透明溶液，包括實(shí)施例1的本發(fā)明透明溶液(配方2)、FocusClear溶液、SCALEVIEW-A2溶液和BABB溶液，使組織透明的速率。透明程度是以組織在633nm下的透光百分比來(lái)表示，結(jié)果示于第7圖中。

如第7圖所示，本發(fā)明實(shí)施例1的透明溶液使組織透明的速率最快，約70％的組織在透明化處理約3小時(shí)后即已轉(zhuǎn)成透明。透明化速率第二快的則是FocusClear溶液，約40％的組織在透明化處理約2小時(shí)后即已轉(zhuǎn)成透明。SCALEVIEW-A2溶液造成組織透明的速率最慢，經(jīng)過(guò)7天處理僅有約30％的組織變成透明。至于BABB溶液則是擁有全部透明或全部不透明的效果，約70％的組織在透明化處理1天后即已轉(zhuǎn)成透明。

總結(jié)來(lái)說(shuō)，相較于已知的透明溶液來(lái)說(shuō)，本發(fā)明實(shí)施例1的透明溶液擁有最佳的組織透明效果，其透明化后所引起的體積變化最小，具有最快速的初始透明化速率，以及與其他已知透明化溶液不相上下的透明化效果。

當(dāng)可理解上述實(shí)施方式與實(shí)施例僅為例示，且熟習(xí)此技術(shù)者可對(duì)其進(jìn)行各種修飾。上文提出的說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例與數(shù)據(jù)的目的在于使本說(shuō)明書(shū)的結(jié)構(gòu)完備，并作為實(shí)作本發(fā)明的例示。雖然本發(fā)明內(nèi)容已以實(shí)施方式揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明內(nèi)容，任何熟習(xí)此技術(shù)者，在不脫離本發(fā)明內(nèi)容的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種的更改與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明內(nèi)容的保護(hù)范圍當(dāng)根據(jù)后附的申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。當(dāng)可理解上述實(shí)施方式與實(shí)施例僅為例示，且熟習(xí)此技術(shù)者可對(duì)齊進(jìn)行各種修飾。上文提出的說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例與數(shù)據(jù)的目的在于使本說(shuō)明書(shū)的結(jié)構(gòu)完備，并作為實(shí)作本發(fā)明的例示。雖然本發(fā)明內(nèi)容已以實(shí)施方式揭露如上，然其并非用以限定本揭示內(nèi)容，任何熟習(xí)此技術(shù)者，在不脫離本揭示內(nèi)容的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種的更改與潤(rùn)飾，因此本揭示內(nèi)容的保護(hù)范圍當(dāng)根據(jù)后附的申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。