本發(fā)明涉及用于檢測含紅細(xì)胞的樣品中的對象物的免疫色譜用測試條、及使用該測試條的免疫色譜。更詳細(xì)而言，涉及：為了即使在以聚陽離子為有效成分的紅細(xì)胞凝集劑共存在測定體系中時也不會因該紅細(xì)胞凝集劑的存在導(dǎo)致作為檢測試劑的膠體金綴合物發(fā)生非特異性凝集而用特定添加劑進(jìn)行了處理的測試條；以及使用該測試條的免疫色譜。

背景技術(shù)：

近年，在診所或小規(guī)模醫(yī)院中，“想在患者診察期間獲知檢查結(jié)果”的需求在增加，正在由以前的委托院外進(jìn)行檢查向即時檢查(pointofcaretesting，poct)轉(zhuǎn)變。隨著poct的普及，已在使用收納有側(cè)流式免疫色譜用測試條的設(shè)備作為體外診斷藥。就免疫色譜用測試條而言，不需要在檢查時制備試劑，僅通過將血液或尿等被檢試樣(以下有時稱為“樣品”)直接滴加到該測試條上等簡單操作即能夠?qū)悠分械膶ο笪镞M(jìn)行檢測，對于簡便且迅速地分析檢測對象物而言是非常有用的。

免疫色譜用測試條(以下有時稱為“測試條”)通常為具備樣品供給部、展開部、檢測部的多孔性的膜，其結(jié)構(gòu)如下：針對檢測對象物的標(biāo)記抗體等檢測試劑(以下有時稱為“綴合物”)以能夠溶出、展開的方式保持于展開部的展開起始部位，從而與樣品接觸后能夠通過展開部并到達(dá)檢測部，進(jìn)而固定化抗體被固定在展開部的局部，構(gòu)成檢測部。這里，當(dāng)樣品滴加到樣品供給部時，樣品中的檢測對象物與標(biāo)記抗體特異性結(jié)合，形成復(fù)合物，該復(fù)合物在展開部向著下游方向逐漸展開，進(jìn)而與固定化抗體結(jié)合。因此，通過在抗體固定化部分對由標(biāo)記抗體、檢測對象物和固定化抗體形成的三明治型復(fù)合物進(jìn)行檢測，從而能夠?qū)z測對象物進(jìn)行定性或定量分析。構(gòu)成綴合物的標(biāo)記物的一例為膠體金粒子，通過膠體金粒子的顯色反應(yīng)能夠進(jìn)行定性檢測。進(jìn)一步地，基于其顯色程度，還能夠定量地檢測樣品中的檢測對象物。

但是，在前述樣品為全血時存在如下問題：全血中的紅細(xì)胞不能在多孔性的膜中移動而將膜孔堵塞，妨礙樣品的展開。因此，在以全血為樣品的情況下，需要預(yù)先從全血中分離除去紅細(xì)胞，作為這樣的方法，已知如下方法：在測定前，通過離心分離使紅細(xì)胞沉降并除去的方法；在測定前或者測定開始時，通過紅細(xì)胞分離劑使紅細(xì)胞凝集并過濾除去的方法。

作為前述紅細(xì)胞分離劑，已知有例如海美溴銨(以聚凝胺的商品名流通。以下有時簡稱聚凝胺)(專利文獻(xiàn)1、2、3)。

專利文獻(xiàn)1中，作為由合成的水溶性聚合物形成的紅細(xì)胞凝集劑的一例，而列舉了聚凝胺。

專利文獻(xiàn)2中，記載了一種色譜用玻璃纖維制血細(xì)胞分離膜，其含有聚凝胺作為紅細(xì)胞凝集化物質(zhì)。并且公開了如下技術(shù)：單獨聚凝胺的情況下，血液通過血細(xì)胞分離膜時伴隨有溶血，為了避免該溶血，用pva被覆前述血細(xì)胞分離膜。

這樣，雖然聚凝胺作為紅細(xì)胞凝集劑是廣泛已知的，但將聚凝胺用于將金屬綴合物用作檢測試劑的免疫色譜的情況下，存在不僅使全血中的紅細(xì)胞凝集而且還使金屬綴合物凝集的問題(專利文獻(xiàn)3)。

專利文獻(xiàn)3中公開了用于防止這樣的金屬綴合物的凝集的技術(shù)。即，開發(fā)了一種免疫色譜分析設(shè)備，其中，使作為紅細(xì)胞分離劑的聚凝胺等聚陽離子結(jié)合于色譜載體的上游，在其下游結(jié)合有用于中和聚陽離子的聚陰離子。根據(jù)該技術(shù)，聚陽離子的正電荷被聚陰離子的負(fù)電荷中和，因此可以防止含硒的金屬綴合物凝集。

以往技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開平3-205563號公報

專利文獻(xiàn)2：日本特開平5-099918號公報

專利文獻(xiàn)3：日本特表2002-509254號公報

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

在以全血為樣品，采用聚凝胺作為紅細(xì)胞凝集劑，采用膠體金綴合物作為檢測試劑來實施免疫色譜時，本發(fā)明人們嘗試按照上述專利文獻(xiàn)3公開那樣，通過添加用于防止膠體金綴合物凝集的聚陰離子來中和聚凝胺的正電荷。但是，雖然實現(xiàn)了全血中的紅細(xì)胞的凝集和分離除去，但未能防止膠體金綴合物的凝集。其原因尚不確定，但可能是由于專利文獻(xiàn)3的硒綴合物與膠體金綴合物不同、以及聚陰離子的種類等。

本發(fā)明的課題在于，提供使用聚凝胺作為以聚陽離子為有效成分的紅細(xì)胞凝集劑且使用膠體金綴合物作為檢測試劑時，使血液中的紅細(xì)胞凝集并分離除去，并且不引起膠體金綴合物的凝集的免疫色譜用測試條；以及提供使用該測試條的免疫色譜。

用于解決課題的手段

本發(fā)明人們在研究用于解決上述課題的方法時，不進(jìn)行引起課題的物質(zhì)、即聚陽離子的種類或量的選定，而是從完全不同的觀點出發(fā)，審視此前的試劑構(gòu)成本身并對各構(gòu)成要素進(jìn)行深入了研究，結(jié)果驚奇地發(fā)現(xiàn)存在一種具有抑制由聚凝胺引起的膠體金綴合物的凝集的能力的添加劑，發(fā)現(xiàn)通過使用該添加劑，在不通過聚陰離子來中和聚陽離子的情況下就能抑制膠體金綴合物的凝集，至此完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明具有以下構(gòu)成。

[1]一種免疫色譜用測試條，其具有以下的構(gòu)成。

(1)具有由多孔體構(gòu)成的膜，所述多孔體至少具備樣品供給部、展開部和檢測部，

在展開部的局部具有綴合物保持部，所述綴合物保持部以能夠溶出的方式保持有被膠體金標(biāo)記的抗檢測對象物抗體綴合物，進(jìn)而在展開部的局部且所述綴合物保持部分的下游側(cè)具有檢測部，所述檢測部固定有固定化抗體；

(2)從樣品供給部至展開部的綴合物保持部的上游側(cè)中的至少局部，以能夠與通過樣品供給部而被提供的聚凝胺接觸的方式含有添加劑，所述添加劑用于抑制由作為紅細(xì)胞凝集劑的聚凝胺引起的所述綴合物的凝集。

[2]根據(jù)[1]所述的測試條，其中，聚凝胺包含于樣品供給部。

[3]根據(jù)[1]或[2]所述的測試條，其中，前述添加劑包含于綴合物保持部。

[4]根據(jù)[1]～[3]中任一項所述的測試條，其中，不含有作為中和劑的聚陰離子，所述聚陰離子用于中和作為紅細(xì)胞凝集劑的聚凝胺的陽離子。

[5]根據(jù)[1]～[4]中任一項所述的測試條，其中，前述添加劑為選自屬于(a)2價金屬的鹽、(b)硫酸與金屬或鎓的鹽、(c)亞硫酸與金屬的鹽、(d)羧酸螯合物、(e)聚堿性氨基酸的化合物中的1種或2種以上化合物。

[6]一種利用免疫色譜的檢測方法，其具有下述工序：

(a)將樣品供給到測試條的樣品供給部的工序，

所述測試條具有由多孔體構(gòu)成的膜，所述多孔體至少具備樣品供給部、展開部和檢測部，

在展開部的局部具有綴合物保持部，所述綴合物保持部以能夠溶出的方式保持有含膠體金的綴合物，所述膠體金固定有針對對象物的抗體，進(jìn)而在展開部的局部且綴合物保持部分的下游側(cè)具有檢測部，所述檢測部固定有固定化抗體；

(b)使聚凝胺與樣品在樣品供給部或樣品供給部的上游接觸，使樣品中的來自血液的成分凝集的工序；

(c)將通過(b)工序得到的凝集物從樣品中分離除去的工序；

(d)使通過(c)工序得到的分離除去了凝集物的樣品成分與含膠體金的綴合物接觸的工序，該工序在具有抑制由聚凝胺引起的所述綴合物的凝集的能力的添加劑的存在下進(jìn)行；

(e)在檢測部檢測通過(d)工序得到的、樣品成分中的對象物與綴合物的復(fù)合物的工序。

[7]根據(jù)[6]所述的檢測方法，其中，聚凝胺包含于樣品供給部。

[8]根據(jù)[6]或[7]所述的檢測方法，其中，前述添加劑包含于綴合物保持部。

[9]根據(jù)[6]～[8]中任一項所述的檢測方法，其中，不含有作為中和劑的聚陰離子，所述聚陰離子用于中和作為紅細(xì)胞凝集劑的聚凝胺的陽離子。

[10]根據(jù)[6]～[9]中任一項所述的檢測方法，其中，樣品為肝素采血被檢體或edta采血被檢體。

[11]根據(jù)[6]～[10]中任一項所述的檢測方法，其中，前述添加劑為選自屬于(a)2價金屬的鹽、(b)硫酸與金屬或鎓的鹽、(c)亞硫酸與金屬的鹽、(d)羧酸螯合物、(e)聚堿性氨基酸的化合物中的1種或2種以上的化合物。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，在以聚凝胺為紅細(xì)胞凝集劑且使用膠體金綴合物作為檢測試劑的免疫色譜中，通過使用具有抑制由聚凝胺引起的膠體金綴合物凝集的能力的添加劑，從而可以不使膠體金綴合物凝集而僅使紅細(xì)胞凝集并將其從樣品中分離除去，膠體金綴合物可以發(fā)揮本來的作為檢測試劑的作用，因此能夠準(zhǔn)確地檢測和測定樣品中的檢測對象物。并且，由于作為聚陽離子中和劑的聚陰離子的添加并非必要條件，因此可以使試劑構(gòu)成變得極其簡單，另外，還具有如下優(yōu)點：減少會給免疫反應(yīng)、檢測對象物在試條上的展開等帶來無法預(yù)期的作用的因素。

附圖說明

圖1是示出聚凝胺溶液與添加有本發(fā)明的添加劑候補(bǔ)物質(zhì)的綴合物液的混合液的極大吸收波長的測定結(jié)果的圖(實施例1)。

圖2是本發(fā)明的免疫色譜用測試條的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是示出對使用本發(fā)明的添加劑的免疫色譜法和ltia法進(jìn)行比較的圖(實施例2)。

圖4是示出對本發(fā)明的添加劑處方和以往處方的檢測靈敏度進(jìn)行比較的圖(實施例3)。

具體實施方式

(免疫色譜用測試條)

本發(fā)明的免疫色譜用測試條是至少具備“樣品供給部”、“展開部”、“檢測部”的多孔性的膜，具有如下結(jié)構(gòu)：針對檢測對象物的標(biāo)記抗體以能夠溶出的方式保持于展開部的展開起始部位，從而與樣品接觸后能夠通過展開部到達(dá)檢測部，進(jìn)而固定化抗體被固定在展開部的局部，構(gòu)成檢測部。

作為將這些具體化的一例，可以列舉如下測試條，所述測試條包括：擔(dān)當(dāng)樣品供給部的樣品墊；以能夠溶出的方式保持針對檢測對象物的標(biāo)記抗體且擔(dān)當(dāng)展開部的局部的綴合物墊；局部固定有固定化抗體且擔(dān)當(dāng)展開部和檢測部的多孔性的膜。即，本發(fā)明的典型的免疫色譜用測試條具有以下構(gòu)成。

(1)被供給樣品的樣品墊

(2)配置在樣品墊的下游且以能夠溶出的方式保持有綴合物的綴合物墊，所述綴合物的膠體金表面被第一抗體致敏

(3)配置在綴合物墊的下游且固定有第二抗體的多孔性的膜，所述第二抗體與綴合物和檢測對象物的復(fù)合物結(jié)合

這里，也存在樣品墊、綴合物墊、多孔性的膜分別構(gòu)成各自的載體的情況、或者2者構(gòu)成1個載體的情況，只要從上游向下游按照樣品墊、綴合物墊、多孔性的膜的順序來構(gòu)成，則任一方式均包括在內(nèi)。

除了上述構(gòu)成以外，免疫色譜用測試條還包括進(jìn)一步配置安裝有吸收墊、3rd墊中的任一種以上的構(gòu)成。該測試條通常排列在塑料制粘合片之類的固相支承體上。以不妨礙樣品的毛細(xì)管流動的物質(zhì)來構(gòu)成該固相支承體自不必說，當(dāng)然，將粘接劑的成分也設(shè)為不妨礙樣品的毛細(xì)管流動的物質(zhì)。需要說明的是，還可以出于提高固定有抗體的多孔性的膜的機(jī)械強(qiáng)度、并且防止分析中的水分蒸發(fā)(干燥)的目的，進(jìn)行在測試條上層疊聚酯膜等的加工。

(紅細(xì)胞凝集劑)

作為本發(fā)明中使用的紅細(xì)胞凝集劑，可以使用公知的聚陽離子性的紅細(xì)胞凝集劑。其中，優(yōu)選聚凝胺。聚凝胺的化學(xué)名也叫海美溴銨，為被賦予cas號28728-55-4的1種陽離子性聚合物。

在本發(fā)明中，聚凝胺為了使作為樣品的全血中的紅細(xì)胞凝集而被使用。作為聚凝胺的使用方式，除了在將樣品稀釋而成的稀釋液中添加聚凝胺或在樣品中直接添加聚凝胺的方式以外，還可以使免疫色譜試條的樣品供給部(樣品墊)預(yù)先含有聚凝胺。通過這樣的使用方式，聚凝胺與全血接觸而將全血中的紅細(xì)胞凝集。紅細(xì)胞凝集物可通過某種過濾而從樣品中除去，在免疫色譜試條中，當(dāng)樣品通過構(gòu)成樣品供給部的過濾器時，大部分殘留在樣品供給部上而被除去。在本發(fā)明中，為了在樣品供給部除去紅細(xì)胞凝集物，更切實地減少向展開部的供給，期望并用后述的3rdpad(血細(xì)胞分離膜)。

聚凝胺的添加量為能夠?qū)⑷械募t細(xì)胞凝集而分離除去以使得全血樣品中的檢測對象物能夠進(jìn)行所期望的展開的量即可，例如，在預(yù)先包含于樣品墊中的情況下，優(yōu)選相對于滴加樣品時的樣品液量成為0.25％以上的濃度，進(jìn)而適宜為0.25～2％。從制造樣品墊時的觀點出發(fā)，以在滲入墊中的溶液中的濃度計，優(yōu)選為0.5％以上，進(jìn)而適宜為0.5～4％。

另外，本發(fā)明中不含有專利文獻(xiàn)3所述的、用于中和作為紅細(xì)胞凝集劑的聚凝胺的陽離子的、作為中和劑的聚陰離子，但在不脫離本發(fā)明的目的、不影響反應(yīng)體系的范圍內(nèi)，必要時，也不排除通常使用的聚陰離子的存在。

(添加劑)

在本發(fā)明中，出于將全血樣品中的紅細(xì)胞凝集的目的而使用紅細(xì)胞凝集劑(聚凝胺)，但聚凝胺存在不僅使紅細(xì)胞凝集還使膠體金綴合物凝集的問題。本發(fā)明中，為了避免這樣的膠體金綴合物凝集而需要使用添加劑。

作為本發(fā)明中使用的添加劑，只要具有抑制由聚凝胺引起的膠體金綴合物凝集的能力，就可以為任何物質(zhì)。

例如，將具有這樣的能力的添加劑添加到含有膠體金綴合物和聚凝胺的溶液中，觀測綴合物的凝集抑制減輕效果，從而可以選定本發(fā)明的添加劑。更具體而言，該選定方法為如下方法：在膠體金綴合物中預(yù)先加入作為選定對象的添加劑溶液，在其中添加聚凝胺溶液，測定極大吸收波長，選定極大吸收波長比無添加劑時小的物質(zhì)。

特別是，在膠體金綴合物和紅細(xì)胞這2種聚陰離子共存的狀態(tài)下，能選擇性地僅使一方凝集而抑制另一方的凝集，這一事實很令人驚訝。

作為通過上述那樣的選定方法選擇出的添加劑，可以列舉選自屬于(a)2價金屬的鹽、(b)硫酸與金屬或鎓的鹽、(c)亞硫酸與金屬的鹽、(d)羧酸螯合物、(e)聚堿性氨基酸的化合物中的1種或2種以上化合物。

(a)2價金屬的鹽

2價金屬的鹽進(jìn)而可以分類為：(a1)2價金屬與酸的鹽、(a2)2價金屬與鹵素元素的鹽。這里，作為2價的金屬，可以例示鎂、鈣、鎳、鋅等。作為酸，可以例示硫酸、硝酸等無機(jī)酸，醋酸等有機(jī)酸，作為鹵素元素，可以例示氯、溴等。這些之中，作為(a1)的具體化合物，硫酸鎂、硝酸鎂、醋酸鎂是適宜的，作為(a2)的具體化合物，氯化鎂、氯化鈣、氯化鋅、氯化錳、氯化鎳是適宜的。

(b)硫酸與金屬或鎓的鹽

作為(b1)硫酸與金屬的鹽，可以列舉：硫酸與1價金屬的鹽或硫酸與2價金屬的鹽，其中，優(yōu)選硫酸鉀、硫酸鎂(與a1重復(fù))。作為(b2)硫酸與鎓的鹽，優(yōu)選硫酸銨。

(c)亞硫酸與金屬的鹽

作為亞硫酸與金屬的鹽，優(yōu)選亞硫酸鈉。

(d)羧酸螯合物及其鹽

羧酸螯合物進(jìn)而可以分類為：(d1)二羧酸螯合物、(d2)三羧酸螯合物、(d3)四羧酸螯合物、(d4)五羧酸螯合物。作為(d1)二羧酸螯合物，優(yōu)選草酸、琥珀酸、酒石酸，作為(d2)三羧酸螯合物，優(yōu)選檸檬酸，作為(d3)四羧酸螯合物，優(yōu)選乙二胺四醋酸(edta)，作為(d4)五羧酸螯合物，優(yōu)選二乙基三胺五醋酸(dtpa)。這些螯合物可以以游離酸或者金屬鹽的形式來使用。作為以金屬鹽形式使用時的具體例子，可以列舉：檸檬酸三鈉、edta-2na等。另外，除了前述以外，也可以是二醇醚二胺四醋酸(egta)等對前述化合物的結(jié)構(gòu)的一部分進(jìn)行修飾、改變而得的化合物。

(e)聚堿性氨基酸

作為聚堿性氨基酸，可以列舉：聚-l-精氨酸，優(yōu)選以聚-l-精氨酸鹽酸鹽的形式來使用。在專利文獻(xiàn)3中，聚-l-精氨酸鹽酸鹽是與聚凝胺同樣地被歸類為具有正電荷的紅細(xì)胞分離劑的化合物，在與聚凝胺組合時，不僅不會增強(qiáng)由聚凝胺引起的膠體金綴合物的凝集效果，反而會降低該效果，這一點完全出乎意料。

該添加劑的添加量只要為可以抑制由聚凝胺引起的膠體金綴合物的凝集的量即可，例如，以在滲入樣品墊和/或綴合物墊的溶液中的濃度計，可以列舉1～100mmol/l，優(yōu)選2～50mmol/l、10～50mmol/l。添加劑的種類、和添加量以及濃度可以根據(jù)作為目標(biāo)的對象物質(zhì)、所需的靈敏度等來適宜設(shè)定。

作為本發(fā)明的特定添加劑的使用方式，只要是可以抑制由作為紅細(xì)胞凝集劑的聚凝胺引起的膠體金綴合物凝集的方式，就可以為任一方式，在免疫色譜用測試條中，以能夠與聚凝胺成分接觸的方式含浸于從樣品供給部至展開部的綴合物固定部位中的至少局部即可。因此，可以僅為樣品供給部，此外也可以為樣品供給部至展開部的全部部位。

在使添加劑包含于樣品供給和/或綴合物墊中的方式中，除了使液狀的添加劑包含于墊中的方式外，還包括使添加劑含浸于墊后進(jìn)行干燥從而添加劑以干燥狀態(tài)附著于墊的方式。

另外，本發(fā)明的特定的添加劑還可以添加在樣品稀釋液中來使用。

在本發(fā)明中，如上所述，需要以特定的使用方式來使用添加劑，但這并不妨礙出于其他的目的而使用上述以外的其它添加劑或以上述以外的其它使用方式來使用。例如，自不必說，使樣品供給部至展開部的綴合物固定部位含浸本發(fā)明的特定添加劑、使展開部的抗體固定化部位含浸上述以外的添加劑的方式當(dāng)然也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

(膠體金)

本發(fā)明中使用的作為標(biāo)記物的膠體金只要是可以使抗體致敏(固定)而構(gòu)成綴合物且可以在使其與樣品接觸而對樣品中的對象物(抗原)進(jìn)行檢測的方法中作為標(biāo)記物來發(fā)揮作用的膠體金，就可以為任意一種。

作為膠體金，除了膠體金以外，膠體鉑也包含在本發(fā)明的膠體金中。

已知膠體金粒子的粒徑會極大地影響檢測靈敏度，例如，在保持于免疫色譜用測試條來使用的情況下，作為膠體金粒子的粒徑，優(yōu)選20～60nm，更優(yōu)選30～50nm，特別優(yōu)選40nm。上述膠體金可以通過熟知的方法，例如在加熱的四氯金(iii)酸水溶液中滴加檸檬酸三鈉水溶液或檸檬酸三銨水溶液并攪拌來制造。在本說明書，有時也將膠體金稱為膠體金粒子，但二者意思相同。

(抗體對膠體金的致敏)

針對檢測對象物的抗體向膠體金的固定通常通過物理吸附來進(jìn)行。此時，抗體濃度優(yōu)選被調(diào)整為1～5μg/ml緩沖液的濃度。緩沖液的種類和ph優(yōu)選為2mmol/l磷酸緩沖液(ph6.5～8)或2～10mmol/ltristris-鹽酸緩沖液(ph7～9)，進(jìn)一步優(yōu)選為2～10mmol/ltris-鹽酸緩沖液(ph7～7.5)，但也包含其它緩沖液的使用，而并不限于這些。在本說明書中，將上述那樣的在膠體金上固定有針對檢測對象物的抗體、對照用抗體(或者抗原)的膠體金稱為“綴合物”。

(封閉)

對于本發(fā)明的綴合物來說，還可以用封閉劑將膠體金表面的未結(jié)合抗體的區(qū)域封閉。

作為膠體金綴合物的封閉劑，通常使用來自生物的成分，作為來自生物的成分，只要來自于生物且具有封閉作用，就可以為任意成分，例如，可以列舉動物性蛋白和來自動物性蛋白的肽。具體而言，可以列舉：牛血清白蛋白即bsa、來自微生物的blockingpeptidefragment(toyobo制)、來自絲蛋白(絲膠蛋白的水解物)的neoproteinsaver(toyobo制)、startingblock^tm(pbs)blockingbuffer(pierce制)、stabilcoat^tm(surmodics公司制)、casein。

作為來自生物的成分的濃度，根據(jù)所使用的成分適宜決定即可。例如，在調(diào)整為1od/ml的膠體金溶液中加入抗體液并混合后，在該混合液中以終濃度0.1～10％的范圍添加前述來自生物的成分，從而進(jìn)行封閉，更優(yōu)選以0.2～5％的范圍來使用。

此外，還可以將來自非生物的成分和來自生物的成分兩者混合后作為膠體金的封閉劑來使用。

(檢測試劑)

在本發(fā)明中，“檢測試劑”具體是指至少含有綴合物的溶液。

出于使綴合物保持穩(wěn)定狀態(tài)而在與樣品混合時促進(jìn)固定于綴合物的抗體與檢測對象物的特異性反應(yīng)、或者使綴合物迅速且有效地溶解和流動的目的，檢測試劑可以含有例如1種以上的穩(wěn)定化劑、溶解輔助劑等。作為該穩(wěn)定化劑、溶解輔助劑等，可以列舉例如：牛血清白蛋白(bsa)、蔗糖、酪蛋白、氨基酸類等。

另外，出于提高檢測靈敏度的目的，必要時，檢測試劑中可以含有2

甲基丙烯酰氧基乙基磷酸膽堿等公知的增敏劑。

進(jìn)而，必要時，檢測試劑中還可以含有作為ca²⁺離子的螯合劑的edta、egta等。

需要說明的是，在本說明書中，“檢測”或“測定”這些用語包括證明檢測對象的存在和/或檢測對象的定量等地需要最廣義地進(jìn)行解釋，任何含義都不作為限定性解釋。

(稀釋液)

在本發(fā)明中，根據(jù)樣品中的檢測對象物的濃度而需要進(jìn)行樣品的稀釋時，有時使用稀釋液。稀釋液只要不會顯著阻礙抗原抗體反應(yīng)或者不會因相反地顯著促進(jìn)反應(yīng)而使標(biāo)記物過凝集而導(dǎo)致毛細(xì)管現(xiàn)象中的展開不良、或者不會使與抗原濃度相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)的信號無法檢測，就可以使用任意組成的稀釋液。

作為具有這樣的作用的稀釋液，可以列舉例如：純化水；生理鹽水；ph6.0～10.0的低濃度緩沖液，例如10～20mmol/l磷酸緩沖液、10～20mmol/ltris-鹽酸緩沖液、10～20mmol/lbis-tris緩沖液。另外，出于控制樣品在試條上的展開速度的目的，還可以在這些稀釋液中添加表面活性劑。

如前所述，在本發(fā)明的稀釋液中可以預(yù)先含有作為紅細(xì)胞凝集劑的聚凝胺。

另外，如前所述，本發(fā)明的稀釋液中還可以預(yù)先含有具有凝集抑制能力的添加劑，所述凝集抑制能力是指抑制聚凝胺對膠體金綴合物的凝集的能力。

(樣品墊)

在本發(fā)明中，“樣品墊”是接受樣品的擔(dān)當(dāng)樣品供給部的部位，只要為在成型為墊的狀態(tài)下吸收液體的樣品并且能夠使液體和檢測對象物的成分穿過的物質(zhì)和形態(tài)，就可以包括任意墊。

如前所述，本發(fā)明的樣品墊中可以預(yù)先含有紅細(xì)胞凝集劑。這種情況下，可以包含在樣品墊中的至少一部分，也可以包含在整個樣品墊中。

另外，如前所述，本發(fā)明的樣品墊中還可以預(yù)先含有特定的添加劑。這種情況下，可以包含在樣品墊中的至少一部分，也可以包含在整個樣品墊中。這里，在使本發(fā)明的樣品墊預(yù)先含有紅細(xì)胞凝集劑和特定的添加劑這兩者的情況下，可以使兩者包含于樣品墊的同一部位，也可以為了不共存而分別包含于不同的部位。另外，還可以使樣品墊的整體中預(yù)先包含這兩者。

作為適合于樣品墊的材料的具體例子，包括玻璃纖維(glassfiber)、丙烯酸類纖維、親水性聚乙烯材料、干燥紙、紙漿、織物等，但并不限于這些。適宜使用玻璃纖維制墊。也可以使該樣品墊同時具備后述的綴合物墊的功能。另外，在不脫離本發(fā)明的目的、不影響反應(yīng)體系的范圍內(nèi)，必要時，樣品墊中還可以含有通常使用的封閉試劑。

(綴合物墊)

在本發(fā)明中，“綴合物墊”是指：使與檢測對象物特異性反應(yīng)的檢測試劑含浸于適合后述綴合物墊的材料中并干燥而成的墊。綴合物墊具有如下功能：當(dāng)樣品從該綴合物墊通過時，檢測試劑和檢測對象物形成復(fù)合物。該綴合物墊可以以其自身以與抗體固定化膜接觸的方式進(jìn)行配置?；蛘咭部梢砸韵率龇绞脚渲茫号c前述樣品墊接觸地配置，接收基于毛細(xì)管流從樣品墊中通過的樣品，然后基于毛細(xì)管流將該樣品移送到另一墊(以下有時稱為“3rdpad”)，所述另一墊與綴合物墊中的、異于與前述樣品墊的接觸面的面相接觸。需要說明的是，樣品墊、綴合物墊中的一種以上的部位的選擇、所選擇的部位以何種方式配置于抗體固定化膜是可以適宜地改變的。

另外，如前所述，本發(fā)明的綴合物墊中還可以預(yù)先含有特定的添加劑。這種情況下，可以包含于綴合物墊的、至少包括固定有綴合物的部位的上游在內(nèi)的一部分，也可以包含于綴合物墊的整體中。

作為適合于該綴合物墊的材料，可以列舉紙、纖維素混合物、硝酸纖維素、聚酯、丙烯腈共聚物、玻璃纖維或人造纖維之類的無紡纖維，但并非限于這些。適宜使用玻璃纖維制墊。

必要時，該綴合物墊中可以含有用于確保免疫色譜的可靠性的“對照試劑”，例如被標(biāo)記物標(biāo)記的不與樣品成分反應(yīng)的抗體、被標(biāo)記物標(biāo)記的klh(鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白)等高抗原性蛋白質(zhì)等。這些對照試劑是認(rèn)為樣品中不可能存在的成分(物質(zhì))，可適宜選擇。

(3rdpad)

在本發(fā)明中，3rdpad可以出于如下目的而配置，所述目的為：樣品與檢測試劑的反應(yīng)成分中，能夠?qū)z測對象物的檢測中不需要的成分除去，從而使反應(yīng)所需要成分在固定有抗體的不溶性膜上順利展開。

例如，血細(xì)胞、不溶性的血細(xì)胞破碎物等為檢測中不需要的成分，期望被除去。另外，還可以使該3rdpad同時具有如下額外的效果：在通過抗原抗體反應(yīng)而生成的凝集物中，將大到不能在抗體固定化膜上移動且不能順利展開的程度的凝集物預(yù)先除去。作為3rdpad，還包括使液體和檢測對象的成分能夠穿過的任意物質(zhì)和形態(tài)。

作為具體例子，包括玻璃纖維(glassfiber)、丙烯酸類纖維、親水性聚乙烯材料、干燥紙、紙漿、織物等，但并非限于這些。

在本發(fā)明中，為了將未僅被前述紅細(xì)胞凝集劑和樣品墊徹底除去的血細(xì)胞更切實地分離除去，期望使用血細(xì)胞分離膜。

(抗體向不溶性膜的固定)

本發(fā)明的免疫色譜試劑中的針對檢測對象物的抗體向不溶性膜的固定可以通過熟知的方法來實施。例如，在流通式的情況下，將上述抗體調(diào)整為規(guī)定濃度，將一定量的該液體以點狀或者+等特定符號狀涂布在不溶性膜上。另外，此時，為了確保免疫色譜的可靠性，通常將可與綴合物結(jié)合的蛋白質(zhì)或者化合物固定在與針對檢測對象物的抗體不同的位置，從而作為“對照線”。另外，也可以將針對前述對照試劑的抗體固定在與針對檢測對象物的抗體不同的位置，從而作為“對照線”。

在側(cè)流式的情況下如下進(jìn)行：將上述抗體調(diào)整為規(guī)定濃度，使用具有能夠一邊以一定速度從噴嘴吐出該液體一邊沿著水平方向移動的機(jī)構(gòu)的裝置等，在不溶性膜上涂布為線狀。此時，抗體的濃度優(yōu)選為0.1～5mg/ml，進(jìn)而優(yōu)選為0.5～3mg/ml。另外，關(guān)于抗體在不溶性膜上的固定量，在流通式的情況下，可以通過調(diào)節(jié)滴加到不溶性膜上的涂覆量來優(yōu)化，在側(cè)流式的情況下，可以通過調(diào)節(jié)從上述裝置的噴嘴吐出的速度來優(yōu)化。特別是，在側(cè)流式的情況下，優(yōu)選為o.5～2μl/cm。需要說明的是，在本發(fā)明中，“流通式膜分析”是指樣品液等垂直通過不溶性膜而展開的方式，“側(cè)流式膜分析”是指樣品液等平行于不溶性膜地移動而展開的方式。

另外，在本發(fā)明中，關(guān)于針對對象物的抗體在不溶性膜上的涂覆位置，在側(cè)流式的情況下，如下地配置即可：使上述檢測試劑基于毛細(xì)管現(xiàn)象從綴合物墊展開，并依次通過涂覆有各抗體的線。優(yōu)選以涂覆有針對檢測對象物的抗體的線位于上游，而涂覆有對照抗體的線位于其下游的方式來配置。此時，期望各線間的距離為充分的距離以使得能夠進(jìn)行標(biāo)記物的信號檢測。在流通式的情況下，針對對象物的抗體的涂覆位置按照能夠進(jìn)行標(biāo)記物的信號檢測的方式來配置即可。

向上述不溶性膜上涂覆的抗體液通?？梢允褂靡?guī)定緩沖液來制備。作為該緩沖液的種類，可以列舉：磷酸緩沖液、tris緩沖液、good’s緩沖液等通常使用的緩沖液。緩沖液的ph優(yōu)選在6.0～9.5的范圍，可以根據(jù)使用的抗體的性質(zhì)適宜設(shè)定。例如，在后述抗h-fabp單克隆抗體的情況下，可以使用ph7.2的緩沖液。緩沖液中還可以含有nacl等鹽類、蔗糖等穩(wěn)定劑或保存劑、proclin等防腐劑等。鹽類除了nacl等那樣為了調(diào)整離子強(qiáng)度而包含的鹽外，還包括氫氧化鈉等在緩沖液的ph調(diào)整工序中添加的鹽。將抗體固定于不溶性膜后，還可以進(jìn)一步使通常使用的封閉劑以溶液或者蒸氣狀被覆抗體固定部位以外的位置，從而進(jìn)行封閉。

本說明書中，如上所述，有時將固定有抗體的不溶性膜稱為“抗體固定化膜”。

(不溶性膜)

在本發(fā)明中，作為不溶性膜(以下有時簡單記載為膜)，可以使用任意材質(zhì)的膜?？梢粤信e例如：聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、尼龍類、玻璃、纖維素和纖維素衍生物等多糖類或者陶瓷等，但并非限于這些。具體而言，可以列舉merck&co.，inc.、東洋濾紙公司、whatman，inc.等銷售的玻璃纖維濾紙、纖維素濾紙等。另外，通過對該不溶性膜的孔徑和結(jié)構(gòu)進(jìn)行適宜選擇，從而能夠控制膠體金標(biāo)記抗體與對象物的免疫復(fù)合物在膜中流動的速度。通過控制在膜中的流動速度，從而可以調(diào)節(jié)結(jié)合在固定于膜的上述抗體上的標(biāo)記抗體量，因此期望考慮到與本發(fā)明的免疫色譜用測試條的其它構(gòu)成材料的組合來優(yōu)化膜的孔徑和結(jié)構(gòu)。

(吸收墊)

在本發(fā)明中，吸收墊是指：通過將在不溶性膜中移動、通過的樣品吸收而控制樣品的展開的具有液體吸收性的部位。在側(cè)流式中，設(shè)置在試條構(gòu)成的最下游即可，在流通式中，例如可以設(shè)置在抗體固定化膜的下部。作為該吸收墊，可以使用例如濾紙，但不限于此。優(yōu)選使用whatman，inc.的740-e等。

(檢測器件)

本發(fā)明的免疫色譜用測試條可以收納、搭載于考慮了試條的大小、樣品的添加方法·位置、抗體固定化膜中的抗體的固定位置、信號的檢測方法等的適當(dāng)容器(殼體)中而使用，將這種被收納、搭載的狀態(tài)稱為“設(shè)備”。

(其它)

在說明書中，有時將“不溶性膜”表述為“固相”，將通過物理或化學(xué)方法使抗原、抗體擔(dān)載于不溶性膜的情況或者擔(dān)載后的狀態(tài)表述為“固定”、“固定化”、“固相化”、“致敏”、“吸附”。

(樣品)

在本發(fā)明的檢測方法中，含有檢測對象物的“樣品”是指含有表面具有很多負(fù)電荷的粒子狀成分的液體，作為生物樣品，可以列舉包含紅細(xì)胞的樣品，特別可以列舉：全血、通過離心分離等分離出的紅細(xì)胞、血漿等。

另外，血液被檢體中還包括如下被檢體：采血時，利用添加了edta或肝素等抗凝劑的采血管采集的被檢體(以下有時簡稱為含edta的被檢體、含肝素的被檢體等)。

根據(jù)本發(fā)明，還發(fā)揮以下效果：免疫色譜法中含edta的被檢體的測定值比含肝素的被檢體的測定值低的問題也被解決，不論被檢體的種類如何都能夠進(jìn)行準(zhǔn)確的測定。另外，進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的添加劑，還得到檢測靈敏度上升的效果。因此，通過將添加劑的濃度、種類選定為所期望的濃度、種類，還能夠控制免疫色譜設(shè)備的檢測靈敏度。

(檢測對象物)

作為本發(fā)明的檢測對象物，可以例示血液(全血)、紅細(xì)胞、血清、血漿、尿、唾液或咳痰等生物樣品中所存在的物質(zhì)，例如炎癥相關(guān)標(biāo)志物，如crp(c反應(yīng)性蛋白)、iga、igg、igm等；凝血和纖溶標(biāo)志物，如纖維蛋白降解產(chǎn)物(例如d二聚體)、可溶性纖維蛋白、tat(凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物)、pic(纖溶酶-纖溶酶抑制物復(fù)合物)等；循環(huán)相關(guān)的標(biāo)志物，如氧化ldl、bnp(腦鈉肽)、h-fabp(心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白)；代謝相關(guān)的標(biāo)志物，如脂連蛋白；腫瘤標(biāo)志物，如cea(癌胚抗原)、afp(甲胎蛋白)、ca19-9、ca125、psa(前列腺特異性抗原)；感染相關(guān)標(biāo)記物，如hbv(b型肝炎病毒)、hcv(c型肝炎病毒)、沙眼衣原體、淋病奈瑟氏球菌；變應(yīng)原特異性ige(免疫球蛋白e)；激素；藥物等。在這些中，更優(yōu)選想要使用全血作為樣品的呼聲高的d二聚體、crp、bnp、h-fabp等。

(本發(fā)明中使用的抗體)

本發(fā)明中使用的針對檢測對象物的抗體只要是特異性地與檢測對象物反應(yīng)的抗體，則對制作方法沒有任何限定，可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。通常，產(chǎn)生該抗體的雜交瘤可以依照kohler和milstein的方法(參照nature、第256卷495頁(1975年))，使以檢測對象物為免疫原而進(jìn)行了免疫的動物的脾細(xì)胞和同種的骨髓瘤細(xì)胞(myelomacells)進(jìn)行細(xì)胞融合來制作。

這里，在通過形成所謂的三明治來檢測檢測對象物的測定法中，在使用的抗體為單克隆抗體的情況下，標(biāo)記物固定用抗體(第一抗體)和不溶性膜固定用抗體(第二抗體)的關(guān)系是：第一抗體的表位為一價時，第二抗體的表位使用與第一抗體不同的表位；第一抗體的表位為多價時，第二抗體的表位與第一抗體可以相同也可以不同。

在后述實施例1中，使用抗h-fabp單克隆抗體。本發(fā)明中使用的抗h-fabp單克隆抗體的制備方法如下所述，但本發(fā)明不受其限定，也可以使用市售的抗h-fabp單克隆抗體。作為市售的抗h-fabp單克隆抗體的例子，可以列舉：hytest公司的clone#5b5、#10e1等；fitzgerald公司的clone#m79188、#79189等(需要說明的是，為了方便，單克隆抗體有時以產(chǎn)生該抗體的雜交瘤的克隆名來表示。以下相同)。

(抗h-fabp單克隆抗體的制備例)

(1)雜交瘤的制備

將溶解于pbs的人純化h-fabp(hytest公司制)作為免疫原。將該免疫原與完全弗氏佐劑(和光純藥工業(yè)公司制)按照1比1的液量進(jìn)行艉和乳化，制備成h-fabp濃度0.5mg/ml的乳液，將100μl該乳液投與到6周齡的雌balb/c小鼠的皮下。然后，在2個半月間，將h-fabp濃度0.2mg/ml的乳液100μl追加投與3次，第3次的追加投與起10天后，將用pbs溶解的0.2mg/ml的人純化h-fabp100μl投與至皮下。3天后，摘出脾臟、鼠頸部淋巴結(jié)和髂骨淋巴結(jié)，將得到的脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞sp2/o-ag14按照6比1的比例混合，在50％聚乙二醇1540(和光純藥工業(yè)公司制)存在下進(jìn)行細(xì)胞融合。融合細(xì)胞按照以脾臟細(xì)胞計為2.5×10⁶/ml的方式懸浮于hat培養(yǎng)基，在96孔培養(yǎng)板(corning公司制)中各分注0.2ml。將其在5％co2培養(yǎng)箱中于37℃進(jìn)行培養(yǎng)，約1周后，對于雜交瘤逐漸長起來的孔中的培養(yǎng)上清，用elisa法選擇產(chǎn)生與h-fabp反應(yīng)的抗體的細(xì)胞株。具體而言，首先介由山羊抗小鼠igg(fc)抗體(jackson公司制)將各培養(yǎng)上清中的igg固定于微孔板(nunc公司制)后，與h-fabp反應(yīng)。接下來，與生物素標(biāo)記抗h-fabp兔多克隆抗體(proteintechgroup公司制)反應(yīng)，進(jìn)而與過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(pierce公司制)反應(yīng)。然后，加入含有鄰苯二胺(東京化成公司制)的過氧化物酶底物溶液而進(jìn)行顯色，加入1.5n硫酸使顯色停止后，用酶標(biāo)儀(abs.492nm)進(jìn)行測定，選擇對h-fabp顯示出高反應(yīng)性的雜交瘤。對于所選擇的雜交瘤，使用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，建立了10種產(chǎn)生抗h-fabp單克隆抗體的雜交瘤。

(2)單克隆抗體的制備

對于在2周前腹腔內(nèi)注射了姥鮫烷o.5ml的12周齡的雌balb/c小鼠，以細(xì)胞數(shù)0.2×10⁵個的量腹腔內(nèi)投與上述(1)中得到的雜交瘤。約14天后采集腹水，進(jìn)行離心處理而得到上清。將上清與等量的吸附用緩沖液(3mol/lnacl-1.5mol/lglycine-naoh、ph8.5)混和，然后進(jìn)行過濾。使該濾液通過已經(jīng)用吸附用緩沖液平衡化的蛋白a柱(gehealthcare公司制)，使濾液中的抗體吸附到柱上后，用0.1mol/l檸檬酸緩沖液(ph3.0)使抗體從柱中洗脫，從而純化抗h-fabp單克隆抗體(clone#87203和clone#87212)。

(測定)

作為對來自膠體金的信號進(jìn)行定量的方法，按照公知的方法進(jìn)行即可，可以測定吸光度或者反射光強(qiáng)度。也可以將該吸光度或反射光強(qiáng)度的變化量外插到已知濃度的樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線中來測定對象物的濃度。

(利用免疫色譜的檢測方法)

本發(fā)明的利用免疫色譜的檢測方法為至少具有以下的(a)～(e)工序的方法，典型地，為使用上述免疫色譜用測試條的檢測方法。

(a)將樣品供給到測試條的樣品供給部的工序，

所述測試條具有由多孔體構(gòu)成的膜，所述多孔體至少具備樣品供給部、展開部和檢測部，

在展開部的局部以能夠溶出的方式保持有被膠體金標(biāo)記的針對檢測對象物的抗體(綴合物)，進(jìn)而在展開部的局部且綴合物保持部分的下游側(cè)具有檢測部，所述檢測部固定有固定化抗體；

(b)使聚凝胺與樣品在樣品供給部或樣品供給部的上游接觸，使樣品中的來自血液的成分凝集的工序

(c)將通過(b)工序得到的凝集物從樣品中分離除去的工序

(d)使通過(c)工序得到的分離除去了凝集物的樣品成分與含膠體金的綴合物接觸的工序，該工序在具有抑制由聚凝胺引起的前述綴合物的凝集的能力的添加劑的存在下進(jìn)行

(e)在檢測部檢測通過(d)工序得到的、樣品成分中的對象物與綴合物的復(fù)合物的工序

實施例

接下來，列舉實施例來具體說明本發(fā)明，但這些例子并不限定本發(fā)明的范圍。

〔實施例1〕本發(fā)明的添加劑的選定方法

對聚凝胺溶液與添加有本發(fā)明的添加劑候補(bǔ)物質(zhì)的綴合物液的混合液的吸收波長進(jìn)行測定，來進(jìn)行本發(fā)明的添加劑的選定。

1.各種溶液、綴合物的制備

1)膠體金標(biāo)記抗h-fabp單克隆抗體(抗h-fabp抗體綴合物)的制備

(i)膠體金溶液的制備

在加熱到73℃的500ml純化水中，添加5％(w/v)檸檬酸三銨水溶液1ml并攪拌混合。接下來，添加5％(w/v)四氯金(iii)水溶液1ml，邊攪拌邊反應(yīng)10分鐘后，使反應(yīng)液沸騰。然后，在冰水中冷卻，從而制備平均粒徑為40nm的膠體金的溶液。對于該平均粒徑為40nm的膠體金的溶液，用2mmol/ltris-鹽酸緩沖液(ph7.0)調(diào)整為在膠體金的極大吸收波長下的吸光度為1od/ml。

(ii)抗h-fabp抗體綴合物的制備

在上述1od/ml的膠體金溶液(ph7.0)20ml中，添加用2mmol/ltris-鹽酸緩沖液(ph7.0)稀釋為46.2μl/ml的抗h-fabp單克隆抗體(clone#87212的f(ab’)2片段)1ml，在室溫下攪拌10分鐘。在該膠體金與抗體的混合液中，添加含有0.1％(w/v)封閉劑(neoproteinsaver：東洋紡生化公司、no.nps-301)的2mmol/ltris-鹽酸緩沖液(ph7.0)1ml，在室溫下攪拌5分鐘。然后，在10℃下以11900×g離心45分鐘。

除去上清后，在得到的沉渣中添加綴合物稀釋液(conjugatedilutionbuffer：scripps公司、no.b0221)1ml，使綴合物懸浮，得到抗h-fabp抗體綴合物。

(iii)添加劑水溶液的制備

將表1所述的各添加劑溶解于水。按照各自對水的溶解性，調(diào)整為1mol/l或0.5mol/l。

(iv)試驗用懸浮液的制備

將上述所制備的添加劑水溶液加入到(ii)中制備的抗h-fabp抗體綴合物中，并按照添加劑達(dá)到各種濃度的方式來調(diào)整，將該懸浮液作為試驗用懸浮液。需要說明的是，將各試驗用懸浮液中的添加劑的濃度的組合示于表1。

(v)聚凝胺的水溶液

將聚凝胺(sigma-aldrich)溶解于水，制備成0.5％的濃度的水溶液。

[表1]

2.試驗方法

測定在試驗用懸浮液中加入聚凝胺水溶液時的吸收波長。

在上述所制備的試驗用懸浮液中加入等量的0.5％聚凝胺水溶液。然后，在加入聚凝胺水溶液起1.5分鐘后，用分光光度計在400nm～900nm的范圍測定吸收波長，由所測定的吸收波長的光譜算出極大吸收波長。如果所得到的極大吸收波長比不添加添加劑時(即，膠體金綴合物存在凝集)的極大吸收波長小，則可以判定為各添加劑具有減輕聚凝胺存在下的凝集反應(yīng)的效果。進(jìn)一步地，越接近無聚凝胺時(即，無膠體金綴合物的凝集)的極大吸收波長，則越可以判定為更優(yōu)選的添加劑。

3.試驗結(jié)果

將各極大吸收波長示于圖1。圖1所述的添加劑的濃度為表1所示的在試驗用懸浮液中的濃度。以下，在該濃度下來識別、評價各樣品。

聚凝胺存在下且無添加劑的樣品的極大吸收波長為552nm。與此相對地，與無添加劑的樣品相比，對于在聚凝胺存在下加入了實施例的添加劑的各樣品來說，在所有情況下，極大吸收波長均位于低波長側(cè)且為不存在聚凝胺的樣品的極大吸收波長附近的波長。

另一方面，在聚凝胺存在下，比較例的化合物的極大吸收波長雖然與無添加劑的樣品的極大吸收波長相比為低波長，但是其程度僅為一點點，還存在在聚凝胺存在下極大吸收波長比無添加劑的樣品的極大吸收波長長的化合物。

〔實施例2〕使用本發(fā)明的添加劑的免疫色譜法與ltia法的比較

1.本發(fā)明的免疫色譜設(shè)備的制作

1)膠體金標(biāo)記抗h-fabp單克隆抗體(抗h-fabp抗體綴合物)的制備

(i)膠體金溶液的制備

使用與上述實施例1的(i)同樣地制備的膠體金溶液。

(ii)抗h-fabp抗體綴合物的制備

使用與上述實施例1的(ii)同樣地制備的抗h-fabp抗體綴合物。

(iii)對照線用膠體金標(biāo)記klh(klh綴合物)的制備

在上述1od/ml的膠體金溶液(ph6.1)20ml中，添加用2mmol/l磷酸緩沖液(ph6.1)溶解為620μg/ml的klh(西格瑪公司制)1ml，在室溫下攪拌10分鐘。在該膠體金與klh的混合液中，添加10％牛血清白蛋白(bsa)水溶液1ml，在室溫下攪拌5分鐘。然后，在10℃下以11900×g離心45分鐘。除去上清后，在得到的沉渣中添加上述綴合物稀釋液1ml而將綴合物懸浮，從而得到klh綴合物。

2)綴合物墊的制作

在上述1)中制備的抗h-fabp抗體綴合物中，添加作為添加劑的硫酸鎂(30mmol/l、50mmol/l)、醋酸鎂(30mmol/l、50mmol/l)、硫酸銨(30mmol/l)。需要說明的是，各添加劑的濃度為終濃度。

按照含有這些添加劑的抗h-fabp抗體綴合物達(dá)到3od/ml、klh綴合物達(dá)到0.75od/ml的方式與分別含有2.5％neoproteinsaver、2.4％乳糖的tris-鹽酸緩沖液混合，從而制作綴合物溶液，使一定體積的玻璃纖維制墊(日本pallcorporation、no.8964)中滲入該墊體積的1.2倍容量。在烘箱內(nèi)在70℃加熱45分鐘而使其干燥，從而形成綴合物墊。另外，在根據(jù)需要添加增敏劑等添加劑的情況下，在前述綴合物溶液中添加必要量，然后進(jìn)行同樣的操作。

另外，獨立于上述(a)試驗地，將作為添加劑的硫酸鎂變更為10mmol/l的濃度，除此以外，使用與上述相同的方法制作綴合物墊。另外，還制作了無添加劑的綴合物墊(以往處方)(b)。

3)抗h-fabp單克隆抗體固定化膜(抗體固定化膜)的制作

用含有2.5％蔗糖的10mmol/l磷酸緩沖液(ph7.2)按照抗h-fabp單克隆抗體(clone#87203)達(dá)到3mg/ml的方式進(jìn)行稀釋、制備，另外，為了使對照線顯色，用含有2.5％蔗糖的10mmol/l磷酸緩沖液(ph7.2)按照兔抗klh多克隆抗體(bethyl公司制)達(dá)到0.5mg/ml的方式進(jìn)行稀釋、制備，使用免疫色譜用涂抹器“xyz3050”(biodot公司)并以達(dá)到1μl/cm的方式設(shè)定，從而在硝酸纖維素膜(merck公司、hf180、260mmx25mm)短邊的一端的內(nèi)側(cè)位置將上述抗h-fabp單克隆抗體涂布成線狀，在與該位置隔著約5mm的間隔的位置將抗klh多克隆抗體涂布成線狀。在烘箱內(nèi)在70℃干燥45分鐘，形成抗體固定化膜。

4)樣品墊的制作

將玻璃纖維制墊(lydall公司)適宜地裁成必要的大小，使其滲入該墊體積的1.15倍容量的含有1％聚凝胺的與綴合物墊相同的緩沖液(或純化水)，在烘箱內(nèi)在70℃干燥45分鐘后作為樣品墊來使用。

5)免疫色譜用測試條的制作

在塑料制粘合片(a)上貼合上述抗體固定化膜(b)，在展開上游部側(cè)按照抗h-fabp抗體(c)、而后是抗klh抗體(d)的順序來配置涂布部，進(jìn)而安裝血細(xì)胞分離膜(3rdpad)(e)。然后，配置安裝上述2)中制作的綴合物墊(f)，進(jìn)而按照與該綴合物墊重疊的方式配置安裝上述4)中制作的樣品墊(g)，在相反側(cè)的端部配置安裝吸收墊(h)。將使各構(gòu)成要素如此重疊而成的結(jié)構(gòu)物切斷，從而制作出免疫色譜用測試條。該測試條在分析時收納、搭載于塑料性的專用殼體(具有樣品添加窗部和檢測窗部，圖2中未示出)，形成免疫色譜測試設(shè)備的形態(tài)。圖2中示出免疫色譜用測試條的構(gòu)成示意圖。

6)基于免疫色譜法的測定

將被檢體120μl添加到上述制作的免疫色譜測試設(shè)備的樣品墊窗部，10分鐘后，對于測試設(shè)備，用免疫色譜讀取儀(immunochromato-reader)rapidpia(hamamatsuphotonics公司)來測定抗h-fabp抗體涂布部(檢測部)的反射光強(qiáng)度。由反射強(qiáng)度算出h-fabp的濃度。

2.基于ltia法的測定

基于ltia法的測定使用ltia法測定用試劑liblia(注冊商標(biāo))h-fabp(dspharmabiomedicalco.，ltd.lot.s1kh06)并通過自動分析裝置、日立7170(日立制作所)來進(jìn)行。需要說明的是，操作按照libliah-fabp所附文件和日立7170的操作說明書來進(jìn)行。得到了利用前述自動分析裝置定量了的各被檢體的h-fabp濃度。

3.被檢體

就采血時通過添加有肝素的采血管采集的血漿被檢體(在本實施例和以下的實施例中簡稱為含肝素的被檢體)而言，在(a)的試驗中使用24個樣品，在(b)的試驗中使用17個樣品，此外，就采血時通過添加有edta的采血管采集的血漿被檢體(本實施例和以下的實施例中也簡稱為含edta的被檢體)而言，在(a)的試驗中使用22個樣品，在(b)的試驗中使用29個樣品。

4.試驗結(jié)果

對于各被檢體，將y軸設(shè)為通過免疫色譜得到的h-fabp濃度、將x軸設(shè)為通過ltia法得到的h-fabp濃度而進(jìn)行作圖，示出各添加劑對2個測定法的相關(guān)性帶來的影響。將結(jié)果示于圖3。

在以往方法即不添加添加劑的情況下，含edta的被檢體與含肝素被檢體相比來說值變低，與此相對，在添加添加劑時，在任一情況下，含edta的被檢體與含肝素的被檢體的相關(guān)性與以往方法的與含肝素的被檢體的相關(guān)性相比來說均顯示出更為接近的相關(guān)性。

在免疫色譜法中，在以往處方即無添加劑時，含edta的被檢體與含肝素的被檢體相比來說值變低，與此相對，添加有本發(fā)明的添加劑的處方在任一情況下如上所述的含edta的被檢體的值變低的問題都被解決，含edta的被檢體、含肝素的被檢體在與ltia法的相關(guān)方面均顯示出同樣的相關(guān)性。

〔實施例3〕本發(fā)明的添加劑處方與以往處方的檢測靈敏度的比較

1.免疫色譜設(shè)備的制作

關(guān)于上述實施例2的1.的2)綴合物墊的制作方法的(a)中的添加劑，按照通過同樣的方法使硫酸鎂達(dá)到30mmol/l或50mmol/l、醋酸鎂達(dá)到30mmol/l或50mmol/l、硫酸銨達(dá)到30mmol/l的濃度的方式，制作含有各添加劑的綴合物墊和無添加劑的綴合物墊(以往處方)(a)。

另外，將硫酸鎂變更為10mmol/l或50mmol/l、氯化鎂變更為50mmol/l的濃度，除此以外，與上述方法同樣地制作含有各添加劑的綴合物墊和無添加劑的綴合物墊(以往處方)(b)。

在(a)、(b)中任一情況下，除了綴合物墊的制作方法以外，與實施例2同樣地制作出免疫色譜設(shè)備。其中，(b)的情況下還制作了不含添加劑和聚凝胺的設(shè)備。

2.被檢體

就含肝素的被檢體而言，在(a)的試驗中使用24個樣品，在(b)的試驗中使用17個樣品(其中，硫酸鎂50mmol/l和氯化鎂50mmol/l的情況下，僅10個樣品)，此外，就含edta的被檢體而言，在(a)的試驗中使用22個樣品；在(b)的試驗中使用29個樣品。

3.試驗方法

與實施例2同樣地，將被檢體120μl添加到上述制作的免疫色譜測試設(shè)備的樣品墊窗部，10分鐘后，對于測試設(shè)備，使用免疫色譜讀取儀rapidpia(hamamatsuphotonics公司)來測定抗h-fabp抗體涂布部(檢測部)的反射光強(qiáng)度。將各被檢體的不添加添加劑的設(shè)備的反射光強(qiáng)度設(shè)為100％，算出與添加了各添加劑的設(shè)備的反射光強(qiáng)度之比，求出該比的平均值。

4.試驗結(jié)果

將結(jié)果示于圖4。

添加了任一添加劑的設(shè)備中，對含edta的被檢體進(jìn)行測定時，與無添加劑的設(shè)備相比，反射光強(qiáng)度均增加((a)：122.1％～128.5％、(b)：118.6％～126.9％)。另外，在含肝素的被檢體的情況下，在添加了硫酸鎂、醋酸鎂、硫酸銨的設(shè)備中確認(rèn)到一定的反射光強(qiáng)度的增加((a)：102.6％～110.4％、(b)：硫酸鎂10mmol/l為100.5％、硫酸鎂50mmol/l為102.9％)。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

根據(jù)本發(fā)明，在以聚凝胺為紅細(xì)胞凝集劑且使用膠體金綴合物作為檢測試劑的免疫色譜中，通過使用特定的添加劑，可以不使膠體金凝集，并且可使紅細(xì)胞凝集而從樣品中分離除去，因此能夠?qū)悠分械膶ο笪餃?zhǔn)確地進(jìn)行檢測和測定。另外，由于作為聚凝胺的中和劑的聚陰離子的添加并非必須，因此能夠使試劑構(gòu)成極大地簡化。

符號說明

(a)塑料制粘合片

(b)抗體固定化膜

(c)抗h-fabp抗體

(d)抗klh抗體

(e)血細(xì)胞分離膜(3rdpad)

(f)綴合物墊

(g)樣品墊

(h)吸收墊