25-羥基維生素d定量檢測試紙條及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種25-羥基維生素D定量檢測試紙條及其應(yīng)用，屬于醫(yī)用試劑領(lǐng)域。本發(fā)明提供的試紙條包括樣本墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊和PVC襯板，所述樣本墊上包被有25-OH VD活化的乳膠微粒和/或1，25-(OH)2VD活化的乳膠微粒，所述結(jié)合墊上涂布有膠體金標(biāo)記的抗25-OH VD單克隆抗體及抗VDBP單克隆抗體，所述NC膜依次包括T線和C線，所述T線上包被有25-OH VD-BSA和部分表達(dá)的人VDBP，所述C線上包被有羊抗鼠抗體。采用本發(fā)明試紙條，無需樣本預(yù)處理，能夠快速、準(zhǔn)確測定樣品中維生素D的含量。
【專利說明】25-哲基維生素D定量檢測試紙條及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種25-哲基維生素D定量檢測試紙條及其應(yīng)用，屬于醫(yī)藥制劑領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著研究的不斷深入，人們對維生素D(VD)有了更多的認(rèn)識，VD是所有生 物活性物質(zhì)中一個(gè)非常獨(dú)特的成員，具有多種作用，它是維生素，但本質(zhì)上是激素，還可能 是細(xì)胞因子。因?yàn)閂D是來源于食物的必需營養(yǎng)物，而且人體需要量非常小，所W說它是維 生素。它主要是在紫外線的照射下從皮膚內(nèi)的7-脫氨膽固醇轉(zhuǎn)變而來，然后隨血液運(yùn)行到 全身發(fā)揮作用，所W屬于類固醇類激素。人們逐漸認(rèn)識到它具有更廣泛的生理作用，除了調(diào) 節(jié)巧磯代謝外，還具有抗增殖、抗分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡、介導(dǎo)免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)多種內(nèi)分泌腺激 素的分泌、調(diào)節(jié)造血組織造血的作用。該些功能是VD的類似物骨S醇（1，25-(0H)2VD)通過 與具有VD受體（VDR)的細(xì)胞相結(jié)合并經(jīng)過一系列生理生化過程而起作用的。該些腎外來 源的骨S醇，作用于細(xì)胞周圍的某一部位，所W按照其作用也可W認(rèn)為是一種細(xì)胞因子。無 論如何，VD及其類似物在臨床上的重要意義越來越受到人們的重視，如何更加科學(xué)合理使 用將是我們現(xiàn)在面臨的重要課題。
[0003] 維生素D是一種必須經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)變才能達(dá)到最佳巧化醇生物活性的脂溶性類固 醇衍生物。皮膚合成的維生素D3或小腸吸收的維生素D由維生素D結(jié)合蛋白（vitamin D binding protein, VDB巧運(yùn)輸，需在肝臟25-哲化酶CYP2R1和腎臟1 a -哲化酶 CYP27B1的催化下經(jīng)2次酶促經(jīng)化反應(yīng)形成最終的活性代謝產(chǎn)物1，25 -二哲基維生素 03(1，化-(0H)2VD)，與維生素D受體（vitamin D rec巧tor，VDR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能。VDBP 由肝臟合成，分子量為51335,含有458個(gè)氨基酸殘基，與維生素D具有高度親和力。每個(gè) VDBP分子都含有一個(gè)VD結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合氨基酸位點(diǎn)為35-49氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域。 因此，在血液中，VDBP存在兩種形式，即與VD及其代謝物親和結(jié)合的結(jié)合型VDBP (占VDBP 總量的5% )和VD結(jié)合位點(diǎn)空缺的游離型VDBP。
[0004] 人體的維生素D的活性形式是1，25二哲維生素D3 (1, 25-hy化oxyvitamin D3)，是 因?yàn)樗窃?位和25位有兩個(gè)哲基，其中25哲化是在肝臟完成的，1哲化是在腎臟完成的， 而25哲VD3可W作為機(jī)體缺乏VD的指示指標(biāo)。VD的主要功能是促進(jìn)小腸巧磯的吸收，促 進(jìn)腎臟對巧磯的重吸收，調(diào)節(jié)體內(nèi)巧磯代謝。所W，缺乏VD即使膳食中巧的量足夠多，也會 有缺巧現(xiàn)象的。不過，VD不易缺乏，因?yàn)槿梭w內(nèi)是可W合成的，曬曬太陽就行了，但是有嚴(yán) 重肝、腎疾病的人就例外了，因?yàn)樯鲜龅腣D3的哲化過程無法進(jìn)行。
[0005] 1，25(0H)2VD在體內(nèi)的半衰期大約是化，其濃度比25-0H VD低約1000倍，并受血 清PTH、Ca2+及磯酸鹽濃度的嚴(yán)格調(diào)控。1，25(0H) 2VD水平不能反映人體維生素D狀態(tài)，但是 其升高與甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)有關(guān)。因此，測定血清1，25 (0H) 2VD含量對獲得性或遺傳性25-0H VD和磯酸鹽代謝素亂（如慢性腎病、遺傳性磯酸鹽缺乏素亂、腫瘤引起的骨軟化、缺乏性何 償病、慢性肉芽腫形成障礙）輔助診斷有重要價(jià)值。
[0006] 目前，用于血清1，25 (0H)2VD測定方法有HPLC、LC-MS/MS、RIA、化IA等方法，其中 由于HPLC、LC-MS/MS樣本處理難、檢測成本高等原因，在臨床應(yīng)用較少。目前，由于側(cè)向?qū)?析技術(shù)的靈敏度高、特異性好、操作簡便、檢測成本低等特點(diǎn)，應(yīng)用越來越廣。
[0007] 側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)，按其原理可分為兩類，一類是W酶促反應(yīng)顯色為基礎(chǔ)，W顯色高度 來定量；另一類則使用著色標(biāo)記物如乳膠微粒、膠體砸、膠體金W及脂質(zhì)體等，層析時(shí)，標(biāo)記 物與待測物反應(yīng)形成的復(fù)合物被相應(yīng)的固定在層析材料上的配體捕獲而富集顯色，根據(jù)層 析材料上顯色條帶的有無或多少來定性或定量。W酶促反應(yīng)顯色為基礎(chǔ)的免疫層析技術(shù)由 于待測物的定量是W試紙條上W酶活性為依據(jù)，故其測量結(jié)果受酶穩(wěn)定性W及樣品基質(zhì)、 抑值、溫育時(shí)間和溫度等環(huán)境因素的影響。
[000引免疫膠體金技術(shù)是繼=大標(biāo)記技術(shù)（巧光素、放射性同位素和酶）后發(fā)展起來的 固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。80年代出現(xiàn)在臨床診斷領(lǐng)域的膠體金免疫層析（colloidal gold immunoc虹omatography assay, GICA)快速診斷試紙條是建立在金標(biāo)免疫滲濾基礎(chǔ)上的一 種免疫檢測技術(shù)。它具有簡單快速、結(jié)果明確、無需復(fù)雜操作技巧和特殊設(shè)備、靈敏度高、攜 帶方便等優(yōu)點(diǎn)，己成為臨床實(shí)驗(yàn)診斷領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)新方向。因此，開發(fā)25-哲基維生素D 測試試紙條在維生素D缺乏癥的輔助診斷中有重要價(jià)值。
[0009] 但是，在血清中80%w上25-0H VD與VDBP結(jié)合，通常的免疫檢測方法是利用樣本 預(yù)處理液（如有機(jī)溶劑等蛋白變性劑）處理，將25-0H VD從VDBP解離釋放后測定；或采用 酸性的反應(yīng)體系（pH4. 0-6. 0)進(jìn)行測定；或采用高濃度的VDBP親和結(jié)合物競爭釋放25-0H VD，該些方法存在樣本稀釋過程或25-0H VD釋放不完全或親和結(jié)合物的親和性等因素限 審IJ。因此，研發(fā)一種無需樣本預(yù)處理、檢測結(jié)果準(zhǔn)確的25-哲基維生素D含量測定方法成為 目前的難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 根據(jù)上述領(lǐng)域的不足和需求，本發(fā)明提供一種W 25-哲基維生素D為目標(biāo)物的檢 測試紙條，所述試紙條利用側(cè)向?qū)游鲈?，無需樣本前處理，直接測定樣本中25-0H VD的含 量。
[0011] 本發(fā)明請求保護(hù)的技術(shù)方案如下：
[0012] 一種用于25-哲基維生素D定量檢測的試紙條，包括樣本墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊 及PCV襯板；所述樣本墊、結(jié)合墊、NC膜和吸水墊按樣品層析方向依次設(shè)置于PCV襯板上；
[0013] 其特征在于；所述樣本墊采用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且可W捕獲粒徑為2. 0-2. 6 ym之間 的顆粒物的纖維墊，且包被有25-哲基維生素D活化的乳膠微粒和/或1，25-二哲基維生 素D活化的乳膠微粒；
[0014] 所述結(jié)合墊上涂布有膠體金標(biāo)記的抗25-哲基維生素D單克隆抗體和膠體金標(biāo)記 的抗人維生素D結(jié)合蛋白單克隆抗體；
[0015] 所述NC膜上包括檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線靠近所述結(jié)合墊，包被有25-哲基 維生素D-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和重組人維生素D結(jié)合蛋白，所述質(zhì)控線靠近吸水墊，包被 有羊抗鼠抗體。
[0016] 所述樣本墊上25-哲基維生素D活化的乳膠微粒和/或1，25-二哲基維生素D活 化的乳膠微粒的包被濃度為0. 5-10 y g/cm2。
[0017] 所述結(jié)合墊上膠體金標(biāo)記的抗25-哲基維生素D單克隆抗體的濃度為0-10 y 1/ cm2;所述膠體金標(biāo)記的抗人維生素D結(jié)合蛋白單克隆抗體的濃度為0-10 y 1/cm 2。
[001引所述NC膜的檢測線上25-哲基維生素D-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的包被濃度為 1. 0-2. 0 y g/條，所述重組人維生素D結(jié)合蛋白的包被濃度為0-2. 0 y g/條；所述質(zhì)控線上 羊抗鼠抗體的包被濃度為0. 5-2. 0 y g/條。
[0019] 所述重組人維生素D結(jié)合蛋白為具有人維生素D結(jié)合蛋白第159-458位氨基酸序 列的多膚。
[0020] 所述樣本墊上25-哲基維生素D活化的乳膠微粒和/或1，25-二哲基維生素D活 化的乳膠微粒的包被濃度為2. 0 y g/cm2;所述結(jié)合墊上膠體金標(biāo)記的抗25-哲基維生素D 單克隆抗體的濃度為10 y 1/cm2,所述膠體金標(biāo)記的抗人維生素D結(jié)合蛋白單克隆抗體的濃 度為10 y 1/cm2;所述NC膜的檢測線上25-哲基維生素D-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的包被濃度 為1. 0 y g/條，所述重組人維生素D結(jié)合蛋白的包被濃度為1. 0 y g/條；所述質(zhì)控線上羊抗 鼠抗體的包被濃度為0. 8 y g/條。
[0021] 一種用于25-哲基維生素D定量檢測的方法，其特征在于：采用任一所述的試紙條 檢測樣品中25-哲基維生素D的總含量，其步驟如下：
[0022] (1)將待測樣品滴加在樣本墊上，室溫反應(yīng)15min ;
[002引 （2)待質(zhì)控線顯色后，將試紙條放入讀條儀，讀取樣品中25-OH VD的濃度。
[0024] 一種用于25-哲基維生素D定量檢測的檢測卡，包含任一所述的試紙條及卡盒，其 特征在于；所述卡盒包括盒蓋和盒底；所述試紙條設(shè)置于所述卡盒的盒底；所述卡盒的盒 蓋上具有加樣孔和觀察窗，所述加樣孔正對所述試紙條上的樣本墊，所述觀察窗正對所述 試紙條上的檢測線和質(zhì)控線。
[0025] 本發(fā)明基于固相分離技術(shù)與免疫側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)提供一種用于25-哲基維生素 D(25-0H VD)定量檢測的試紙條，包括樣本墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊及PCV襯板等結(jié)構(gòu)。所 述試紙條采用特別的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)，無需樣本前處理，直接測定樣本中25-OH VD的總含量。
[0026] 本發(fā)明試紙條的樣本墊為具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的纖維墊，可W捕獲粒徑為2. 0-2.6 ym 之間的顆粒物，其上包被有25-哲基維生素D活化的乳膠微粒（LP-25-OH VD)和/或1， 25-二哲基維生素D活化的乳膠微粒（LP-1，25- (OH) 2VD)。所述LP-25-OH VD為25-OH VD-BSA與活性乳膠微粒（L巧通過1-(3-二甲基氨基丙基）-3-己基碳二亞胺巧DC)法共價(jià) 偶聯(lián)而得。所述樣本墊可W捕獲樣本中游離的VDBP，使游離型VDBP與結(jié)合型VDBP分離。 其原理是具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的樣本墊固定的VDBP親和結(jié)合物（如25-OH VD)活化的乳膠微粒 利用層析原理競爭釋放25-OH VD，VDBP與25-OH VD親和力較高化a = 5X 108M-i)且VDBP 高濃度存在（18?65 y g/L)，而競爭結(jié)合物不能完全釋放25-OH VD，從而捕獲游離型VDBP， 而結(jié)合型VDBP和游離的25-OH VD繼續(xù)向前（吸水墊方向）泳動。
[0027] 本發(fā)明試紙條的結(jié)合墊上涂布有膠體金（Colloidal Gold, CG)標(biāo)記的抗25-哲 基維生素D單克隆抗體（CG-anti-25-OH VD)和膠體金標(biāo)記的抗人維生素D結(jié)合蛋白單克 隆抗體（CG-anti-VDBP)。所述CG-anti-25-OH VD可W與樣本中游離的25-0H VD結(jié)合， CG-anti-VDBP可W與樣本中的人VDBP結(jié)合。
[002引本發(fā)明試紙條的NC膜上從左至右依次包括檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），所述T 線上包被有25-0H VD-BSA和重組人VDBP (rProtein)，所述25-0H VD-BSA能夠與樣本中游 離的 25-冊 VD 競爭結(jié)合 CG-anti-25-OH VD，形成 25-0H VD-BSA-CG-anti-25-OH VD 復(fù)合物， 該復(fù)合物的量與樣本中游離的25-OH VD含量相關(guān)；所述重組人VDBP為部分表達(dá)的人VDBP， 缺少VD結(jié)合域氨基酸序列，因此不能與25-哲基維生素D結(jié)合，能夠與樣本中結(jié)合型VDBP 競爭結(jié)合CG-anti-VDBP，形成巧rotein-CG-anti-VDBP復(fù)合物，該復(fù)合物的量與樣本中結(jié) 合型25-0H VD的含量相關(guān)。所述C線上包被有羊抗鼠抗體，該抗體能夠與CG-anti-25-OH VD和CG-anti-VDBP結(jié)合，用W判定結(jié)果的有效性，顯色為有效，無色為無效。
[0029] 本發(fā)明試紙條的吸水墊和PCV襯板，分別為試紙條提供層析泳動動力、支撐和保 護(hù)。
[0030] 本發(fā)明試紙條檢測樣本中維生素D含量的原理是；游離的25-0H VD與NC膜T 線上的包被物25-0H VD-BSA競爭結(jié)合CG-anti-25-OH VD，結(jié)合了游離型25-0H VD的 CG-anti-25-OH VD繼續(xù)向前泳動，與NC膜C線上的包被物羊抗鼠抗體結(jié)合；結(jié)合型VDBP與 T線上的包被物重組人VDBP競爭結(jié)合CG-anti-VDBP，結(jié)合了結(jié)合型VDBP的CG-anti-VDBP 繼續(xù)向前泳動，與C線包被物羊抗鼠抗體結(jié)合。此法為競爭法，即樣本中25-0H VD含量 越高，結(jié)合在T線上的CG-anti-25-OH VD和CG-anti-VDBP越少，顯色越淺，吸光度越低， 反之則越高，由T線顯色的深淺即可判定VD的含量。而C線結(jié)合CG-anti-25-OH VD和 CG-anti-VDBP僅作為有效性判定，顯色則有效，反之則無效。由于1，25-(0H)2VD與25-0H VD的結(jié)構(gòu)極其相似，因此本發(fā)明25-0H VD試紙條測定的結(jié)果為1，25-(0H)2VD和25-0H VD 的總含量，但是由于1，25-(0H)2VD在血液中的濃度遠(yuǎn)低于25-0H VD，因此對25-0H VD測定 結(jié)果的影響可W忽略。
[0031] 為了提高本發(fā)明試紙條檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確度，發(fā)明人從樣本墊包被物、樣本墊包被 物的濃度、結(jié)合墊上膠體金標(biāo)記抗體的濃度及包被量、T線蛋白種類及包被量等方面進(jìn)行 了優(yōu)化。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述樣本墊包被物優(yōu)選LP-25-0H VD和/或LP-1， 25-(0H)2VD，包被濃度為2. 0 y g/cm2;所述結(jié)合墊上CG-anti-25-OH VD的濃度為10 y 1/ cm2,所述CG-anti-VDBP的濃度為10 y 1/cm2;所述NC膜T線上25-0H VD-BSA的包被濃度 為1. 0 y g/條，所述重組人VDBP的包被濃度為1. 0 y g/條，所述質(zhì)控線上羊抗鼠抗體的包 被濃度為0.8 yg/條。
[0032] 本發(fā)明還提供一種用于25-哲基維生素D定量檢測的方法，采用本發(fā)明提供的試 紙條進(jìn)行檢測，只需將少量樣品滴加在樣本墊上，室溫下放置15min，待質(zhì)控線顯色后，將 試紙條放入讀條儀，讀條儀讀取檢測線和質(zhì)控線的吸光度后自動代入儀器預(yù)設(shè)的校準(zhǔn)曲線 (四參數(shù)擬合）進(jìn)行計(jì)算，直接給出25-哲基維生素D的濃度。該方法無需進(jìn)行樣本前處 理，操作簡便，定量快速準(zhǔn)確，便于臨床VD含量的測定。
[0033] 綜上所述，本發(fā)明提供的用于25-哲基維生素D定量檢測的試紙條能夠快速、準(zhǔn)確 的檢測樣品中維生素D的含量。與現(xiàn)有的檢測方法相比，采用本發(fā)明試紙條進(jìn)行VD含量檢 測具有W下優(yōu)點(diǎn)；（1)操作簡便；由于血液中80%W上25-0H VD與VDBP結(jié)合，常規(guī)方法需 要進(jìn)行樣本預(yù)處理，使25-0H VD暴露后進(jìn)行檢測，而本發(fā)明試紙條采用兩種抗體分別捕獲 游離型25-0H VD和結(jié)合型25-0H VD，無需樣本預(yù)處理，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約了時(shí)間；（2) 定量準(zhǔn)確；普通試紙條如果不進(jìn)行樣本預(yù)處理，只能檢測到游離的25-0H VD，而本發(fā)明試紙 條可W同時(shí)檢測游離型和結(jié)合型25-0H VD，準(zhǔn)確性高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1.本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1-PVC襯板，2-樣本墊，3-結(jié)合墊，4-T線， 5-NC膜，6-C線，7-吸水墊；
[0035] 圖 2. Protein 與 anti-VDBP、25_OH VD 結(jié)合能力；
[0036] 圖3. NC膜T/C線包被示意圖；
[0037] 圖4.本發(fā)明試紙條檢測結(jié)果與IDS試劑盒檢測結(jié)果的直線擬合。

【具體實(shí)施方式】
[003引 W下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行解釋，需要說明的是，下述實(shí)施例僅作為對本 發(fā)明的進(jìn)一步解釋和說明，而不W任何方式限制本發(fā)明。
[0039] 試驗(yàn)所用試劑：
[0040] 活性乳膠微粒（Latex Particle):其顆粒表面具有活性基團(tuán)可W與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié) 合，購于Merck公司，貨號39510001。
[004U 25-0H VD-BSA ;即25-0H VD與BSA通過共價(jià)鍵偶聯(lián)獲得的偶聯(lián)物，購于上?；菟?生物。
[0042] 1，25-(0H)2VD-BSA ;即1，25-(0H)2VD與BSA通過共價(jià)鍵偶聯(lián)獲得的偶聯(lián)物，購于 上?；菟股铩?br> [0043] 25mM MES(2-(N-嗎咐基）己橫酸（sigma，M367l)緩沖液：稱取4. SSg MES于 9〇OmL 超純水中，完全溶解后調(diào)節(jié)抑5.0,定容至1L。
[0044] 邸C(l-(3-二甲基氨基丙基）-3-己基碳二亞胺）溶液；sigma, 39391。
[0045] pH7. 510mM PBS ;稱取0. 27g磯酸二氨鐘（KH2PO4)(國藥，10017608)、1. 42g磯酸氨 二鋼（化2冊04)(國藥，100203008)，8g氯化鋼（化Cn)(國藥，10019308)、0. 2g氯化鐘化Cl) (國藥，10016308)于900mL超純水中，完全溶解后調(diào)節(jié)pH至7. 5,然后用容量瓶定容至1L。
[0046] lOmM Tris-HCl ;稱取1. 576g(國藥，XW020034)于900血超純水中，完全溶解后調(diào) 節(jié)到所需的抑值，然后定容至1L。
[0047] 1 %巧樣酸緩沖液：稱取l.Og巧樣酸S鋼（國藥，10019428)于100血超純水中， 至完全溶解。
[0048] 5% BSA ;稱取 5g BSA(amresco,0332)于 100ml PBS 溶液中，至完全溶解。
[0049] TBS ;50mM Tris -肥l，150mM 化Cl，l. 5mM 邸TA'lOmM DTT，0. 5% Triton X-100， 0. 2mg/ml lysozyme，pH 7. 4。
[0050] 2M肥S04 ;取100血濃硫酸于800ml超純水中。
[0051] Anti-VDBP ;抗人 VDBP 單克隆抗體，購于公司 Santa cruz，貨號 SC-365441。
[0052] Anti-25-OH VD ;即抗25-哲基維生素D抗體，一種可W與25-0H VD親和結(jié)合的免 疫球蛋白，購于Meridian,貨號K24124M。
[0053] 讀條儀；C10066-10,濱松。
[0化4] 纖維墊：用作樣本墊，化sion5, GE。
[0化5] 本發(fā)明未特別說明的實(shí)驗(yàn)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法配制 或商購獲得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)室純級即可。
[0化6] 實(shí)施例1、25-哲基維生素D定量檢測試紙條的制備 [0057] (一）VDBP重組蛋白的表達(dá)及驗(yàn)證
[0化引巧rotein重組蛋白即人VDBP部分序列159-458氨基酸通過GST融合蛋白的表達(dá) 方式在E. coli系統(tǒng)表達(dá)（表達(dá)載體是陽T28a，采用的E. coli細(xì)胞是化21 0E3)，購于北京 全式金生物技術(shù)有限公司）。細(xì)菌在含有l(wèi)OOmg/ml氨節(jié)西林（23YT-Amp)的LB培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，37°C過夜培養(yǎng)后W 1:10比例放大培養(yǎng)。當(dāng)菌液濃度（A600)達(dá)到0. 8-0. 9時(shí)，加入 0. 5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。25°C培養(yǎng)12-1化后，離屯、收集菌體并用TBS緩沖液重懸。超聲 破碎細(xì)菌液，40w，10s，10s，50次；12000巧111，41：離屯、15min，收集上清液。采用GE GSTrap FF純化柱佑E，71-5016-96AK)進(jìn)行蛋白純化，蛋白濃度用A280/A260進(jìn)行測定。
[0059] 用anti-VDBP和25-0H VD-BSA分別包被微孔板（購于深圳金燦華），1. Oug/ ml(pH7. 510mM PBS)，lOOul/孔。37°C條件下放置2小時(shí)后，棄去孔內(nèi)液體，加入5% BSA， 150ul/孔。37°C條件下放置1小時(shí)后，棄去孔內(nèi)液體，待用。
[0060] 將不同濃度的巧rotein加入上述微孔板中，lOOul/孔，37°C解育1小時(shí)；然后 棄去孔內(nèi)液體，用PBST(pH7. 510mM PBS含0. 05% Tween-20)洗板5次，加入HRP標(biāo)記的 抗GST抗體（購于北京義翅神州，11213-MM05 ;用PBST W 1:10000的比例稀釋），l〇〇ul/ 孔，37°C解育0.5小時(shí)；然后棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗板5次，加入底物（購于北京索萊 寶，PR1200) 100ul/孔，37°C解育10分鐘后加入2M肥S04終止液，50ul/孔，測定其吸光度 (A450nm)。
[00W] 結(jié)果如圖2所示，重組蛋白巧rotein可W與anti-VDBP結(jié)合，而不與25-0H VD結(jié) 厶 口 〇
[00創(chuàng)（二）25-0H VD活化的乳膠微粒的制備
[0063] 1、乳膠微粒（LP)的活化
[0064] 取Img乳膠微粒，用1血25mM MES (抑5. 0)緩沖液洗漆3次（每次混勻lOmin);
[00化] (1)配制 lOmg/mL EDC(M = 191. 7g/mol，C = 52mM)溶液巧DC 溶解于冷的 25mM MES，抑5. 0)。
[0066] 0)將 Latex Particle 用 440 y L 25mM MES (抑5. 0)重懸。
[0067] 做加入10 y L EDC溶液，充分混勻，緩慢振搖，30min，室溫。
[0068] (4)將反應(yīng)完成的離屯、管離屯、（3000rmp，5min)，去除上清，并用1血25mM MES，抑 5.0洗漆3次。
[0069] 2、Latex Particle 包被
[0070] (1)用 300 y L 25mM MES,抑 5. 0 重懸 Latex Particle ;
[007U (2)加入 lOul lOmg/ml 25-Hy化oxy Vitamin D3-BSA(上海惠斯生物）（25mM MES, 抑5. 0)溶液；
[007引 （3)用25mM MES,抑5. 0使反應(yīng)體系定容為500 y L，充分混勻；
[007引 （4)緩慢振搖，室溫30-120min或4°C 2小時(shí)；
[0074] 妨將反應(yīng)完成的離屯、管離屯、（3000rmp，5min)，去除上清。
[0075] 3、Latex Particle 洗漆和保存
[0076] (1)用 500 y L 25mM MES (pH 5. 0)洗漆 4 次；
[0077] (2)力口入 100 y L 0. 1-0. 5% BSA (amresco, 033。，3〇-60min，室溫；
[007引 做用 lOOyL 50mM Tris-肥l(pH 6. 8,含 1% Tween-20) (sigma，441。）洗漆 4 次，得25-OH VD活化的乳膠微粒（LP-25-0H VD);
[0079] (4)加入 1血 5% BSA 保存。
[0080] (S)金標(biāo)結(jié)合物的制備
[00川 （1)取100血0.01% HAuC14(國藥，10010711)溶液，加熱至沸騰。
[00間 似加入2. 0血1 %巧樣酸S鋼溶液，加熱攬拌15min。
[0083] (3)關(guān)掉加熱旋扭，適當(dāng)速度攬拌至室溫，得膠體金溶液（Colloidal Gold, CG)。
[0084] (4)量取20. OmL的膠體金置于100. OmL的小燒杯中，在攬拌的狀態(tài)下緩慢加入 0. 4mg 待標(biāo)記蛋白（如 anti-VDBP、anti-25-OH VD)，攬拌 30min。
[0085] (5)加入5 % BSA至終濃度為1 %，繼續(xù)攬拌30min。
[0086] (6) W 12000r/min 離屯、30min，棄去上清液，用 PBST 重懸。
[0087] (7) W 12000r/min 離屯、30min，棄去上清液，用 PBST 重懸。
[0088] (8) W 12000r/min離屯、30min，棄去上清液，沉淀用1% BSA重懸，得到1. 0血濃縮 物（即金標(biāo)結(jié)合物），置4°C冰箱備用。
[0089] (四）樣本墊、結(jié)合墊的預(yù)處理
[0090] (1)將樣品墊（化Sion 5,G巧和結(jié)合墊（上海金標(biāo)生物科技有限公司）用1% BSA 浸泡30min，37°C烘干。
[OOW] (2)將25-0H VD活化的乳膠微粒（LP-25-0H VD，2. Oug/cm2)涂布于樣本墊上，37°C 烘干。
[009引 （3)取金標(biāo)結(jié)合物滴加到結(jié)合墊上（l0uL/cm2)，37°C烘干。
[0093](五）T/C線（檢測線/質(zhì)控線）包被
[0094] C線（質(zhì)控線）；用Img/mL羊抗鼠抗體包被NC膜（135s，Millipore)C線（見圖 3a、圖 3b)，每條 1.0uL37°C干燥。
[0095] T線（檢測線）；將1. Omg/mL 25-哲基維生素D-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和1. Omg/mL 的重組人維生素D結(jié)合蛋白按照1 ;5的比例混合包被NC膜（135s，Millipore)(見圖3c、 圖3d)，每條包被1. 0 y g混合物，37 °C干燥。
[0096] (六）組裝試紙條
[0097] 將樣本墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊（C冊7M，上海金標(biāo)生物科技有限公司）、PVC襯板 (上海金標(biāo)生物科技有限公司）、卡盒（金燦華），由下到上，由內(nèi)到外進(jìn)行組裝（見圖1)。 [009引實(shí)施例2、樣本墊包被物的選擇
[0099] 通過優(yōu)選樣本墊包被物W提高本發(fā)明試紙條檢測系統(tǒng)的性能。根據(jù)測定結(jié)果，采 用2例臨床樣本（25-0H維生素D含量高值H、低值L)按照表1制備添加回收樣本，計(jì)算回 收率，選擇最優(yōu)的包被物。
[0100] 表1添加回收樣本制備方法
[0101]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于25-羥基維生素 D定量檢測的試紙條，包括樣本墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊 及PCV襯板；所述樣本墊、結(jié)合墊、NC膜和吸水墊按樣品層析方向依次設(shè)置于PCV襯板上； 其特征在于：所述樣本墊采用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且可以捕獲粒徑為2. 0-2. 6 ym之間的顆 粒物的纖維墊，且包被有25-羥基維生素 D活化的乳膠微粒和/或1，25-二羥基維生素 D 活化的乳膠微粒； 所述結(jié)合墊上涂布有膠體金標(biāo)記的抗25-羥基維生素 D單克隆抗體和膠體金標(biāo)記的抗 人維生素 D結(jié)合蛋白單克隆抗體； 所述NC膜上包括檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線靠近所述結(jié)合墊，包被有25-羥基維生 素 D-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和重組人維生素 D結(jié)合蛋白，所述質(zhì)控線靠近吸水墊，包被有羊 抗鼠抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，所述樣本墊上25-羥基維生素 D活化的乳膠微粒和 /或1，25-二羥基維生素 D活化的乳膠微粒的包被濃度為0. 5-10 y g/cm2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，所述結(jié)合墊上膠體金標(biāo)記的抗25-羥基維生素 D單 克隆抗體的濃度為0-10 U 1/cm2;所述膠體金標(biāo)記的抗人維生素 D結(jié)合蛋白單克隆抗體的 濃度為 0-10 u 1/cm2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，所述NC膜的檢測線上25-羥基維生素 D-牛血清 白蛋白偶聯(lián)物的包被濃度為1. 0-2. 0 y g/條，所述重組人維生素 D結(jié)合蛋白的包被濃度為 0-2. 0 y g/條；所述質(zhì)控線上羊抗鼠抗體的包被濃度為0. 5-2. 0 y g/條。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，所述重組人維生素 D結(jié)合蛋白為具有人維生素 D結(jié) 合蛋白第159-458位氨基酸序列的多肽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，所述樣本墊上25-羥基維生素 D活化的乳膠微粒和 /或1，25-二羥基維生素 D活化的乳膠微粒的包被濃度為2. 0 y g/cm2;所述結(jié)合墊上膠體 金標(biāo)記的抗25-羥基維生素 D單克隆抗體的濃度為10 y 1/cm2,所述膠體金標(biāo)記的抗人維生 素 D結(jié)合蛋白單克隆抗體的濃度為10 y 1/cm2;所述NC膜的檢測線上25-羥基維生素 D-牛 血清白蛋白偶聯(lián)物的包被濃度為1. 〇 u g/條，所述重組人維生素 D結(jié)合蛋白的包被濃度為
1. 〇 u g/條；所述質(zhì)控線上羊抗鼠抗體的包被濃度為〇. 8 y g/條。
7. -種用于25-羥基維生素 D定量檢測的方法，其特征在于：采用權(quán)利要求1-6任一 所述的試紙條檢測樣品中25-羥基維生素 D的總含量，其步驟如下： (1) 將待測樣品滴加在樣本墊上，室溫反應(yīng)15min ; (2) 待質(zhì)控線顯色后，將試紙條放入讀條儀，讀取樣品中25-OH VD的濃度。
8. -種用于25-羥基維生素 D定量檢測的檢測卡，包含權(quán)利要求1-6任一所述的試紙 條及卡盒，其特征在于：所述卡盒包括盒蓋和盒底；所述試紙條設(shè)置于所述卡盒的盒底；所 述卡盒的盒蓋上具有加樣孔和觀察窗，所述加樣孔正對所述試紙條上的樣本墊，所述觀察 窗正對所述試紙條上的檢測線和質(zhì)控線。
【文檔編號】G01N33/577GK104502599SQ201510005097
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】肖智, 焦守恕, 李全 申請人:同昕生物技術(shù)（北京）有限公司