一種化學(xué)衍生化方法及其在lc-ms法檢測(cè)核酸修飾中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種化學(xué)衍生化方法及其在LC-MS法檢測(cè)核酸修飾中的應(yīng)用。本發(fā)明使用2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮（BDAPE）對(duì)DNA中5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶的衍生化策略。在顯著改善了這些修飾核苷在反相液相色譜中的保留行為的同時(shí)，也極大地提高了它們?cè)谫|(zhì)譜中的檢測(cè)靈敏度。該方法靈敏度高、選擇性高、操作簡(jiǎn)便，且無(wú)需進(jìn)行繁瑣的樣品前處理，就可以定量檢測(cè)DNA中極低豐度的胞嘧啶修飾，可以應(yīng)用在分析疾病與5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶相互關(guān)系的研究中。
【專利說(shuō)明】-種化學(xué)衍生化方法及其在LC-MS法檢測(cè)核酸修飾中的應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種化學(xué)衍生化結(jié)合LC-MS的方法及其在DNA和RNA修飾分析中的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 在哺乳動(dòng)物的DNA中，胞喀晚5位會(huì)在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生甲基化修飾， 形成5-甲基胞喀晚巧-mC)。5-mC參與許多重要生物學(xué)過(guò)程，如基因組印跡、基因表達(dá)調(diào) 控等是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾。5-甲基胞喀晚可W被TET蛋白進(jìn)一步地連續(xù)氧化為 5-哲甲基胞喀晚巧-hmC)、5-醒基胞喀晚巧-foC)和5-駿基胞喀晚巧-caC)，形成新的修 飾。該些新發(fā)現(xiàn)的修飾成分與多種重要生理功能密切相關(guān)，例如細(xì)胞分化、細(xì)胞重編程、神 經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、疾病的發(fā)生與發(fā)展等等。正常人的DNA修飾水平是穩(wěn)定的，異常的DNA修飾水 平只會(huì)導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生，比如癌癥、老年癡呆癥、糖尿病等疾病。
[0003] 研究該些DNA修飾的生物學(xué)功能需要對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，然而該些DNA修 飾的豐度非常低，甚至每1〇 6個(gè)胞喀晚中還不到1個(gè)，并且DNA中其它大量的未修飾成分 (胞喀晚、腺嚷嶺、胸腺喀晚、鳥嚷嶺）化學(xué)結(jié)構(gòu)與修飾成分類似，在檢測(cè)該些修飾成分時(shí) 會(huì)對(duì)其造成嚴(yán)重干擾。所W上述兩點(diǎn)是導(dǎo)致定量分析DNA修飾十分困難的原因需要高靈 敏度、高選擇性且準(zhǔn)確的檢測(cè)方法?？墒悄壳叭狈δ芡瑫r(shí)定量分析胞喀晚全部四種修飾 巧-mC、5-hmC、5-;foC 和 5-caC)的方法。
[0004] LC-MS法本身具有很高的靈敏度和選擇性。在目前檢測(cè)DNA胞喀晚修飾的分析方 法中，其是最靈敏的方法。但是，直接用LC-MS法分析DNA修飾的靈敏度還是有限，在定量 分析前需要對(duì)DNA樣品中的修飾核巧進(jìn)行預(yù)先的HPLC富集純化處理，W消除大量未修飾核 巧對(duì)檢測(cè)的干擾，從而改善LC-MS法的檢測(cè)靈敏度。可是該種樣品預(yù)處理的方式操作繁瑣， 費(fèi)時(shí)費(fèi)力。并且若是不進(jìn)行HPLC的富集純化處理則LC-MS法的靈敏度可能不足W檢測(cè)到 基因組DNA中的5-foC或5-caC。因此，在DNA修飾分析中迫切需要發(fā)展一種新的、簡(jiǎn)便的、 高靈敏度、高選擇性、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種能應(yīng)用于DNA和RNA修飾檢測(cè)領(lǐng)域中，結(jié)合 化學(xué)衍生化策略的具有高靈敏度和高選擇性的LC-MS分析方法。本發(fā)明首先通過(guò)固相萃取 將DNA消解物中所含的四種修飾脫氧胞巧，即5-甲基脫氧胞巧巧-mdC)、5-哲甲基脫氧胞 巧巧-hmdC)、5-醒基脫氧胞巧巧-fodC)和5-駿基脫氧胞巧巧-cade)或RNA消解物中所含 的四種修飾胞巧，即5-甲基胞巧巧-mrC)、5-哲甲基胞巧巧-hmrC)、5-醒基胞巧巧-forC) 和5-駿基胞巧巧-care)脫鹽，然后用2-漠-l-(4-二甲氨基-苯基）-己酬炬DAP巧衍生 化標(biāo)記修飾的胞喀晚核巧，再用LC-MS定量分析該些經(jīng)過(guò)標(biāo)記的胞喀晚核巧。
[0006] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案具體如下：
[0007] 一種化學(xué)衍生化方法，包括w下步驟：
[000引 （1)首先用S1核酸酶、蛇毒磯酸二醋酶和堿性磯酸酶對(duì)核酸進(jìn)行消解，得到消解 液，除去酶；
[0009] (2)將石墨化碳黑填入固相萃取小柱，用去離子水活化后，將除酶后的消解液上樣 至固相萃取小柱中；然后用去離子水進(jìn)行清洗脫去鹽分，再用二氯甲燒、甲醇、濃氨水體積 比為6?8 ;2?4 ;0. 2?0. 5的解吸液進(jìn)行解析；然后在37°C下用氮?dú)鈱⒔馕鲆捍蹈?，?到固體殘留物；
[0010] 做將固體殘留物溶于己膳中，然后依次加入堿性催化劑和2-漠-l-(4-二甲氨 基-苯基）-己酬，混合均勻，形成反應(yīng)體系；反應(yīng)體系在50?70°C下避光震蕩反應(yīng)4? 16小時(shí)即成；所述的反應(yīng)體系中，胞喀晚核巧、堿性催化劑、2-漠-l-(4-二甲氨基-苯 基）-己酬的摩爾比為1 ;2000?16000 ;2500?100000,堿性催化劑的濃度為1?8mM， 2-漠-1-(4-二甲氨基-苯基）-己酬的濃度為1. 25?50mM。
[OCm] 所述步驟（1)中除去酶的方式為；將消解液裝入微型超濾膜中，在120(K)r/min的 速率下離屯、即除去S1核酸酶、蛇毒磯酸二醋酶和堿性磯酸酶。
[001引所述的解吸液中二氯甲燒、甲醇、濃氨水的體積比為6 ;4 ;0. 5。
[0013] 所述的堿性催化劑為叔錠類化合物、化晚、氨水或=己胺。
[0014] 所述步驟做中的振蕩速率為1500r/min。
[0015] 所述步驟（3)中的反應(yīng)溫度為60°C，反應(yīng)時(shí)間為6小時(shí)。
[0016] 所述的反應(yīng)體系中，胞喀晚核巧、堿性催化劑、2-漠-l-(4-二甲氨基-苯基）-己 酬的摩爾比為1 ;8000 ;8000，S己胺的濃度為4mM，2-漠-l-(4-二甲氨基-苯基）-己酬的 濃度為4mM。
[0017] 樣品衍生化完成后，樣品在37°C下用氮?dú)獯蹈?，然后?fù)溶于水中直接進(jìn)行反相液 相色譜-電噴霧質(zhì)譜分析。
[001引本發(fā)明所述的衍生化反應(yīng)是指含有漠己酬基的試劑與含胞喀晚的化合物之間的 成環(huán)反應(yīng)。本發(fā)明所采用的衍生化試劑2-漠-1-(4-二甲氨基-苯基）-己酬炬DA陽(yáng)），其 具有下列特征：
[0019] 1)具有漠己酬基團(tuán)，可W與含胞喀晚的化合物反應(yīng)，脫去一分子皿r和&0,形成 穩(wěn)定的5元環(huán)化學(xué)結(jié)構(gòu)，如下所示：
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 一種化學(xué)衍生化方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 首先用S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和堿性磷酸酶對(duì)核酸進(jìn)行消解，得到消解液，除 去酶； (2) 將石墨化碳黑填入固相萃取小柱，用去離子水活化后，將除酶后的消解液上樣至固 相萃取小柱中；然后用去離子水進(jìn)行清洗脫去鹽分，再用二氯甲烷、甲醇、濃氨水體積比為 6~8 :2~4 :0. 2~0. 5的解吸液進(jìn)行解析；然后在37°C下用氮?dú)鈱⒔馕鲆捍蹈?，得到固體殘留 物； (3) 將固體殘留物溶于乙腈中，然后依次加入堿性催化劑和2-溴-1-(4-二甲氨基-苯 基）-乙酮，混合均勻，形成反應(yīng)體系；反應(yīng)體系在50~70°C下避光震蕩反應(yīng)4~16小時(shí)即成； 所述的反應(yīng)體系中，胞嘧啶核苷、堿性催化劑、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基）-乙酮的摩爾 比為1 :2000~16000 :2500~100000,堿性催化劑的濃度為1~8 mM，2-溴-1-(4-二甲氨基-苯 基）-乙酮的濃度為1. 25~50 mM。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生化方法，其特征在于：所述步驟（1)中除去酶的方式 為：將消解液裝入微型超濾膜中，在12000r/min的速率下離心即除去S1核酸酶、蛇毒磷酸 二酯酶和堿性磷酸酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生化方法，其特征在于：所述的解吸液中二氯甲烷、甲 醇、濃氨水的體積比為6 :4 :0. 5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生化方法，其特征在于：所述的堿性催化劑為叔銨類 化合物、吡啶、氨水或三乙胺。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生化方法，其特征在于：所述步驟（3)中的振蕩速率為 1500r/min〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生化方法，其特征在于：所述步驟（3)中的反應(yīng)溫度為 60°C，反應(yīng)時(shí)間為6小時(shí)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生化方法，其特征在于：所述的反應(yīng)體系中，胞嘧啶核 苷、堿性催化劑、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基）-乙酮的摩爾比為1 :8000 :8000,三乙胺的 濃度為4 mM，2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基）-乙酮的濃度為4 mM。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生化方法，其特征在于：樣品衍生化完成后，反應(yīng)液在 37°C下用氮?dú)獯蹈?，所得固體復(fù)溶于水中直接進(jìn)行反相液相色譜-電噴霧質(zhì)譜分析。
9. 權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的化學(xué)衍生化方法在核酸修飾分析領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK104502492SQ201510018723
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月14日
【發(fā)明者】袁必鋒, 馮鈺锜, 唐陽(yáng) 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)