本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，特別涉及一種根據(jù)邁克爾加成反應(yīng)活性快速預(yù)測(cè)對(duì)映貝殼杉烯抗腫瘤活性方法。

背景技術(shù)：

邁克爾加成反應(yīng)（Michael addition reaction）是親電的共軛體系與親核的負(fù)電體系進(jìn)行的共軛親核加成反應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)，烯鍵或炔鍵與吸電子基團(tuán)（如羰基、氰基等）共軛相連形成的官能團(tuán)可構(gòu)成親電共軛體系，含有該共軛體系的化合物稱為邁克爾反應(yīng)受體分子。邁克爾反應(yīng)受體分子具有許多重要的藥理活性，如抗腫瘤活性，酶抑制活性，抗病毒活性，抗炎活性，醌還原酶誘導(dǎo)活性等。邁克爾反應(yīng)受體分子是一類重要的烷化劑，它能與細(xì)胞酶中半胱氨酸殘基的巰基或細(xì)胞上其它親核基團(tuán)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)形成共價(jià)鍵結(jié)合，從而產(chǎn)生重要的生物效應(yīng)，如抗腫瘤活性。對(duì)映貝殼杉烯二萜是一類具有顯著抗腫瘤活性的天然邁克爾反應(yīng)受體分子，如冬凌草甲素和冬凌草乙素等具有較廣譜的抗腫瘤活性，對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、人食管癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞等許多腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。目前，冬凌草甲素已作為一種重要的抗腫瘤新藥開(kāi)發(fā)。研究表明，絕大部分對(duì)映貝殼杉烯二萜的抗腫瘤活性與其D環(huán)中具有exo-亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)有關(guān)，其紫外可見(jiàn)光譜最大吸收波長(zhǎng)約240nm。該結(jié)構(gòu)可以與受體氨基酸的親核基團(tuán)，如氨基、羥基及巰基等發(fā)生不可逆邁克爾加成反應(yīng)，從而體現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，此機(jī)制已得到大多數(shù)研究者的認(rèn)可。本發(fā)明公開(kāi)了對(duì)映貝殼杉烯二萜與對(duì)硝基苯甲酰乙酸乙酯（Ethyl 4-nitrobenzoylacetate）邁克爾加成反應(yīng)活性與其抗腫瘤活性之間存在正向相關(guān)性，即邁克爾加成反應(yīng)活性越高，抗腫瘤活性越好。據(jù)此建立了一種根據(jù)測(cè)定邁克爾加成反應(yīng)活性來(lái)快速預(yù)測(cè)對(duì)映貝殼杉烯抗腫瘤活性的方法。采用紫外光譜動(dòng)力學(xué)法快速測(cè)定對(duì)映貝殼杉烯二萜與對(duì)硝基苯甲酰乙酸乙酯邁克爾加成反應(yīng)速率。對(duì)映貝殼杉烯二萜與對(duì)硝基苯甲酰乙酸乙酯邁克爾加成反應(yīng)為二級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)物對(duì)映貝殼杉烯二萜濃度的倒數(shù)與反應(yīng)時(shí)間呈線性關(guān)系。對(duì)映貝殼杉烯二萜紫外可見(jiàn)光譜最大吸收波長(zhǎng)約240nm，根據(jù)朗伯比爾定律和吸光度加和原理，反應(yīng)體系240nm波長(zhǎng)處吸光度可以代表對(duì)映貝殼杉烯二萜濃度，因此，通過(guò)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系240nm波長(zhǎng)處吸光度可以反映對(duì)映貝殼杉烯二萜濃度變化，從而快速測(cè)得邁克爾加成反應(yīng)速率，快速預(yù)測(cè)抗腫瘤活性。該快速預(yù)測(cè)對(duì)映貝殼杉烯抗腫瘤活性方法與常規(guī)MTT法和抗腫瘤動(dòng)物模型法比較，具有簡(jiǎn)便、快速、需要樣品量少、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，可作為對(duì)映貝殼杉烯二萜抗腫瘤活性快速、高通量篩選方法，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種根據(jù)邁克爾加成反應(yīng)活性快速預(yù)測(cè)對(duì)映貝殼杉烯二萜抗腫瘤活性的方法。該快速預(yù)測(cè)方法與常規(guī)MTT法和抗腫瘤動(dòng)物模型法比較，具有簡(jiǎn)便、快速、需要樣品量少、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，可作為對(duì)映貝殼杉烯二萜抗腫瘤活性快速、高通量篩選方法，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

將對(duì)硝基苯甲酰乙酸乙酯的乙醇溶液和乙醇鈉的乙醇溶液，混勻，放置一定時(shí)間后，加入對(duì)映貝殼杉烯二萜的乙醇溶液，快速搖勻，得邁克爾加成反應(yīng)溶液；控制反應(yīng)溫度，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)立即對(duì)邁克爾加成反應(yīng)溶液進(jìn)行紫外動(dòng)力學(xué)測(cè)試，記錄240nm波長(zhǎng)處反應(yīng)體系的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間變化曲線；以反應(yīng)體系240nm波長(zhǎng)處吸光度倒數(shù)對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖，線性回歸得到線性方程，獲得線性方程斜率；根據(jù)吸光度倒數(shù)對(duì)反應(yīng)時(shí)間的線性方程斜率，即邁克爾加成反應(yīng)速率快速預(yù)測(cè)對(duì)映貝殼杉烯二萜抗腫瘤活性高低，線性方程斜率大的對(duì)映貝殼杉烯二萜的邁克爾加成反應(yīng)活性高、抗腫瘤活性更好；以冬凌草甲素為陽(yáng)性對(duì)照藥，線性方程斜率大于陽(yáng)性對(duì)照藥的對(duì)映貝殼杉烯二萜的邁克爾加成反應(yīng)活性和抗腫瘤活性比陽(yáng)性對(duì)照藥更好。

附圖說(shuō)明

圖1為240nm波長(zhǎng)處對(duì)硝基苯甲酰乙酸乙酯與對(duì)映貝殼杉烯二萜邁克爾反應(yīng)體系吸光度隨反應(yīng)時(shí)間變化曲線，圖中曲線Ⅰ為冬凌草甲素反應(yīng)體系，曲線Ⅱ?yàn)?，14-二乙酰基冬凌草甲素反應(yīng)體系，曲線Ⅲ為冬凌草乙素反應(yīng)體系，曲線Ⅳ為1，6-二乙酰基冬凌草乙素反應(yīng)體系。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但應(yīng)理解本發(fā)明的范圍非僅限于這些實(shí)施例的范圍。

實(shí)施例1：

冬凌草甲素、1，14-二乙?；璨菁姿亍⒍璨菀宜?、1，6-二乙酰基冬凌草乙素四個(gè)對(duì)映貝殼杉烯二萜乙醇溶液制備：分別精密稱取上述化合物7.86mg、9.68mg、7.82mg、9.63mg，置于50ml容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，得4.32×10^-4 mol/L溶液。

對(duì)硝基苯甲酰乙酸乙酯乙醇溶液制備：精密稱取對(duì)硝基苯甲酰乙酸乙酯5.12mg，置于50ml容量瓶，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，得4.32×10^-4 mol/L溶液。

乙醇鈉的乙醇溶液制備：精密稱取乙醇鈉 2.94mg，置于100ml容量瓶，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，得4.32×10^-4 mol/L溶液。

邁克爾加成反應(yīng)溶液制備：在4個(gè)10ml試管中均加入對(duì)硝基苯甲酰乙酸乙酯乙醇溶液2ml和乙醇鈉的乙醇溶液2ml，混勻，放置5min；再分別向每個(gè)試管中加入冬凌草甲素、1，14-二乙酰基冬凌草甲素、冬凌草乙素、1，6-二乙?；璨菀宜氐囊掖既芤?ml，快速搖勻，得各自的邁克爾加成反應(yīng)溶液?？刂品磻?yīng)溫度為21℃，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)立即進(jìn)行紫外動(dòng)力學(xué)測(cè)試，記錄240nm波長(zhǎng)處反應(yīng)體系的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間變化曲線（見(jiàn)圖1）。

數(shù)據(jù)處理和反應(yīng)速率計(jì)算：以240nm波長(zhǎng)處吸光度倒數(shù)（1/A）對(duì)反應(yīng)時(shí)間（t，單位小時(shí)）作圖，線性回歸，得線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。線性方程斜率順序?yàn)椋憾璨菁姿兀?，14-二乙?；璨菁姿兀径璨菀宜兀?，6-二乙?；璨菀宜?，吸光度相當(dāng)于濃度，因此邁克爾加成反應(yīng)速率順序?yàn)椋憾璨菁姿兀?，14-二乙?；璨菁姿兀径璨菀宜兀?，6-二乙?；璨菀宜?。其中冬凌草甲素與對(duì)硝基苯甲酰乙酸乙酯邁克爾加成反應(yīng)活性最好。

實(shí)施例2

冬凌草甲素、1，14-二乙酰基冬凌草甲素、冬凌草乙素、1，6-二乙酰基冬凌草乙素體外抗腫瘤活性測(cè)定。

采用常規(guī)MTT法測(cè)定了這四個(gè)對(duì)映貝殼杉烯二萜體外抗腫瘤活性，結(jié)果見(jiàn)表2。這四個(gè)化合物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，其中冬凌草甲素活性最好?？傮w看來(lái)，這4個(gè)化合物體外抗腫瘤活性為：冬凌草甲素＞1，14-二乙酰基冬凌草甲素＞冬凌草乙素＞1，6-二乙?；璨菀宜?。

結(jié)合實(shí)施例1結(jié)果，對(duì)映貝殼杉烯二萜的邁克爾加成反應(yīng)速率順序?yàn)椋憾璨菁姿兀?，14-二乙酰基冬凌草甲素＞冬凌草乙素＞1，6-二乙?；璨菀宜?。體外抗腫瘤活性為：冬凌草甲素＞1，14-二乙?；璨菁姿兀径璨菀宜兀?，6-二乙?；璨菀宜?。結(jié)果表明對(duì)映貝殼杉烯的邁克爾加成反應(yīng)速率越快，其抗腫瘤活性越好。因此，通過(guò)測(cè)定對(duì)映貝殼杉烯與對(duì)硝基苯甲酰乙酸乙酯的邁克爾加成反應(yīng)活性可以快速預(yù)測(cè)對(duì)映貝殼杉烯的抗腫瘤活性高低。