本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于早期肝癌診斷的模型，為肝癌的早期診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

背景技術(shù)：

肝癌（liver cancer）即肝臟惡性腫瘤，是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤，肝癌起病常隱匿，多在肝病隨訪中或體檢普查中應(yīng)用AFP及B超檢查偶然發(fā)現(xiàn)肝癌。此時(shí)病人既無(wú)癥狀，體格檢查亦缺乏腫瘤本身的體征，此期稱之為亞臨床期。早期癥狀：肝癌從第一個(gè)癌細(xì)胞形成發(fā)展到有自覺癥狀，大約需要2年時(shí)間，在此期間，病人可無(wú)任何癥狀或體征，少數(shù)病人會(huì)出現(xiàn)食欲減退，上腹悶脹、乏力等，有些病人可能輕度肝腫大。肝癌一旦出現(xiàn)癥狀，而來(lái)就診者其病程大多已進(jìn)入中晚期。中、晚期癥狀：肝癌的典型癥狀和體征一般出現(xiàn)于中、晚期，主要有肝痛、乏力、消瘦、黃疸、腹水等。臨床上一般采取西醫(yī)的手術(shù)、放化療與中藥結(jié)合療法，但晚期患者因癌細(xì)胞擴(kuò)散而治愈率較低，因此做到肝癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療具有非常重要的意義。

系統(tǒng)生物學(xué)包括基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等。代謝組學(xué)是對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系的研究方式。其研究對(duì)象大都是相對(duì)分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。代謝組學(xué)的分析技術(shù)包括GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）、LC-MS（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）、NMR（核磁共振）等。

本發(fā)明利用代謝組學(xué)技術(shù)，建立了一種可用于早期診斷肝癌的模型，為肝癌的早期診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明利用代謝組學(xué)平臺(tái)，檢測(cè)早期肝癌患者和正常人血清的代謝物輪廓，利用軟件分析早期肝癌患者與正常人血清不同的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)新的早期肝癌相關(guān)性有機(jī)物，用于診斷早期肝癌。

本發(fā)明將早期肝癌患者和健康人血清分別利用Agilent公司的GC-MS和NMR進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，得到原始數(shù)據(jù)，對(duì)原始數(shù)據(jù)校正后運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法計(jì)算每種化合物在不同組樣品中差異的顯著性，以p值0.05，r值0.6做為閾值，判斷p值小于閾值，r值大于閾值的化合物為檢測(cè)含量有顯著性差異的化合物，篩選出在兩組中有顯著差異的化學(xué)位移PPM值。根據(jù)獲得的PPM值從HMDB庫(kù)中找出相匹配的化合物。然后進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，多元統(tǒng)計(jì)分析是可以將分散在n維變量上的代謝指紋圖譜信息集中到某幾個(gè)綜合指標(biāo)上的統(tǒng)計(jì)分析方法。通過這個(gè)分析可以初步判斷樣品之間的關(guān)系，最后確定出差異的標(biāo)志性代謝峰有5個(gè)，其化學(xué)位移PPM值分別為1.33、2.12、2.86、7.06、7.83。利用這5種代謝物，將受檢人血清中相應(yīng)的物質(zhì)的濃度與本發(fā)明模型的平均濃度逐一進(jìn)行比對(duì)，可為早期肝癌的診斷提供指導(dǎo)。

模型的檢測(cè)方法如下：

1. 樣品采集

分別采集早期肝癌患者和正常人的外周靜脈血，靜置，離心后，取上清液置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.色譜條件優(yōu)化

包括色譜流動(dòng)相的選擇，流動(dòng)相梯度條件的優(yōu)化，以及色譜柱溫度和最佳流速的優(yōu)化，以達(dá)到最佳的分離效果。

3.質(zhì)譜條件優(yōu)化

包括離子源類型的選擇及其參數(shù)的設(shè)定，使得峰圖更加優(yōu)化。

4.預(yù)實(shí)驗(yàn)及上樣檢測(cè)

取預(yù)處理后的血清樣品注入進(jìn)樣孔，進(jìn)行相關(guān)系數(shù)的設(shè)置。

5.測(cè)試報(bào)告的分析

獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)校正后，運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，將偏離較大的物質(zhì)剔除掉，最后得到標(biāo)志性差異代謝物。

具體實(shí)施方式

1．材料

1.1 樣品采集

分別使用抗凝管采集正常組和早期肝癌組靜脈血1ml，在4℃冰箱中靜置30min后離心（4000rpm，5min）。取200ul上清液分裝于低吸附離心管中，-80℃冰箱中保存，備用。

1.2 所需主要試劑與儀器

乙腈、氯苯丙氨酸、甲醇、硅烷化衍生試劑等均購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司。GC-MS系統(tǒng)和NMR系統(tǒng)購(gòu)自Agilent公司。

2. 方法

2.1 高豐度蛋白的去除

樣品室溫下融化，加入100ul的乙腈，渦旋混勻1min后超聲波萃取2min。形成的懸浮液再離心14000rpm,10min,10℃。取200ul上清液加入400ul，PH=7.4的磷酸緩存溶液置于核磁檢測(cè)管中。

2.2 正式實(shí)驗(yàn)

將樣品一個(gè)一個(gè)地放入NMR檢測(cè)器中，獲得圖譜，得到原始數(shù)據(jù)。

2.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，以p值0.05和r值0.6為閾值，運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法找出差異明顯的物質(zhì)，最后得到5種標(biāo)志性差異代謝物：PPM值分別為1.33、2.12、2.86、7.06、7.83。利用這5種物質(zhì)，將受檢人血清中相應(yīng)的物質(zhì)的濃度與本發(fā)明模型逐一進(jìn)行比對(duì)，可為肝癌的早期診斷提供輔助指導(dǎo)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例

取受檢者血清，經(jīng)檢驗(yàn)得到其代謝產(chǎn)物圖譜，得到PPM值分別為1.33、2.12、2.86、7.06、7.83的特異代謝物的含量，與本實(shí)驗(yàn)中的對(duì)應(yīng)樣品的平均含量進(jìn)行比較，若含量近似為本模型平均含量的2倍，則為早期肝癌組，否則為正常組。

以上是對(duì)本發(fā)明的描述而非限定，基于本發(fā)明思想的其它實(shí)施方式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。