本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種中藥復(fù)方的質(zhì)量控制方法，具體的本發(fā)明涉及一種龍加通絡(luò)膠囊的質(zhì)量控制方法，特別是龍加通絡(luò)膠囊制劑組方穿山龍和刺五加的一種或多種成分同時(shí)或分別進(jìn)行高效液相色譜含量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
中風(fēng)是中醫(yī)學(xué)對(duì)急性腦血管疾病的統(tǒng)稱。它是以猝然昏倒，不省人事，伴發(fā)口角歪斜、語言不利而出現(xiàn)半身不遂為主要癥狀的一類疾病。由于本病發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高以及并發(fā)癥多的特點(diǎn)，所以醫(yī)學(xué)界把它同冠心病、癌癥并列為威脅人類健康的三大疾病之一。預(yù)防中風(fēng)的重要性已經(jīng)引起國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的重視，醫(yī)學(xué)家們正從各個(gè)方面探索中風(fēng)的預(yù)防措施。
市場(chǎng)上目前出現(xiàn)了非常多種類的中風(fēng)類藥物，而中風(fēng)類藥物的有效性和穩(wěn)定性日益成為大家關(guān)注的內(nèi)容。
中藥復(fù)方龍加通絡(luò)膠囊是自主發(fā)明創(chuàng)造的新藥，該制劑是由穿山龍和刺五加或穿山龍和刺五加浸膏或穿山龍和刺五加有效部位制成，與藥用輔料組合而成。應(yīng)用于治療經(jīng)絡(luò)受阻、氣虛血淤之中風(fēng)病(腦栓塞形成恢復(fù)期)，如半身不遂、口眼歪斜、言語不清或蹇澀，或偏身麻木，面色晃白，口流涎，汗自出，便溏、手足腫脹、舌質(zhì)黯淡或有淤點(diǎn)，舌苔薄或白膩，脈弦滑。該藥物組合物方簡藥精，功專效著，藥源廣，成本低廉。具有活血化瘀、益氣通絡(luò)功效，用于氣虛血淤證之中風(fēng)治療。臨床療效確切，起效快、癥狀消失快，使用安全。
該發(fā)明創(chuàng)造已于2002年12月18日申請(qǐng)了發(fā)明名稱“一種治療中風(fēng)的藥物組合物、其制備方法和應(yīng)用”的發(fā)明專利，并于2006年3月29日獲得授權(quán)，授權(quán)公告號(hào)為CN1247213C。
龍加通絡(luò)膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)穿山龍和刺五加均使用了高效液相色譜方法同時(shí)或分別控制其中一種或多種成分方法。穿山龍收載于中國藥典2010年版一部，為薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscroea nipponica Makino的干燥根莖，功能祛風(fēng)除濕，舒筋通絡(luò)，活血止痛，止咳平喘。用于風(fēng)濕痹病，關(guān)節(jié)腫脹，疼痛麻木，跌撲損 傷，閃腰岔氣，咳嗽氣喘等癥。其根莖中主要含有薯蕷皂苷等甾體皂苷類成分。由于薯蕷皂苷元是制藥工業(yè)的原料，對(duì)于該植物的質(zhì)量控制多只涉及薯蕷皂苷元一種成分，但是獲得皂苷元須經(jīng)藥材酸水解、萃取、調(diào)節(jié)pH等步驟，操作煩瑣且常有副反應(yīng)發(fā)生，收率不穩(wěn)定。近年來，薯蕷皂苷等甾體皂苷在抗癌、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、防治心血管疾病等方面的作用日益引起全世界的關(guān)注。目前為止，對(duì)于皂苷類成分的研究，多停留在結(jié)構(gòu)確證與藥理活性方面，質(zhì)量控制方面較少，已有研究多采用重量法、薄層掃描法等方法考察該類藥材或相關(guān)制劑中總皂苷或單體皂苷的含量，特別是薯蕷皂苷屬于甾體皂苷，紫外吸收很弱，采用HPLC方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，不僅靈敏度高，專屬性強(qiáng)，操作簡單易行，并且將質(zhì)量控制的指標(biāo)與活性成分相結(jié)合。刺五加收載于中國藥典2010年版一部，為刺五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)的干燥根和根莖或莖，功能益氣健脾，補(bǔ)腎安神。用于脾肺氣虛，體虛乏力，食欲不振，肺腎兩虛，久咳虛喘，腎虛腰膝酸痛，心脾不足，失眠多夢(mèng)等癥。其根莖中主要含有薯蕷皂苷等甾體皂苷類成分。其中含有多種苷類，紫丁香苷、異嗪皮啶和總黃酮等成分，有效成分紫丁香苷含量較高。由于刺五加中綠原酸和紫丁香苷極性相似，對(duì)紫丁香苷分離有很強(qiáng)的干擾作用。
由于中成藥的成分比較復(fù)雜，中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制更是保證品種質(zhì)量的關(guān)鍵難題。為了保證該復(fù)方制劑的質(zhì)量和療效，更利于藥品產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，本發(fā)明對(duì)該中藥制劑的質(zhì)量控制進(jìn)行了相應(yīng)的探討和研究，符合了現(xiàn)代中藥發(fā)展的趨勢(shì)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種龍加通絡(luò)膠囊的質(zhì)量控制方法。
具體地講，本發(fā)明的采用高效液相色譜法同時(shí)或分別測(cè)定龍加通絡(luò)膠囊穿山龍中和刺五加中一種或多種成分。同時(shí)測(cè)定龍加通絡(luò)膠囊穿山龍中薯蕷皂苷、刺五加中紫丁香苷，操作方便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，能夠較好的控制制劑質(zhì)量，保證藥品的穩(wěn)定性，用藥更為安全有效。
本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，包括如下的含量測(cè)定方法：
1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以C4、C8、C18為填充劑；以0～50：100～50:0～2 比例的乙腈或甲醇-水-甲酸或冰醋酸或磷酸溶液為流動(dòng)相，流速0.5～1.5ml/min；檢測(cè)波長：203～320nm；柱溫20～40℃。
2)供試品溶液制備：取龍加通絡(luò)膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入20～100ml 0～100％甲醇、乙醇或丙酮等水溶液，超聲、熱回流或冷浸10～120min，放冷濾過，取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。
3)對(duì)照品溶液制備：精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含薯蕷皂苷0.6mg/ml的溶液，作為薯蕷皂苷對(duì)照品溶液；精密稱取紫丁香苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含紫丁香苷10μg/ml的溶液，作為紫丁香苷對(duì)照品溶液；精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品和紫丁香苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含薯蕷皂苷對(duì)照品0.6mg/ml和紫丁香苷10μg/ml的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。
4)測(cè)定：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試溶液10μl～20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
優(yōu)選的，上述含量測(cè)定方法中，步驟1)高效液相色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)方法如下：以C18為填充劑；按下表1進(jìn)行梯度洗脫：
表1梯度洗脫條件
更優(yōu)選的，上述含量測(cè)定方法中，步驟1)高效液相色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按下表2進(jìn)行梯度洗脫：
表2梯度洗脫條件
本發(fā)明中薯蕷皂苷和紫丁香苷兩種成分性質(zhì)相差較大，采用同一波長進(jìn)行含量測(cè)定難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)，故分別選擇兩種成分最大吸收波長203nm和220nm，測(cè)定過程中調(diào)整對(duì)應(yīng)檢測(cè)波長，實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定兩種成分，并且在相應(yīng)的保留時(shí)間具有最大峰響應(yīng)值。
上述含量測(cè)定方法中，步驟2)中優(yōu)選采用30～70ml 50～100％甲醇或乙醇水溶液，超聲或冷浸10～120min，更優(yōu)選采用50ml 95％乙醇水溶液，超聲處理(功率180W，頻率40kHz)30min。
本發(fā)明對(duì)供試品制備提取方法進(jìn)行了選擇，結(jié)果表明：超聲處理、回流提取比冷浸提取，薯蕷皂苷含量較多；超聲處理比回流提取紫丁香苷含量較多。
本發(fā)明對(duì)供試品制備提取時(shí)間進(jìn)行了選擇，結(jié)果表明，超聲處理(功率180W，頻率40kHz)30分鐘與40分鐘比較，薯蕷皂苷和紫丁香苷提取已基本達(dá)到一致，確定供試品溶液制備過程中提取時(shí)間為30分鐘。
本發(fā)明將含量測(cè)定指標(biāo)選定為穿山龍和刺五加中穩(wěn)定可控的活性成分薯蕷皂苷和紫丁香苷，含量較高且穩(wěn)定，以此控制制劑質(zhì)量具有較好的專屬性和質(zhì)量相關(guān)性。
本發(fā)明對(duì)處方中兩味藥材均進(jìn)行含量控制，從而利于保證藥品安全性和有效性；并且該測(cè)定方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好，便于藥品的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。
下面對(duì)本發(fā)明的龍加通絡(luò)膠囊的質(zhì)量控制方法進(jìn)行進(jìn)一步說明。
1.儀器與試劑
高效液相色譜儀：Agilent 1260；Agilent DAD；乙腈為色譜純，水為超純水。
對(duì)照品薯蕷皂苷(批號(hào)：111707-200501)、紫丁香苷(批號(hào)：111574-200502)，購自中國藥品生物制品檢定所。
2.方法與結(jié)果
色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；Diamonsil 5μ，250×4.6mm；流動(dòng)相為乙腈-水按下表3進(jìn)行梯度洗脫：
表3梯度洗脫條件
供試品溶液制備：取龍加通絡(luò)膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50ml 95％乙醇，超聲處理(功率180W，頻率40kHz)30min，放冷濾過，取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。
對(duì)照品溶液制備：精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品和紫丁香苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含薯蕷皂苷對(duì)照品0.6mg和紫丁香苷10μg的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。
測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液10μl、供試溶液20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。薯蕷皂苷(C45H72O16)的含量不少于其重量的1.3％，紫丁香苷(C17H24O9)含量不少于其重量的0.1％。
3.供試品處理方法的選擇(供試品溶液的制備)
3.1提取溶媒的選擇
以乙醇、95％乙醇、甲醇、50％甲醇、丙酮、水為提取溶媒進(jìn)行考察。
取批號(hào)為1307203批樣品內(nèi)容物2g，精密稱定，分別置100ml具塞錐形瓶中，分別加入乙醇、95％乙醇、甲醇、50％甲醇、丙酮、水50ml，稱定重量，超聲處理(功率180W，功率40kHz)30分鐘，放冷，稱定補(bǔ)足失重，濾過，除丙酮處理供試品，各供試品濾液過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用；丙酮處理供試品，減壓濃縮至干，加適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，加甲醇制刻度，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。
按上述高效液相色譜條件測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見表4
表4提取溶劑考察
由表4可見，以乙醇與95％乙醇為提取溶媒薯蕷皂苷的含量基本一致，高于其他提取溶媒；以95％乙醇為提取溶媒紫丁香苷的含量，高于其他提取溶媒；綜合考慮薯蕷皂苷和紫丁香苷含量，選用95％乙醇作為提取溶劑。
3.2提取方法的選擇
試驗(yàn)對(duì)超聲處理、回流提取、冷浸提取進(jìn)行對(duì)比。
取批號(hào)為1307203批樣品內(nèi)容物2g，精密稱定，分別置100ml具塞錐形瓶中，分別加入95％乙醇50ml，稱定重量，分別超聲處理(功率180W，功率40kHz)、水浴回流提取、冷浸提取30分鐘，放冷，稱定補(bǔ)足失重，濾過，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。
按上述高效液相色譜條件測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見表5
表5提取方法考察
由表5可見，以超聲處理與回流提取薯蕷皂苷的含量基本一致，高于冷浸提??；以超聲處理提取紫丁香苷的含量，高于水浴回流和冷浸提??；綜合考慮薯蕷皂苷和紫丁香苷含量，選用超聲處理提取。
3.3提取時(shí)間的選擇
取批號(hào)為1307203批樣品內(nèi)容物2g，精密稱定，分別置100ml具塞錐形瓶中，分別加入95％乙醇50ml，稱定重量，分別超聲處理(功率180W，功率40kHz)20、30、40分鐘，放冷，稱定補(bǔ)足失重，濾過，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。
按上述高效液相色譜條件測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見表6。
表6提取時(shí)間考察
由表6可見，超聲處理30分鐘后含量幾無變化，選擇提取時(shí)間為30分鐘。
3.4提取溶媒用量的考察
取批號(hào)為1307203批樣品內(nèi)容物2g，精密稱定，分別置100ml具塞錐形瓶中，分別加入95％乙醇25、50、100ml，稱定重量，分別超聲處理(功率180W，功率40kHz)30分鐘，放冷，稱定補(bǔ)足失重，濾過，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。
按上述高效液相色譜條件測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見表7。
表7提取溶媒用量考察
由表7可見，提取溶媒50ml、100ml超聲處理30分鐘后，薯蕷皂苷和紫丁香苷含量幾無變化，選擇提取溶媒用量為50ml。
綜上所述，選擇下述供試品溶液制備方法：取龍加通絡(luò)膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50ml 95％乙醇，超聲處理(功率180W，頻率40kHz)30min，放冷濾過，取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。
4.線性關(guān)系
分別精密吸取對(duì)照品溶液1、2、5、10、20、40μl，注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表8。
表8線性回歸方程
5.精密度試驗(yàn)
取龍加通絡(luò)膠囊(批號(hào)1307203)供試品，按前述方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，按前述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定6次，測(cè)定薯蕷皂苷和紫丁香苷面積，結(jié)果見表9。
表9精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)
由表9可見，供試品薯蕷皂苷峰面積平均值為4941.2，RSD為0.42％；供試品紫丁香苷峰面積平均值為494.6，RSD為1.34％；表明精密度良好。
6.穩(wěn)定性試驗(yàn)
取龍加通絡(luò)膠囊(批號(hào)1307203)，按前述方法制備供試品溶液，分別于0h、 2h、4h、6h、8h精密吸取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，按前述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定6次，測(cè)定薯蕷皂苷和紫丁香苷面積，結(jié)果見表10。
表10供試品穩(wěn)定性試驗(yàn)
由表10可見，供試品溶液在配制8h內(nèi)測(cè)定，結(jié)果穩(wěn)定。
7.重現(xiàn)性試驗(yàn)
取龍加通絡(luò)膠囊(批號(hào)1307203)，共6份，按前述方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按前述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定，結(jié)果見表11。
表11重現(xiàn)性試驗(yàn)(n＝6)
由表11可見，供試品薯蕷皂苷峰面積平均值為1.56，RSD為2.61％；供試品紫丁香苷峰面積平均值為0.020，RSD為3.73％；表明重現(xiàn)性良好。
8.回收率
取龍加通絡(luò)膠囊樣品(批號(hào)1307203)6份，稱取1g，精密稱定，分別置于100ml量瓶中，精密加入15mg薯蕷皂苷,精密吸取0.04mg/ml紫丁香苷對(duì)照品溶液5ml，加入45ml 95％乙醇，以下操作按前述方法制備供試品溶液，分別精密吸取回收率樣品溶液20μl、混合對(duì)照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按前述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定，結(jié)果見表12。
表12回收率試驗(yàn)
9.供試品測(cè)定
取中試生產(chǎn)龍加通絡(luò)膠囊膠囊3批(批號(hào)：1307201、1307202、1306201)，按前述方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液10μl、供試溶液20μl，注入液相色譜儀，按前述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定，結(jié)果見表13。
表13三批供試品含量測(cè)定結(jié)果
根據(jù)3批中試供試品測(cè)定結(jié)果，規(guī)定薯蕷皂苷(C45H72O16)的含量不少于其重量的1.4％，紫丁香苷(C17H24O9)含量不少于其重量的0.08％。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于中藥制劑成分復(fù)雜，劑型范圍分布較寬，本發(fā)明專利的有益效果是：采用高效液相色譜法雙波長同時(shí)測(cè)定處方中穿山龍薯蕷皂苷和刺五加紫丁香苷，采用梯度洗脫法，達(dá)到色譜峰完全分離。本發(fā)明專利使得龍加通絡(luò)膠囊質(zhì)量控制方法更為準(zhǔn)確有效，保證藥品的質(zhì)量與療效，保證了藥品的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，結(jié)果準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性，重現(xiàn)性良好，并且該測(cè)定方法操作簡單，同時(shí)顯著提高企業(yè)工作效率，符合現(xiàn)代化中藥發(fā)展的趨勢(shì)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述發(fā)明范圍僅限于下屬實(shí)施例。
實(shí)施例1
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用C18硅膠為填充劑；流動(dòng)相為乙腈-水按下表14進(jìn)行梯度洗脫：
表14梯度洗脫條件
供試品溶液制備：取龍加通絡(luò)膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50ml 95％乙醇，超聲處理(功率180W，頻率40kHz)30min，放冷，稱重補(bǔ)足失重，濾過，取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。
對(duì)照品溶液制備：精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品和紫丁香苷對(duì)照品適量，加甲醇 制成每1ml含薯蕷皂苷對(duì)照品0.6mg和紫丁香苷10μg的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。
測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液10μl、供試溶液20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
實(shí)施例2
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用C8硅膠為填充劑；流動(dòng)相為乙腈-水-甲酸按下表15進(jìn)行梯度洗脫：
表15梯度洗脫條件
供試品溶液制備：取龍加通絡(luò)膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50ml 95％乙醇，冷浸120min，放冷，稱重補(bǔ)足失重，濾過，取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。
對(duì)照品溶液制備：精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品和紫丁香苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含薯蕷皂苷對(duì)照品0.6mg和紫丁香苷10μg的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。
測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液10μl、供試溶液20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
實(shí)施例3
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用C4硅膠為填充劑；流動(dòng)相為乙腈-水-甲酸按下表16進(jìn)行梯度洗脫：
表16梯度洗脫條件
供試品溶液制備：取龍加通絡(luò)膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入20ml 75％甲醇，水浴回流90min，稱定補(bǔ)足失重，放冷濾過，取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。
對(duì)照品溶液制備：精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品和紫丁香苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含薯蕷皂苷對(duì)照品0.6mg和紫丁香苷10μg的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。
測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液10μl、供試溶液20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
實(shí)施例4
薯蕷皂苷含量測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(55:45)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為203nm。
紫丁香苷含量測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水(20:80)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為265nm。
供試品溶液制備：取龍加通絡(luò)膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入100ml水，冷浸120min，放冷濾過，取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。
對(duì)照品溶液制備：精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含薯蕷皂苷0.6mg的溶液，作為薯蕷皂苷對(duì)照品溶液；精密稱取紫丁香苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含紫丁香苷10μg的溶液，作為紫丁香苷對(duì)照品溶液
測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液10μl、供試溶液20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。