本發(fā)明涉及一種檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，特別是一種全自動(dòng)在線進(jìn)樣分析方法。

背景技術(shù)：

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌分泌的次生代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素(Aflatoxin)是毒性最強(qiáng)的真菌毒素，被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為一類致癌物。黃曲霉毒素的危害性在于對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強(qiáng)。黃曲霉毒素廣泛存在于大米、玉米、花生、大豆等農(nóng)產(chǎn)品和一些肉制品中，為此世界各國(guó)都規(guī)定了黃曲霉毒素B1在食品及飼料中的最大允許含量并作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)。因此開發(fā)準(zhǔn)確有效的食品中黃曲霉毒素的速測(cè)方法，對(duì)加強(qiáng)食品安全監(jiān)管至關(guān)重要。

現(xiàn)有黃曲霉毒素檢測(cè)方法包括薄層層析法、免疫學(xué)分析法和儀器分析法。其中薄層層析法是最常用的檢測(cè)方法，一般實(shí)驗(yàn)室都可進(jìn)行，但試劑用量大、操作繁瑣、雜質(zhì)干擾嚴(yán)重、無法精確定量，且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境污染較大。免疫學(xué)分析方法包括酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫法和時(shí)間分辨熒光法。酶聯(lián)免疫吸附法特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低、適于批量檢測(cè)，但僅能檢測(cè)單一毒素(如黃曲霉毒素B1)，而且易出現(xiàn)假陽性結(jié)果難以控制。放射免疫法存在放射污染，現(xiàn)應(yīng)用較少。時(shí)間分辨熒光法檢測(cè)靈敏度比前兩者高，但前處理復(fù)雜，所需儀器昂貴，僅限于醫(yī)學(xué)臨床診斷領(lǐng)域使用。儀器分析法包括熒光分光光度法和高效液相色譜法，其靈敏度高，準(zhǔn)確性好，但要求黃曲霉毒素樣品純度高，樣品前處理過程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種克服了現(xiàn)有技術(shù)中樣品前處理繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、人工操作誤差大、預(yù)處理過程中使用劇毒標(biāo)品和多種有毒有機(jī)溶劑毒害操作人員和污染環(huán)境的問題的全自動(dòng)黃曲霉毒素在線進(jìn)樣分析方法。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：一種黃曲霉毒素在線進(jìn)樣分析方法，其特征在于，包括以下步驟：樣品提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過 含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和柱，此抗體與黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2發(fā)生特異性抗原抗體結(jié)合，使其保留在該親和柱上，其他雜質(zhì)隨流動(dòng)相流出，通過加熱使抗原抗體鍵斷裂，以水洗脫目標(biāo)化合物，洗脫液通過全自動(dòng)真菌毒素前處理及在線進(jìn)樣平臺(tái)在線進(jìn)樣到高效液相色譜儀，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2得到充分分離，目標(biāo)化合物經(jīng)柱后衍生系統(tǒng)衍生，可以被熒光檢測(cè)器檢測(cè)，每一種黃曲霉毒素能分別得到準(zhǔn)確的定量。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述免疫親和柱體積為0.2-0.8mL。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述柱后衍生系統(tǒng)基于紫外光衍生。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明提供的黃曲霉毒素在線進(jìn)樣分析方法分析速度快，樣品凈化和進(jìn)樣分析可同時(shí)進(jìn)行，平均每個(gè)樣品只需9分鐘，而現(xiàn)有技術(shù)要做到定量分析需幾小時(shí)到幾天時(shí)間；(2)檢測(cè)范圍廣，靈敏度高，最低檢測(cè)限(以黃曲霉毒素B1計(jì))為5ppt；(3)采用單克隆抗體免疫技術(shù)，可特異性地將黃曲霉毒素和其他真菌毒素分離出來，準(zhǔn)確性、可靠性強(qiáng)，回收率高達(dá)80％以上；(4)免疫親和柱柱體積小，溶劑用量少，大大縮短樣品處理時(shí)間；(5)通過加熱使抗原抗體鍵斷裂，以水洗脫目標(biāo)化合物，避免有機(jī)溶劑的使用，綠色環(huán)保；(6)全自動(dòng)操作，全天候運(yùn)行，一方面提高了生產(chǎn)效率和重復(fù)性，另一方面避免操作人員接觸劇毒的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品；(7)該系統(tǒng)采用加熱方式將黃曲霉毒素從免疫親和柱使用純水洗脫下來，可直接進(jìn)液相系統(tǒng)分析，而傳統(tǒng)黃曲霉毒素免疫親和柱不能進(jìn)行加熱洗脫，只能用純有機(jī)溶劑如甲醇進(jìn)行洗脫，這樣是不能直接進(jìn)液相分析，就需要手動(dòng)進(jìn)樣，不能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分析，需要浪費(fèi)分析時(shí)間。

附圖說明

圖1為黃曲霉毒素回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

圖2為加標(biāo)回收結(jié)果。

圖3為黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(RP C18，250×4.6mm×5um，0.05ng/10mL)，出峰順序依次為黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1。

圖4為黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方 法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1.采用全自動(dòng)真菌毒素前處理及在線進(jìn)樣平臺(tái)及HPLC檢測(cè)食品中黃曲霉毒

1、試劑與儀器設(shè)備

1.1 試劑配制

1.1.1 樣品提取溶劑：甲醇/水(4/1，v/v)。

1.1.2 5mmol磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH7.2)配制：

1.1.2.1 稱取50.14gNa₂HPO₄.12H₂O溶解于700ml水中；

1.1.2.2 稱取9.66gNaH₂PO₄.1H₂O溶解于350ml水中；

1.1.2.3 將上述兩種溶液進(jìn)行混合并加入42.5gNaCl，配制成pH7.25mmol磷酸鹽緩沖溶液。

1.1.3 1mmol磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH7.2)配制：

取200ml的5mmol磷酸鹽緩沖溶液(pH7.2)稀釋于800ml水中。

1.1.4 甲醇/水：40/60。

1.1.5 洗脫液：取溶劑A 10mL，加入到500mL蒸餾水里面，混勻。

1.1.6 HPLC流動(dòng)相配制：水/甲醇/乙腈(55/30/15,v/v)。

1.1.7 11.2％甲醇/PBS溶液配制：

取28mL甲醇，用1mmol的PBS緩沖溶液定容到250mL，混勻。

1.1.8 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：黃曲霉毒素G2：0.288ug/mL；G1：1.056ug/mL；B2：0.314ug/mL；B1：1.039ug/mL。

1.2 儀器設(shè)備

(1)全自動(dòng)真菌毒素前處理及在線進(jìn)樣平臺(tái)。

全自動(dòng)真菌毒素前處理及在線進(jìn)樣平臺(tái)是上海磐合科學(xué)儀器股份有限公司的市售產(chǎn)品，在公司網(wǎng)站上有其產(chǎn)品信息的介紹。該平臺(tái)帶有全自動(dòng)固相萃取、凝膠凈化、在線/離線精確定量濃縮等多種組合，不僅適用于普通樣品前處理更適用于黃曲霉毒素專業(yè)前處理?？蓪悠非疤幚砑癏PLC在線聯(lián)機(jī)使用，使前處理與分析全自動(dòng)化。

全自動(dòng)真菌毒素前處理及在線進(jìn)樣平臺(tái)包括：1、固定支架，2、凈化柱抓取器，3，凈化柱加熱器，4、高壓液相進(jìn)樣閥配備700ul不銹鋼定量環(huán)。凈化柱加熱器可加熱溫度為100℃，高壓液相進(jìn)樣閥為二位六通閥。

(2)HPLC系統(tǒng)，帶熒光檢測(cè)器(FLD)

(3)UVE柱后衍生化系統(tǒng)

(4)Aflaclean smart免疫親和凈化柱

(5)高速勻漿機(jī)

(6)高速離心機(jī)

(7)50mL離心管

2、實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 HPLC參考分析方法：

黃曲霉毒素HPLC分析檢測(cè)條件可參照以下設(shè)定：

流動(dòng)相：水/甲醇/乙腈55/30/15(v/v)；流速：1.2ml/min；柱溫：36℃；

HPLC分析柱：RP C18，250×4.6mm×5um；或LCTech專用柱150×4.6mm×5um；

熒光檢測(cè)器設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng)EX.：365nm；發(fā)射波長(zhǎng)Em.：460nm(使用UVE柱后衍生系統(tǒng))。

3、樣品處理方法

針對(duì)不同基質(zhì)的樣品，前處理方法有所不同。

3.1 方法一：標(biāo)準(zhǔn)方法

該處理程序適用于樣品基質(zhì)中沒有干擾，主要適用于大多數(shù)谷類樣品的處理。

稱取2.0g樣品到50mL離心管中，并加入0.2g的氯化鈉。先加入10mL提取溶劑(甲醇/水，4/1，v/v)，再高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)提取5min。將離心管在高速離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速8000r/min。取上清液4.2mL，加入25.8mL PBS緩沖溶液(pH 7.2)。攪拌均勻后，離心。取上清液12mL左右到Freestyle進(jìn)樣瓶(16mL)中，上機(jī)測(cè)試。

3.2 方法二：標(biāo)準(zhǔn)方法加正己烷分層

該樣品處理方法針對(duì)樣品中含有油脂比較多，如堅(jiān)果類，一些香料或無花 果醬，脂肪和樣品中含有一些需要用正己烷去除的雜質(zhì)。

稱取2.0g樣品到50mL離心管中，并加入0.2g的氯化鈉。先加入10mL提取溶劑(甲醇/水，4/1，v/v)，再加入5mL正己烷，再高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)提取5min。將離心管在高速離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速8000r/min。取下層水相溶液4.2mL，加入25.8mL PBS緩沖溶液(pH 7.2)。充分混勻后，離心。取上清液12mL左右到Freestyle進(jìn)樣瓶(16mL)中，上機(jī)測(cè)試。

4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用甲醇將黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋50倍，即：黃曲霉毒素G2：5.76ng/mL；G1：21.12ng/mL；B2：6.28ng/mL；B1：20.78ng/mL，此溶液作為標(biāo)準(zhǔn)使用液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度(以B1濃度表示)：0.05ng/10mL、0.1ng/10mL、0.2ng/10mL、0.4ng/10mL、0.8ng/10mL，即分別取濃度為標(biāo)準(zhǔn)使用液，12.5uL、25uL、50uL、100uL、200uL到50mL容量瓶中，用11.2％甲醇/PBS緩沖溶液定容，既得上述標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取上述溶液12mL左右到16mL樣品瓶中進(jìn)行上機(jī)測(cè)試。

5 上機(jī)測(cè)試

5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線，在此全自動(dòng)真菌毒素前處理與在線進(jìn)樣平臺(tái)與HPLC聯(lián)機(jī)測(cè)試黃曲霉毒素實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作也要按照要求上Aflaclean smart免疫親和柱后進(jìn)HPLC進(jìn)行分析。

5.2 將樣品按照儀器設(shè)定的黃曲霉毒素測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)試，同時(shí)HPLC記錄信號(hào)。

6、樣品測(cè)試及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

6.1 樣品測(cè)試：將小麥樣品用粉碎機(jī)粉碎后，按照3.1方法一進(jìn)行操作。

取花生油樣品，按照3.2方法二進(jìn)行操作。

6.2 樣品加標(biāo)試驗(yàn)：在6.1中稱量好的樣品中加入25uL標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，即黃曲霉毒素G2：0.144ng；G1：0.528ng；B2：0.157ng；B1：0.520ng；在6.1中稱量好的樣品中加入75uL標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，即黃曲霉毒素G2：0.432ng；G1：1.584ng；B2：0.471ng；B1：1.56ng。

7 結(jié)果

7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線：采用該方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍在0.05ng/10mL～0.8ng/10mL，線性相關(guān)系數(shù)都在0.999以上。

結(jié)果參見圖1，圖1為黃曲霉毒素回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

7.2 加標(biāo)回收率

在空白樣品中進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法回收率都在80％-99.4％之間。

結(jié)果參見圖2，圖2位加標(biāo)回收結(jié)果。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。