本發(fā)明屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及測(cè)定鵝去氧膽酸原料藥含量及其有關(guān)物質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

鵝去氧膽酸(CDCA，式1所示化合物)主要作用是降低膽汁內(nèi)膽固醇的飽和度，絕大多數(shù)患者服用CDCA后(當(dāng)CDCA占膽汁中膽鹽的70％時(shí))，脂類(lèi)恢復(fù)微膠粒狀態(tài)，膽固醇就處于不飽和狀態(tài)，從而使結(jié)石中的膽固醇溶解、脫落。大劑量的CDCA(每日10～15mg/kg)可以抑制膽固醇的合成，并增加膽石癥患者膽汁的分泌，但其中的膽鹽和磷脂分泌量維持不變。

鵝去氧膽酸是天然提取產(chǎn)物，主要雜質(zhì)為熊去氧膽酸(式2所示化合物)，熊去氧膽酸的結(jié)構(gòu)與鵝去氧膽酸類(lèi)似，均含有一個(gè)羧基，藥典BP、EP及JP中測(cè)定鵝去氧膽酸的含量均是采用氫氧化鈉滴定液滴定羧基的方法，而滴定過(guò)程中是無(wú)法排除熊去氧膽酸這個(gè)雜質(zhì)的干擾的，即，酸堿滴定計(jì)算過(guò)程中會(huì)將把雜質(zhì)熊去氧膽酸當(dāng)做鵝去氧膽酸一并計(jì)算成鵝去氧膽酸的含量，從而造成較大誤差。另一方面，鵝去氧膽酸本身沒(méi)有紫外吸收，通用的高效液相色譜法中的紫外檢測(cè)器無(wú)法測(cè)得鵝去氧膽酸的色譜峰。而B(niǎo)P、EP及JP中測(cè)定鵝去氧膽酸有關(guān)物質(zhì)采用的方法是薄層色譜法，也僅能限度分析測(cè)定鵝去氧膽酸中熊去氧膽酸雜質(zhì)，無(wú)法確定雜質(zhì)熊去氧膽酸的具體含量。由此也不具備雜質(zhì)監(jiān)控的實(shí)際意義。

因此，目前測(cè)定鵝去氧膽酸原料藥含量及其有關(guān)物質(zhì)的方法仍有待改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種測(cè)定鵝去氧膽酸原料藥含量及其有關(guān)物質(zhì)的方法，采用該方法可同時(shí)實(shí)現(xiàn)鵝去氧膽酸與其雜質(zhì)熊去氧膽酸的有效分離，并且能夠進(jìn)行定量分析，從而為有效控制雜質(zhì)熊去氧膽酸在原料藥中殘留量提供有效的檢測(cè)和監(jiān)控方法。

本發(fā)明提供了一種測(cè)定鵝去氧膽酸原料藥含量及其有關(guān)物質(zhì)的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法的分析條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；

以第一有機(jī)溶劑與緩沖液的混合溶劑作為流動(dòng)相等度洗脫；

樣品采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)；

其中，所述第一有機(jī)溶劑為甲醇和/或乙腈。

采用該方法可以將鵝去氧膽酸中的熊去氧膽酸雜質(zhì)進(jìn)行快速高效的分離和含量測(cè)定，有效控制原料藥及制劑的質(zhì)量。該檢測(cè)方法靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、精密度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、操作方便，可有效控制原料藥的質(zhì)量。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的測(cè)定鵝去氧膽酸含量及其有關(guān)物質(zhì)的方法，還可以具有以下附加技術(shù)特征：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述緩沖液為選自三氟乙酸溶液和甲酸溶液中的至少一種，優(yōu)選為三氟乙酸溶液。由此可以改善峰形，避免拖尾，且可增加分離度。準(zhǔn)確性強(qiáng)、操作方便，可有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述緩沖液濃度為0.01質(zhì)量％～0.10質(zhì)量％，優(yōu)選為0.05質(zhì)量％。由此，可以進(jìn)一步改善峰形。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述緩沖液與有機(jī)相的體積比為(50％～70％):(30％～50％)。，優(yōu)選為60％:40％。由此得到的分離效果最佳。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述蒸發(fā)光散射檢測(cè)器蒸發(fā)管溫度范圍為30℃～50℃，優(yōu)選為35℃；霧化管溫度為30℃～50℃，優(yōu)選為40℃；載氣流速為1.0SLM～3.0SLM，優(yōu)選為2.0SLM，進(jìn)一步的，所述載氣優(yōu)選為氮?dú)?。由此，可以顯著提高檢測(cè)靈敏度。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述色譜柱柱溫為25℃～35℃，優(yōu)選為30℃。由此，可以進(jìn)一步提高熊去氧膽酸雜質(zhì)的分離度。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述流動(dòng)相的流速為0.8～1.2ml/min，優(yōu)選為1.0ml/min。由此得到的分離效果最佳，峰形最好。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品采用第二有機(jī)溶劑和水的混合液進(jìn)行配制，任選的，所述第二有機(jī)溶劑為乙腈和/或甲醇，優(yōu)選為乙腈，任選的，所述混合液的比例為70:30(v/v)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，本發(fā)明所述的測(cè)定方法，可以依照以下方法實(shí)現(xiàn)：

(1)取待檢測(cè)樣品適量，用乙腈:水(體積比70:30)的混合液溶解，配制成每1ml含10mg及0.5mg的樣品溶液，作為有關(guān)物質(zhì)供試品溶液及含量供試品溶液。

(2)設(shè)置流動(dòng)相流速為0.8～1.2ml/min，流動(dòng)相的流速優(yōu)選為1.0ml/min；蒸發(fā)管溫度為30℃～50℃，優(yōu)選為35℃；霧化管溫度為30℃～50℃，優(yōu)選為40℃；載氣流速為1.0SLM～3.0SLM，優(yōu)選為2.0SLM；色譜柱溫度為25℃～35℃，優(yōu)選為30℃。

(3)取(1)的樣品溶液2～20μl，優(yōu)選10μl，注入高效液相色譜儀，完成鵝去氧膽酸的含量及其雜質(zhì)的測(cè)定。

本發(fā)明鵝去氧膽酸有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法中，有關(guān)物質(zhì)供試品溶液的制備：為滿(mǎn)足供試品溶液檢測(cè)濃度的需要，取鵝去氧膽酸適量，用稀釋液配制成濃度為每1ml含10mg的溶液，作為供試品溶液。再分別用稀釋液稀釋成一系列不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣10ul，使之產(chǎn)生主峰為基線(xiàn)噪音3倍的信號(hào)。經(jīng)試驗(yàn)，最小檢測(cè)量為1μg(S/N≥3)，若以有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)的濃度10mg/ml計(jì)算，其檢出限度為0.1％。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的積極效果在于：

1、使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)鵝去氧膽酸進(jìn)行含量檢測(cè)，克服了鵝去氧膽酸原料藥結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒(méi)有發(fā)色基團(tuán)，用紫外檢測(cè)器難以檢測(cè)的缺點(diǎn)。傳統(tǒng)方法常用酸堿滴定，但卻無(wú)法排除雜質(zhì)熊去氧膽酸的干擾，本發(fā)明采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，將鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸進(jìn)行分離分析，通過(guò)鵝去氧膽酸對(duì)照品峰面積與濃度的比值，計(jì)算出供試品中鵝去氧膽酸的含量。

2、使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)本品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。傳統(tǒng)方法采用薄層色譜法，只能有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行限度分析，而該方法卻可對(duì)熊去氧膽酸進(jìn)行定量分析，而且還可將其他膽酸類(lèi)雜質(zhì)(如膽酸或去氧膽酸等)進(jìn)行有效分離及測(cè)定。

3、本發(fā)明檢測(cè)方法準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，靈敏度高(熊去氧膽酸的最低檢測(cè)限度可達(dá)到1μg/mL)，可以充分滿(mǎn)足有關(guān)物質(zhì)檢查的要求，較好的控制樣品中的雜質(zhì)，保證產(chǎn)品質(zhì)量，實(shí)用性強(qiáng)。

4、本發(fā)明方法的洗脫分離效果較好，能使原料藥樣品中鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸有效分離。檢測(cè)時(shí)間僅需20min。可以快速、準(zhǔn)確、可靠的分離鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1，所得原料藥鵝去氧膽酸有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的高效液相 色譜圖；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1，所得鵝去氧膽酸對(duì)照品與熊去氧膽酸對(duì)照品的分離度高效液相色譜圖；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例2，所得原料藥鵝去氧膽酸有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的高效液相色譜圖；

圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例2，所得鵝去氧膽酸對(duì)照品與熊去氧膽酸對(duì)照品的分離度高效液相色譜圖；

圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例3，所得原料藥鵝去氧膽酸含量測(cè)定的高效液相色譜圖；

圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例3，所得鵝去氧膽酸對(duì)照品含量測(cè)定的高效液相色譜圖；

圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例4，所得鵝去氧膽酸對(duì)照品與熊去氧膽酸對(duì)照品的分離度高效液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

1、樣品：

鵝去氧膽酸原料藥：生產(chǎn)廠(chǎng)家為成都元成生物科技有限公司，批號(hào)為CDCA-141201，其雜質(zhì)主要為熊去氧膽酸；

鵝去氧膽酸對(duì)照品：來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110806-201406；

熊去氧膽酸對(duì)照品：來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110755-9003。

供試品溶液配制：精密稱(chēng)取鵝去氧膽酸原料藥100mg，置于10ml容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為10mg/ml的供試品溶液；

對(duì)照品溶液配制：精密稱(chēng)取熊去氧膽酸對(duì)照品25mg，置于25ml容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1ml置100ml容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻；再精密量取1ml置10ml容量瓶中，同時(shí)精密稱(chēng)取鵝去氧膽酸對(duì)照品10mg置于該10ml容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，得到熊去氧膽酸濃度為1μg/mL、鵝去氧膽酸濃度為1mg/mL的對(duì)照品溶液。

2、測(cè)定條件：

儀器：Agilent1260高效液相色譜儀，380-ELSD檢測(cè)器

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(250×4.6mm,5μm)；

流動(dòng)相A：0.10體積％三氟乙酸

流動(dòng)相B：乙腈

A:B＝50:50(體積比％)，等度洗脫

流速：1.0ml/min

霧化管溫度：30℃

蒸發(fā)管溫度：35℃

柱溫：30℃

進(jìn)樣體積：10μl

稀釋劑：乙腈:水＝70:30(v/v)

運(yùn)行時(shí)間：20分鐘

載氣：氮?dú)?，流速?.0SLM

3、樣品檢測(cè)：

采用上述測(cè)定條件，分別對(duì)配制的供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，分別記錄色譜圖記作圖1、圖2。

結(jié)論：首先，通過(guò)圖2可以清楚地看到，通過(guò)采用上述測(cè)定分析條件可以有效地將熊去氧膽酸與鵝去氧膽酸進(jìn)行分離，且熊去氧膽酸的檢測(cè)限度可以達(dá)到1μg/mL。

其次，通過(guò)將圖1與圖2進(jìn)行比較，可以將圖1中保留時(shí)間6.790min和12.660min的色譜峰分別定性為熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸。由此，通過(guò)采用上述測(cè)定分析條件可以有效地對(duì)鵝去氧膽酸原料藥中的雜質(zhì)熊去氧膽酸進(jìn)行分離測(cè)定。同時(shí)還可以對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè)分析。

實(shí)施例2

1、樣品：供試品溶液和對(duì)照品溶液分別同實(shí)施例1。

2、測(cè)定條件：

儀器：Agilent1260高效液相色譜儀，ELSD檢測(cè)器

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(250×4.6mm,5μm)；

流動(dòng)相A：0.01體積％三氟乙酸

流動(dòng)相B：甲醇

A:B＝70:30(體積比％)，等度洗脫

流速：0.8ml/min

霧化管溫度：40℃

蒸發(fā)管溫度：50℃

柱溫：25℃

進(jìn)樣體積：5μl

稀釋劑：甲醇:水＝40:60(v/v)

運(yùn)行時(shí)間：20分鐘

載氣：氮?dú)?，流速?.0SLM

3、樣品檢測(cè)：

采用上述測(cè)定條件，分別對(duì)配制的供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，分別記錄色譜圖記作圖3、圖4。

結(jié)論：首先，通過(guò)圖4可以清楚地看到，通過(guò)采用上述測(cè)定分析條件可以有效地將熊去氧膽酸與鵝去氧膽酸進(jìn)行分離，且熊去氧膽酸的檢測(cè)限度可以達(dá)到1μg/mL。

其次，通過(guò)將圖3與圖4進(jìn)行比較，可以將圖3中保留時(shí)間9.009min和12.720min的色譜峰分別定性為熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸。由此，通過(guò)采用上述測(cè)定分析條件可以有效地對(duì)鵝去氧膽酸原料藥中的雜質(zhì)熊去氧膽酸進(jìn)行分離測(cè)定。同時(shí)還可以對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果也表明該方法可用于鵝去氧膽酸原料藥的質(zhì)量檢測(cè)。

實(shí)施例3

1、樣品：精密稱(chēng)取鵝去氧膽酸原料藥25mg，置于50ml容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。另取鵝去氧膽酸對(duì)照品同法配制得對(duì)照品溶液。

2、測(cè)定條件：

儀器：Agilent1260高效液相色譜儀，380-ELSD檢測(cè)器

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(250×4.6mm,5μm)；

流動(dòng)相A：0.05體積％甲酸

流動(dòng)相B：乙腈

A:B＝60:40(體積比％)，等度洗脫

流速：0.9ml/min

霧化管溫度：40℃

蒸發(fā)管溫度：45℃

柱溫：30℃

進(jìn)樣體積：10μl

稀釋劑：乙腈:水＝40:60(v/v)

運(yùn)行時(shí)間：20分鐘

載氣：氮?dú)猓魉贋?.0SLM

3、樣品檢測(cè)：

采用上述測(cè)定條件，分別對(duì)配制的供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，分別記錄色譜圖記作圖5、圖6。

結(jié)論：由于含量測(cè)定的樣品濃度低于有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的樣品濃度，故供試品色譜圖中看不到熊去氧膽酸的峰。由圖6可知保留時(shí)間14.594min的色譜峰可定性為鵝去氧膽酸。由此，通過(guò)采用已知含量的對(duì)照品峰面積可計(jì)算得到供試品的含量，從而有效地對(duì)鵝去氧膽酸原料藥進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果也表明該方法可用于鵝去氧膽酸原料藥的質(zhì)量檢測(cè)。

對(duì)比例

1、樣品：供試品溶液和對(duì)照品溶液分別同實(shí)施例1。

2、測(cè)定條件：

儀器：Agilent1260高效液相色譜儀，380-ELSD檢測(cè)器

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(250×4.6mm,5μm)；

流動(dòng)相A：0.15體積％甲酸

流動(dòng)相B：乙腈

A:B＝50:50(體積比％)，等度洗脫

流速：1.0ml/min

霧化管溫度：30℃

蒸發(fā)管溫度：35℃

柱溫：30℃

進(jìn)樣體積：10μl

稀釋劑：乙腈:水＝70:30(v/v)

運(yùn)行時(shí)間：20分鐘

載氣：氮?dú)?，流速?.0SLM

3、樣品檢測(cè)：

采用上述測(cè)定條件，對(duì)配制對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，分別記錄色譜圖記作圖7。

結(jié)論：首先，通過(guò)圖7可以清楚地看到，通過(guò)采用上述測(cè)定分析條件鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸的分離效果不好，熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸分不開(kāi)。由此可知，采用0.15體積％甲酸作為流動(dòng)相A，并不能達(dá)到良好的分離效果。

在本發(fā)明的描述中，需要理解的是，術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。

在本說(shuō)明書(shū)的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說(shuō)明書(shū)中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。