本發(fā)明涉及疾病蛋白研究領(lǐng)域，尤其是涉及一種Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白及分析方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

Alport綜合征(Alport syndrome，AS)，是一種主要表現(xiàn)為血尿、腎功能進(jìn)行性減退、神經(jīng)性耳聾和眼部異常的遺傳性腎小球基底膜(glomerularbasementmembrane，GBM)疾病。AS是由編碼Ⅳ型膠原α3、α4、α5鏈的編碼基因COL4A3、COL4A4和COL4A5突變導(dǎo)致的一種基底膜疾病。迄今報(bào)道上述基因的突變位點(diǎn)已超過500個(gè)，約85％的AS病例為X性連鎖AS，其余15％為常染色體隱性遺傳AS，而常染色體顯性遺傳AS非常罕見。腎臟損害是AS的最主要的癥狀，幾乎在所有患者都會(huì)表現(xiàn)血尿、蛋白尿等腎臟損害的癥狀，AS約占終ESRD病人總數(shù)的0.3％～2.3％。

AS的腎臟損害的發(fā)生主要是由于編碼Ⅳ型膠原的COL4An基因異常突變引起的。Ⅳ型膠原是由三條α鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)蛋白。目前發(fā)現(xiàn)有6種不同的α鏈(α1～α6)，6條α鏈可形成三種三螺旋結(jié)構(gòu)蛋白前體，分別為α1α1α2(Ⅳ)、α3α4α5(Ⅳ)和α5α5α6(Ⅳ)。在腎小球中，α1α1α2(Ⅳ)異構(gòu)體可由足細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞產(chǎn)生。但是，GBM上α3α4α5(Ⅳ)異構(gòu)體只能由足細(xì)胞產(chǎn)生，其中α3鏈的生成是異構(gòu)體形成的關(guān)鍵因素。因此，足細(xì)胞也是AS發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵細(xì)胞之一。由于AS的α3α4α5(Ⅳ)異構(gòu)體沒有正常產(chǎn)生，導(dǎo)致GBM的機(jī)械穩(wěn)定性下降及撕裂。GBM作為腎臟的濾過屏障，AS患者的蛋白尿與足細(xì)胞定位的改變、足突的融合和裂孔隔膜的改變有關(guān)。有研究表明，病變的足細(xì)胞可以傳遞損害給鄰近正常的足細(xì)胞。隨著時(shí)間的變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞外的基質(zhì)大量沉積和腎小球硬化。

在人類AS及動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)有層粘連蛋白α1β1γ1和α2β1γ1的異常沉積，尤其是波浪狀增厚的GBM上。有研究發(fā)現(xiàn)在AS患者的GBM上細(xì)胞外基質(zhì)和層粘連蛋白α5沉積以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)的上調(diào)，基膜的增厚與MMP-9以及MMP-14的上調(diào)呈正相關(guān)。AS患者的GBM不成熟的層粘連蛋白α1β1γ1和α5β1γ1異構(gòu)體取代了成熟的層粘連蛋白α5β2γ1異構(gòu)體。整合素和層粘連蛋白α5β2γ1異構(gòu)體之間相互作用會(huì)破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和激動(dòng)信號(hào)傳遞。不同類型的細(xì)胞之間調(diào)節(jié)是通過整合素及其他受體來完 成的，Ⅳ型膠原鏈之間特異性的綁定即是如此。盤狀結(jié)構(gòu)域受體(discoidindomainreceptor1，DDR1)分布在腎小球與內(nèi)耳，DDR1與Ⅳ型膠原之間的相互作用以及Ⅳ型膠原與α2β1之間的相互作用對GMB和足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整以及濾過能力至關(guān)重要。敲除上述受體的小鼠模型會(huì)導(dǎo)致輕度蛋白尿、局限性腎小管間質(zhì)纖維化和GBM波狀增厚。此外，在上述小鼠還發(fā)現(xiàn)了部分裂孔隔膜消失及足突融合。

因此，研究AS的發(fā)病機(jī)理，尤其是蛋白表達(dá)差異具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種可用于AS的發(fā)病機(jī)理研究的Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白及分析方法和應(yīng)用。

一種Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白的分析方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，分別提取Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和健康人的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的總蛋白，得到兩組蛋白樣本；

步驟二，分別對兩組所述蛋白樣本進(jìn)行還原烷基化處理，得到兩組蛋白樣本溶液；

步驟三，分別向兩組蛋白樣本溶液中加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解處理；

步驟四，使用不同的標(biāo)記試劑，分別對酶解處理后的兩組樣本進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記處理，并將標(biāo)記處理后的Alport綜合征患者組與健康人的樣本溶液混合；

步驟五，對混合后的樣本進(jìn)行強(qiáng)陽離子交換分離處理；

步驟六，對強(qiáng)陽離子交換分離處理后的樣本進(jìn)行液相色譜分離，再將液相色譜分離的肽段進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析；

步驟七，使用蛋白質(zhì)鑒定軟件對質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，根據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平，分析得到Alport綜合征患者與健康人的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白。

上述Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白的分析方法得到差異表達(dá)蛋白，包括表達(dá)上調(diào)的NEFL、PSME4、UTF1、RBM14、AIF1L、STOM、FGF2、SF3B14、DNMT3A、IK、Keratin-18、CRYZ、RG9MTD1、MTHFD2、HIST1H1A、CPT1A、UBXN4及SEMA6A，以及表達(dá)下調(diào)的Keratin-14、Keratin-10、SRSF2、TUBA1A、Keratin-9、Keratin-5、MRPL27、Keratin13、APLP2、PAPSS1、SURF4、RCN3、EIF1AY、APEX1、ACBD3、UBA2及NLGN4X。

上述差異表達(dá)蛋白在制備診斷Alport綜合征的檢測芯片或檢測試劑中的應(yīng) 用。

通過采用iTRAQ技術(shù)聯(lián)合液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)和正常人的iPSCs之間的差異表達(dá)蛋白，篩選早期診斷Alport綜合征的生物標(biāo)記物及可能的治療靶點(diǎn)。由于Alport綜合征為一種多器官并發(fā)性綜合病征，分析得到的差異表達(dá)蛋白可以為診斷Alport綜合征提供中間結(jié)果信息，為進(jìn)一步研究Alport綜合征的發(fā)病機(jī)制及潛在的治療靶點(diǎn)提供技術(shù)支持。

附圖說明

圖1為Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞形態(tài)；

圖2為誘導(dǎo)的Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞核型特征圖；

圖3為流式細(xì)胞儀檢測的干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物示意圖；

圖4為PCR檢測內(nèi)源性O(shè)CT4基因在原代細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞株中的表達(dá)結(jié)果圖；

圖5為樣品蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖6為iPSCs樣品蛋白SDS-PAGE圖譜；

圖7為樣品肽段譜圖匹配質(zhì)量誤差分布圖；

圖8為鑒定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布圖；

圖9為肽段序列長度分布示意圖；

圖10為肽段序列覆蓋度分布示意圖；

圖11為鑒定肽段數(shù)量分布圖；

圖12為蛋白質(zhì)豐度分布示意圖；

圖13為GO分類示意圖；

圖14為蛋白質(zhì)的COG功能分類示意圖。

具體實(shí)施方式

下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白及分析方法和應(yīng)用作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

1.實(shí)驗(yàn)對象

本實(shí)施例的研究對象是誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)，包括實(shí)驗(yàn)組和對照組，其中，實(shí)驗(yàn)組的iPSCs可采用如下方法制備，對照組的iPSCs標(biāo)本來自于中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院潘光錦課題組饋贈(zèng)健康人的iPSCs?；颊咧椴⑶彝鈪⒓颖緦?shí)施例，實(shí)驗(yàn)通過了暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(深圳市人民醫(yī)院)的倫理委員會(huì)的審核。

2.Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的構(gòu)建

2.1實(shí)驗(yàn)材料

通過研究，發(fā)現(xiàn)一Alport綜合征家系，其現(xiàn)存38人經(jīng)過電鏡確診為X-連鎖顯性遺傳(X-linkedAlportsyndrome，XLAS)Alport綜合癥，在該XLAS家系中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的COL4A5基因的剪接位點(diǎn)突變c.1517-1G>T。本實(shí)施例收集該家系的一位現(xiàn)年39歲女性患者為研究對象，排除了該患者患有其它全身性疾病。

本研究遵循世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言和中國GPC制定的道德、倫理原則，所有受試者在參加研究前，均了解研究內(nèi)容，自愿參加，同時(shí)簽署書面知情同意書。這項(xiàng)研究得到暨南大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院(深圳市人民醫(yī)院)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2.2主要的實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

2.3實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1Alport綜合征患者尿液腎管狀細(xì)胞的收集

(1)采集尿液：用濃度5％碘伏消毒Alport患者尿道口皮膚2遍，用已加入5ml雙抗的無菌廣口玻璃瓶收集患者清晨中段尿300ml左右，尿液標(biāo)本放至4℃冰箱保存。

(2)收集尿液細(xì)胞：75％酒精消毒廣口玻璃瓶，在超菌臺(tái)里分裝尿液至50ml 離心管，400g離心10分鐘。

(3)吸棄離心管上層尿液，將底層細(xì)胞懸液吸至一50ml離心管之中，加PBS液至50ml，400g離心10分鐘。

(4)重復(fù)(3)步驟一次。

(5)鋪板：將1％Gelatin鋪至6孔板中，放至37℃培養(yǎng)箱中30分鐘以上。

(6)培養(yǎng)細(xì)胞：取出離心管，吸棄上層液體，留置下層懸液，加入2mlREGM尿液培養(yǎng)基重懸，之后將重懸液吸至(5)中6孔板的一個(gè)孔，搖勻后放入37℃培養(yǎng)箱中。

(7)細(xì)胞換液及貼壁：約2-3天換液一次，約一周左右可以觀察到細(xì)胞呈集落現(xiàn)象。

(8)傳代：根觀察細(xì)胞的生長速度及形態(tài)，細(xì)胞密度大于90％，大概半月左右可傳代或者凍存。

2.3.2Alport綜合征患者iPSCs的誘導(dǎo)

質(zhì)粒PEP4-E02S-ET2K及PCEP4-miR302-367由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院潘光錦課題組提供。

(1)準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)染的尿腎管狀細(xì)胞：37℃Matrigel包被培養(yǎng)皿30分鐘以上，為提高轉(zhuǎn)染的效率，選擇P3代的生成較好的尿細(xì)胞，PBS洗兩遍后，0.25％胰酶將細(xì)胞消化分散。準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)皿(細(xì)胞密度1×10⁶/10cm²)。

(2)電轉(zhuǎn)染

a：吸取1×10⁶個(gè)尿細(xì)胞，200g離心5分鐘，棄上清。

b：按Amaxa^TMBasicNucleofector^TMKitforprimarymammalianEpithelialcells試劑盒說明，加入BasicNucleofector^TMSolutionforMammalianEpithelialCells 82μl，supplement 18μl，重懸細(xì)胞。

c：將重旋細(xì)胞加入oriP/EBNAl附加體載體(episomalvectors)質(zhì)粒PEP4-E02S-ET2K及PCEP4-miR302-367，混勻處理。

d：將混勻物加至電轉(zhuǎn)杯，注意加液速度，防止產(chǎn)生氣泡。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀，電轉(zhuǎn)程序選擇T-020。

e：電轉(zhuǎn)后，取出電轉(zhuǎn)杯，加入適量REGM培養(yǎng)基至37℃Matrigel包被培養(yǎng)皿30分鐘以上10cm²培養(yǎng)皿，將電轉(zhuǎn)好的混合液加入培養(yǎng)皿，放入37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中。

(3)換液：觀察細(xì)胞的生長情況，大概24h后，細(xì)胞貼壁良好，密度＞70％左右，吸棄REGM培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，加入適量mTeSRl培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中。

(4)挑取克?。好咳論QmTeSRl培養(yǎng)基，大概20天左右，可在顯微鏡下觀察帶形態(tài)與人胚胎干細(xì)胞相近的克隆，將克隆挑選出來，即為原代iPSCs。

2.3.3 Alport綜合征患者iPSCs的鑒定

(1)iPSCs克隆形態(tài)學(xué)及特征觀察。

(2)細(xì)胞核型分析。

(3)流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞標(biāo)志性抗原表達(dá)。

(4)RT-PCR檢測人內(nèi)源干細(xì)胞標(biāo)志性基因OCT4基因表達(dá)水平。

2.4結(jié)果

2.4.1誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)形態(tài)

顯微鏡下觀察誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞呈扁平狀，邊緣光滑，細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比例較高，類似人胚胎干細(xì)胞，見圖1。

2.4.2Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞核型分析。

上述誘導(dǎo)的女性Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞正常核型特征圖如圖2所示。

2.4.3流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞標(biāo)志性抗原表達(dá)

流式細(xì)胞儀檢測的干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物分析結(jié)果如圖3所示，其中，A:Oct4；B:SSEA4,C:TRA-1–6；D:TRA-1–8。

2.4.4PCR檢測內(nèi)源OCT4基因在原代細(xì)胞和誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞細(xì)胞株中的表達(dá)

PCR檢測內(nèi)源OCT4基因在原代細(xì)胞和誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞細(xì)胞株中的表達(dá)結(jié)果如圖4所示，其中，1：maker2000；2：Oct4；3：SV40LT；4：Sox2；5：Klf4；6：oriP；7：EBNA1；8：Oct4；9：maker2000；10：Oct4；:11：SV40LT；12：Sox2；13：Klf4；14：oriP；15：EBNA1；16：Oct4endo；17：maker2000；2-8為Alport綜合征患者iPSCs；10-16為原代細(xì)胞。

3.Alport綜合征患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白研究

3.1主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

3.2 Alport綜合征組iPSCs與對照組iPSCs的復(fù)蘇及處理

(1)戴好防護(hù)裝備從液氮中取出iPSCs凍存管，在雙手之中來回搓10-15秒，直至凍存管表面的霜消失。

(2)迅速將凍存管放置37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，注意觀察凍存管里面細(xì)胞溶解的狀態(tài)，不要讓水淹沒過凍存管管蓋。

(3)當(dāng)凍存管中只殘留少量冰狀物時(shí)(大約2分鐘)，將凍存管從水浴鍋中取出。記錄好凍存管壁上的細(xì)胞名稱、代數(shù)，用75％酒精擦拭凍存管的表面，待酒精蒸發(fā)后，放入超菌臺(tái)。

(3)打開凍存管管蓋，用巴氏吸管轉(zhuǎn)移1ml凍存的iPSCs至15ml離心管中，緩慢滴加4ml新鮮的mTeSr1培養(yǎng)基，邊吹打、邊搖勻，使其混勻。

(4)混勻后，放入離心機(jī)離心200g，3-5分鐘，吸棄上清液。將2.5mlmTeSr1培養(yǎng)基加入至6孔板的每一空，輕輕吹打重懸，接種于feeder孔板中，6孔板的每一孔均復(fù)蘇一管凍存管的iPSCs。放入含5％二氧化碳，37℃培養(yǎng)箱里。

(5)復(fù)蘇后第二天觀察細(xì)胞生長情況，若細(xì)胞貼壁不多，則加入1ml新鮮mTeSr1培養(yǎng)基；如果細(xì)胞貼壁較多，則加入2ml的培養(yǎng)基。

(6)每天觀察細(xì)胞生長情況，根據(jù)生長情況更換培養(yǎng)基。

(7)當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到95％，取出6孔板，棄去培養(yǎng)基，每孔用1mlDMEM/F12培養(yǎng)基洗一遍，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入1ml Dispase酶，放置含5％二氧化碳，37℃培養(yǎng)箱里3分鐘左右，取出6孔板，在顯微鏡下觀察，如果克隆開始卷邊即停止消化。吸棄Dispase，每孔用1mlDMEM/F12培養(yǎng)基洗脫三遍。

(8)把巴氏吸管燒成彎針形狀，將細(xì)胞克隆從6孔板刮下至15ml離心管中，刮完后加入少量mTeSr1培養(yǎng)基沖洗板底，將離心管放入離心機(jī)，1130r/min，離心5分鐘，吸棄上清液，加入1ml凍存液，輕輕吹打2-3次，轉(zhuǎn)移至凍存管中，放入-80℃冰箱中備用。

3.3蛋白樣品準(zhǔn)備

(1)將上述凍存的iPSCs復(fù)蘇，按上述方法培養(yǎng)至細(xì)胞生長密度達(dá)到95％。

(2)吸棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗2遍，吸棄PBS緩沖液。6孔板每孔加入100μl的蛋白抽取液，之后分別添加終濃度為1mM的PMSF、2mM的EDTA，5分鐘后，添加終濃度10mM的DTT。冰浴超聲15分鐘，2sec/3sec，然后25,000×g離心20分鐘，取上清。

(3)上清液加入終濃度10mMDTT在56℃處理1小時(shí)，再次加入IAM至終濃度55mM，常溫下放于暗處45分鐘。

(4)加入上清液5倍體積的冰丙酮至上清液中，放置于-20℃冰箱2小時(shí)，然后25,000×g離心20分鐘，吸棄上清液。

(5)將沉淀在200μl0.5M四乙基溴化銨(TEAB)中超聲溶解15分鐘。25,000×g離心20分鐘，取上清液，即是細(xì)胞總蛋白溶液。

(6)采用Bradford方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取10個(gè)1.5ml的離心管，一次加入濃度為0.2μg/μl的牛血清白蛋白0、2、4、6、8、10、12、14、16、18μl。再向每管加入20μl的純水，即每管含蛋白0、0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8、3.2、3.6μg蛋白(其中第一管為空白對照組)。

(7)每個(gè)離心管加入20μl蛋白溶解液，再依次加入180μl Proteinassay reagent，輕輕搖勻，常溫下孵育10分鐘。

(8)設(shè)置酶標(biāo)儀吸光度為595nm，以第一管作為參照物，讀出每個(gè)樣品管的吸收率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每一管蛋白的濃度。

3.4 SDS電泳

(1)12％SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)配方

(2)每個(gè)蛋白樣本分別與4×loading buffer混合，95℃加熱5min。每個(gè)樣品上樣量為30μg，Marker上樣量10μg。120V恒壓電泳2小時(shí)。

(3)取下凝膠，考馬斯亮藍(lán)染色2小時(shí)，再用脫色液脫色3～5次，每次30分鐘。

3.5蛋白質(zhì)酶解

(1)每份蛋白質(zhì)樣本取100μg。

(2)分別加入40μl胰蛋白酶緩沖液(5μg胰蛋白酶加入40μlDissolutionbuffer配制)，放置37℃培養(yǎng)箱中酶解4小時(shí)。

(3)取出后，再次加入40μl胰蛋白酶緩沖液(5μg胰蛋白酶加入40μlDissolutionbuffer配制)，放置37℃培養(yǎng)箱中酶解8小時(shí)。

3.6iTRAQ(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，相對和絕對定量的等量異位標(biāo)簽)標(biāo)記

(1)胰蛋白酶消化后，使用真空離心泵將肽段冷凍抽干。

(2)用0.5M TEAB復(fù)溶肽段至iTRAQ標(biāo)記所需要的溶度，iTRAQ標(biāo)記操作按8-plexiTRAQ(AppliedBiosystems)的手冊進(jìn)行，其中，標(biāo)記試劑116用于標(biāo)記Alport綜合征患者iPSCs組，標(biāo)記試劑118用于標(biāo)記對照組。

(3)在室溫下孵育2小時(shí)，隨后將兩管樣本混合。將混合樣本用真空離心泵冷凍烘干。

3.7強(qiáng)陽離子交換(Strongcationexchange，SCX)分離

(1)使用ShimadzuLC-20AB液相系統(tǒng)、分離柱為4.6×250mm型號(hào)的UltremexSCX柱對樣品進(jìn)行SCX分離。

(2)將3.3.5得到的混合肽段用4mLbufferA(25mMNaH2P04in25％CAN，pH2.7)進(jìn)行復(fù)溶。

(3)將復(fù)溶后的樣品上樣到裝有5-10μm的4.6x250mmUltremexSCX圓柱 中。

(4)梯度洗脫的流量為1mL/min。通過測量214nm吸光度監(jiān)測洗脫過程，經(jīng)過篩選得到20個(gè)組分。分別用StrataX除鹽柱除鹽，之后冷凍抽干。

3.8基于QE的液質(zhì)聯(lián)用分析

本實(shí)施例液相串聯(lián)質(zhì)譜分析由深圳華大基因公司提供。

(1)將抽干的各組組分用bufferA(含5％CAN及0.1％FA)復(fù)溶至約0.5μg/μl的濃度，20000×g離心10分鐘，棄去不溶物質(zhì)。

(2)每個(gè)組分上樣5μl(約2.5μg蛋白)，通過Shimadzu公司LC-20AD型號(hào)的納升液相色譜儀進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)分離。

(3)經(jīng)過液相分離的肽段進(jìn)入到串聯(lián)ESI質(zhì)譜儀：Q-EXACTIVE(ThermoFisherScientific,SanJose,CA)。一級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)置為70000，二級(jí)分辨率為17500。在母離子中挑選電荷為2⁺～5⁺，峰強(qiáng)度超過20000的15個(gè)母離子進(jìn)行二級(jí)分析，用碰撞能量為27(±12％)的HCD模式對肽段進(jìn)行碎裂，碎片在Orbi中檢測，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)定為：色譜半峰寬時(shí)長。離子源電壓設(shè)置為1.6千伏。AGC通過orbi來實(shí)現(xiàn)，其設(shè)置為：一級(jí)3E6到二級(jí)1E5。掃描的質(zhì)荷比范圍為一級(jí)350～2000，二級(jí)100～1800。

4.生物信息學(xué)分析

4.1信息分析流程

(1)原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)：將下載得到質(zhì)譜原始文件，轉(zhuǎn)換成mgf格式(sample.mgf)，進(jìn)行峰識(shí)別，得到峰列表。

(2)數(shù)據(jù)庫的選擇：本實(shí)施例選擇的數(shù)據(jù)庫：IPIhumanv3.87(91464Seuqences)。

(3)Mascot搜索：Mascot是一個(gè)蛋白質(zhì)鑒定軟件，本實(shí)施例所用的版本為Mascot2.3.02，以mgf文件為原始文件，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。搜索參數(shù)見表4-1。

表4-1 Mascot鑒定相關(guān)參數(shù)選擇

(4)蛋白質(zhì)鑒定信息統(tǒng)計(jì)：依據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平，當(dāng)差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其p-value值小于0.05時(shí)，視為差異表達(dá)蛋白。

(5)蛋白功能注釋及差異表達(dá)蛋白分析：包括GO注釋，COG注釋，Pathway代謝通路注釋，差異表達(dá)蛋白的GO富集分析，差異表達(dá)蛋白的Pathway富集分析，多樣品間表達(dá)模式聚類。

5.結(jié)果及分析

5.1蛋白質(zhì)檢測

(1)樣品蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖5所示，用BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液制作獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝1.9748x+0.0012、相關(guān)系R2＝0.9972，說明標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度符合實(shí)驗(yàn)要求，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

(2)樣品蛋白質(zhì)定量

當(dāng)Bradford工作液(考馬斯亮藍(lán)G-250)和蛋白在酸性條件下結(jié)合時(shí)，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與595nm的吸光度成正線性相關(guān)關(guān)系。定量信息見表5-1。

表5-1各樣品提取蛋白質(zhì)定量檢測結(jié)果

(3)各樣品蛋白SDS電泳

分離膠的濃度為12％，Marker上樣量為12μg，Alport-iPSCs組和對照組上樣量均為20μg，SDS電泳結(jié)果見圖6，其中，M是marker，1是Alport-iPSCs，2是健康對照組iPSCs。

5.2蛋白質(zhì)鑒定

(1)譜圖匹配質(zhì)量誤差分布

質(zhì)譜儀器采用Q-Exactive，具有高分辨力和高精確度優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于大分子以及小分子的分析，對于樣品高度復(fù)雜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究尤為適合。為預(yù)防遺漏鑒定的結(jié)果，因此本實(shí)施例基于數(shù)據(jù)庫搜索策略的肽段匹配誤差控制在0.02Da以下。圖7為譜圖匹配質(zhì)量誤差分布圖。其中，橫坐標(biāo)：質(zhì)量差異，數(shù) 量級(jí)ppm；縱坐標(biāo)：Mascot數(shù)據(jù)庫離子評(píng)分。圖7顯示匹配到的肽段的相對分子量的實(shí)際值和理論值之間的誤差分布，誤差主要集中在百萬分之十之內(nèi)，即誤差鑒定結(jié)果理想。

(2)基本鑒定信息

鑒定基本信息統(tǒng)計(jì)如下：共得到280267個(gè)二級(jí)譜圖(TotalSpectra)、經(jīng)過質(zhì)量控制后鑒定到38088個(gè)譜圖(Spectra)，其中匹配到特有肽段譜圖(UniqueSpectra)數(shù)量為34727個(gè)、鑒定到的特有肽段(Peptide)數(shù)量為13188個(gè)、其中特有的肽段序列(UniquePeptide)為12600條，鑒定蛋白質(zhì)(Protein)3470。

(3)鑒定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布

如圖8所示，依照蛋白質(zhì)的想多分子質(zhì)量大小，將上面鑒定所得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，其中，橫坐標(biāo)為鑒定到的蛋白分子質(zhì)量(單位：千道爾頓，kDa)，縱坐標(biāo)為該范圍分子量的蛋白質(zhì)占鑒定蛋白數(shù)量的百分比。如圖8所示，大部分蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量集中在20-80KDa。

(4)肽段序列長度分布

如圖9所示為肽段序列長度分布，該圖表示不同長度肽段占所有肽段的百分比。橫坐標(biāo)為肽段氨基酸殘基數(shù)，縱坐標(biāo)為該長度肽段占全部肽段的百分比值。

(5)肽段序列覆蓋度

肽段序列覆蓋度分布見圖10，圖10中顯示不同肽段序列覆蓋度及其包括的蛋白數(shù)量。覆蓋度在0％-10％的蛋白數(shù)量有1334個(gè)，占總數(shù)目的38％；5％-10％的蛋白有820個(gè)，占總數(shù)目24％；10％-15％的蛋白447個(gè)，占總量的13％；15％-20％的蛋白309個(gè)，占總量的9％；20％-25％的蛋白208個(gè)，占總量的6％；25％-30％的蛋白130個(gè)，占總數(shù)4％；30％-35％的蛋白86個(gè)，占總數(shù)2％；35％-40％的蛋白58個(gè)，占總數(shù)2％；40％-100％的蛋白78個(gè)，占總數(shù)2％。

(6)Unique肽段數(shù)量分布

Unique肽段數(shù)量分布如圖11所示，顯示鑒定到的蛋白所含肽段的數(shù)量分布情況，橫坐標(biāo)為鑒定蛋白的肽段數(shù)量范圍，縱坐標(biāo)為蛋白數(shù)量。圖11中顯示的趨勢表明，大部分被鑒定到的蛋白，其所含的肽段數(shù)量在10個(gè)以內(nèi)，且蛋白數(shù)量隨著匹配肽段數(shù)量的增加而減少。

5.2蛋白質(zhì)定量

(1)差異表達(dá)蛋白統(tǒng)計(jì)

根據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平，當(dāng)差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其p-value 值小于0.05時(shí)，則表示為差異表達(dá)蛋白。本實(shí)施例中得到的差異表達(dá)蛋白總數(shù)是383個(gè)，其中上調(diào)的蛋白質(zhì)有156個(gè)，下調(diào)的蛋白質(zhì)有227個(gè)。

本實(shí)施例挑選出差異倍數(shù)大于2.0倍以上，具有代表性的差異表達(dá)蛋白，見表5-2。其中上調(diào)的蛋白有17個(gè)，下調(diào)的蛋白18個(gè)。

表5-2 Alport-iPSCs和正常人iPSCs相比有顯著表達(dá)差異的蛋白質(zhì)

(2)蛋白質(zhì)豐度比較

在相對定量時(shí)，如果同一個(gè)蛋白質(zhì)的量在兩個(gè)樣品間沒有顯著的變化，那么其蛋白質(zhì)豐度比接近于1。當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，p-value值小于0.05時(shí)，視該蛋白為不同樣品間的差異表達(dá)蛋白。對每個(gè)蛋白質(zhì)差異倍數(shù)以2為底取對數(shù)后作出分布如圖12所示。表達(dá)量上調(diào)的蛋白居于橫坐標(biāo)0位置的右側(cè)，表達(dá)量下調(diào)的蛋白居于橫坐標(biāo)0位置的左側(cè)。

圖12顯示可定量的所有蛋白質(zhì)的差異倍數(shù)的分布情況，其中橫坐標(biāo)表示差異倍數(shù)經(jīng)過以2為底數(shù)的對數(shù)轉(zhuǎn)化后的值。大于0的為表達(dá)量下調(diào)，小于0的為表達(dá)量上調(diào)。其中差異倍數(shù)大于1.2的點(diǎn)用紅色和綠色標(biāo)出(紅色為表達(dá)量下調(diào)，下降227個(gè)；綠色為表達(dá)量上調(diào)，上升156個(gè))。

(3)GO分析

針對鑒定出的所有蛋白進(jìn)行GO功能注釋分析，針對三個(gè)ontology(cellularcomponent，biologicalprocess，molecularfunction)中所涉及的GO條目，列出所有相應(yīng)的蛋白的ID及蛋白個(gè)數(shù)，除去沒有相應(yīng)蛋白的GO條目。

如圖13所示，在cellularcomponent(細(xì)胞組分)中蛋白表達(dá)最多的是cellpart(占18.31％)和organelle(占16.27％)。在biologicalprocess(生物學(xué)過程)中蛋白表達(dá)最多的是cellularprocess(13.34％)和metabolicprocess(11.02％)，在molecularfunction(分子功能)中蛋白表達(dá)最高的是binding(49.39％)，表達(dá)較多的是catalyticactivity(28.37％)，而chemoattractantactivity占0.08％。

(4)COG注釋

COG(ClusterofOrthologousGroupsofproteins)是蛋白相鄰類的聚簇的簡稱， 是對蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫。構(gòu)成每個(gè)COG的蛋白都是被假定為來自于一個(gè)祖先原始蛋白，并且是orthologs或者是paralogs.Orthologs是指來自于不同物種的由垂直家系(物種形成)進(jìn)化而來的蛋白，并且特異地保留與原始蛋白相同的功能。Paralogs是那些在一定物種中的來源于基因復(fù)制的蛋白，可能會(huì)進(jìn)化出新的與原來有關(guān)的功能。該分析將鑒定到的蛋白質(zhì)與COG數(shù)據(jù)庫比對，預(yù)測這些蛋白質(zhì)可能的功能并對其做功能分類統(tǒng)計(jì)。

如圖14所示，將已經(jīng)鑒定出來的蛋白質(zhì)與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，總共得到注釋的蛋白2795個(gè)，分屬于24種FunctionClass。蛋白數(shù)目最多的是Generalfunctionpredictiononly(R，592個(gè))，較多的是Posttranslationalmodification,proteinturnover,chaperones(O,286個(gè))、Translation,ribosomalstructureandbiogenesis(J，283個(gè))、Replication,recombinationandrepair(L，211個(gè))、Transcription(K，205個(gè))。

(5)差異表達(dá)蛋白的GO富集分析

差異表達(dá)蛋白的GO富集分析可以展現(xiàn)差異的蛋白質(zhì)與哪些生物學(xué)功能明顯相關(guān)。利用GeneOntology數(shù)據(jù)庫，將差異表達(dá)蛋白質(zhì)向該數(shù)據(jù)庫每個(gè)條目進(jìn)行映射，計(jì)算蛋白質(zhì)數(shù)目，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出差異表達(dá)蛋白質(zhì)顯著富集的GO條目。p-value≤0.05定義為閾值，代表差異表達(dá)蛋白顯著富集的GO分析。表5-3是GO-CellularComponent顯著富集分析結(jié)果，表5-4是差異表達(dá)蛋白GO-MolecularFunction顯著富集分析結(jié)果，表5-5是差異表達(dá)蛋白GO-BiologicalProcess顯著富集分析結(jié)果。

表5-3差異表達(dá)蛋白GO-CellularComponent顯著富集分析結(jié)果

表5-4差異表達(dá)蛋白GO-MolecularFunction顯著富集分析結(jié)果

表5-5差異表達(dá)蛋白GO-BiologicalProcess顯著富集分析結(jié)果

(6)差異表達(dá)蛋白的Pathway富集分析

差異表達(dá)蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可通過Pathway顯著性富集來確定。通過對比Normal-iPSCs和Alport-iPSCs差異表達(dá)的蛋白·≤0.05為閾值，規(guī)定為Normal-iPSCs和Alport-iPSCs差異表達(dá)蛋白顯著富集分析，見表5-6。結(jié)果顯示，Alport-iPSCs與Normal–iPSCs顯著差異表達(dá)的通路主要集中在金黃色葡萄球菌的感染、氨基酰-tRNA的生物合成、致病性大腸桿菌的感染、FcgammaR-mediatedphagocytosis、糖酵解、糖原異生、擴(kuò)張性心肌病、右心室心肌病、Onecarbonpoolbyfolate、Selenocompoundmetabolism、病毒性心肌炎等途徑上。

表5-6差異基因的Pathway顯著富集分析結(jié)果

本實(shí)施例采用iTRAQ技術(shù)聯(lián)合液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析Alport綜合征患者iPSCs和正常人的iPSCs之間的差異表達(dá)蛋白，篩選早期診斷Alport綜合征的生物標(biāo)記物及可能的治療靶點(diǎn)。通過對正常人的iPSCs和Alport綜合征患者iPSCs進(jìn)行對比分析，差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其p-value值小于0.05時(shí)，是差異表達(dá)蛋白。本實(shí)施例中得到的差異表達(dá)蛋白總數(shù)是383個(gè)，其中上調(diào)的蛋白質(zhì)有156個(gè)，下調(diào)的蛋白質(zhì)有227個(gè)。對所得到的的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能和KEGGpathway分析，分別得到差異表達(dá)蛋白基因的參與的生物過程(BiologicalProcess)、所處的細(xì)胞位置(CellularComponent)、分子功能(MolecularFunction)和最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

Alport綜合征患者iPSCs和正常人的iPSCs相比較，其中差異表達(dá)蛋白表達(dá)明顯下調(diào)的有Keratin-14、Keratin-10、SRSF2、TUBA1A、Keratin-9、Keratin-5、MRPL27、Keratin13、APLP2、PAPSS1、SURF4、RCN3、EIF1AY、APEX1、ACBD3、UBA2及NLGN4X等。其中，角蛋白14(Keratin-14)屬于Ⅰ型角蛋白家族的中間絲蛋白類，角蛋白14和2型角蛋白5形成異質(zhì)二聚體表達(dá)在表皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架。角蛋白10(Keratin-10)也屬于I型角蛋白家族中間絲蛋白類，參與構(gòu)成上皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架。編碼SRSF2的基因突變與慢性骨髓單核細(xì)胞性白血病患者基因突變情況有關(guān)。TUBA1A屬于微管蛋白家族，參與構(gòu)成軸突化細(xì)胞骨架，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遠(yuǎn)的生長和再生，編碼TUBA1A的基因發(fā)生突變，可以導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，例如無腦回畸形，CA3區(qū)域的異常。Keratin-9為Ⅰ型角蛋白，表皮松解性掌躊角化癥與編碼Keratin-9的基因突變有關(guān)。Keratin-5為Ⅱ型角蛋白，參與構(gòu)成上皮細(xì)胞的基底層，編碼Keratin-5基因突變可導(dǎo)致Dowling-Degos病。Keratin13屬于I型角蛋白家族，與Keratin4形成異質(zhì)二聚體參與構(gòu)成，編碼Keratin13的基因突變可能與白色海綿狀斑痣有關(guān)。

Alport綜合征患者iPSCs和正常人的iPSCs差異表達(dá)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)的有NEFL、PSME4、UTF1、RBM14、AIF1L、STOM、FGF2、SF3B14、DNMT3A、IK、Keratin-18、CRYZ、RG9MTD1、MTHFD2、HIST1H1A、CPT1A、UBXN4及SEMA6A等。

NEFL是神經(jīng)絲輕鏈基因編碼，編碼NEFL的基因突變與肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥的發(fā)生有關(guān)，NEFL蛋白與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的生長及侵襲有關(guān)。UTF1啟動(dòng)子的甲基化異常與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，UTF1對多能干細(xì)胞的多能性有影響。AIF1L是同種異體移植炎癥因子基因編碼，又稱離子化Ca²⁺結(jié)合調(diào)節(jié)器，在睪丸 和脾臟組織中表達(dá)較高，在腎臟、腦組織、肺、表達(dá)較低，有研究表明在日本海參收到傷害及細(xì)菌感染時(shí)AIF1表達(dá)升高，AIF1也可以作為肺癌管理β連環(huán)蛋白獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。FGF2蛋白是纖維母細(xì)胞生長因子家族的一員，可促進(jìn)細(xì)胞的分裂，可促進(jìn)體外間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力，維持間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力，F(xiàn)GF-2可使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為未成熟的成骨細(xì)胞。DNMT3A是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的一種，參與DNA的甲基化過程，DNMT3A在腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)和沉默中起重要的作用。Keratin-18屬于Ⅰ型角蛋白家族中間絲蛋白類，主要作用是保護(hù)肝細(xì)胞細(xì)胞免受損傷，編碼Keratin-18的基因突變會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞的滲漏和壞死。

Alport綜合征是由編碼Ⅳ型膠原α3、α4、α5鏈的編碼基因COL4A3、COL4A4和COL4A5突變導(dǎo)致的一種基底膜疾病。Alport-iPSCs與對照組對比，Keratin-14、Keratin-10、Keratin-9、Keratin-5及Keratin13的表達(dá)是明顯的下調(diào)，可能與Alport綜合征的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。FGF2蛋白表達(dá)明顯的下調(diào)，F(xiàn)GF2蛋白可促進(jìn)干細(xì)胞的分化，通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)很多蛋白質(zhì)與細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)成分有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究。差異表達(dá)蛋白的Pathway富集分析發(fā)現(xiàn)主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括氨基酰-tRNA的生物合成、細(xì)菌的感染、心肌炎、糖酵解、糖原合成等有關(guān)。

上述分析篩選得到的差異表達(dá)蛋白可以廣泛應(yīng)用在制備診斷Alport綜合征的檢測芯片或檢測試劑中，如制備相應(yīng)的蛋白的單克隆抗體，并結(jié)合蛋白芯片技術(shù)，為Alport綜合征的早起診斷提供中間結(jié)果支持，并有利于對確診的Alport綜合征患者的發(fā)病機(jī)制展開研究。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。