本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種黑果枸杞中花色苷類化合物的選擇性富集方法，具體地說是一種采用強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱在低pH條件下選擇性地富集花色苷類化合物的新方法，該方法對(duì)復(fù)雜體系中花色苷類化合物的富集表現(xiàn)出較優(yōu)的分離效果。

背景技術(shù)：

花色苷是一種廣泛存在于自然界植物中的天然水溶性色素?；ㄉ諏儆邳S酮類化合物。它由于其獨(dú)特的功能性，而被應(yīng)用于清除體內(nèi)自由基、增殖葉黃素、抗腫瘤、抗癌、抗炎、抑制脂質(zhì)過氧化和血小板凝集、預(yù)防糖尿病、減肥、保護(hù)視力等。(Hou,D.X.(2003).Potential mechanisms of cancer chemoprevention by anthocyanins.Current Molecular Medicine,3(2),149-159；Olsson,M.E.,Gustavsson,K.E.,Andersson,S.,Nilsson,A.,&Duan,R.D.(2004).Inhibition of cancer cell proliferation in vitro by fruit and berry extracts and correlations with antioxidant levels.Journal of Agricultural and Food Chemistry,52(24),7264-7271)。然而，多數(shù)活性實(shí)驗(yàn)采用的是花色苷粗提物，由于大量非花色苷類化合物的存在，嚴(yán)重影響了花色苷類化合物生物活性的研究。

黑果枸杞中含有豐富的花色苷類化合物。由于花色苷類化合物與樣品中非花色苷類雜質(zhì)疏水性相似，常規(guī)反相方法制備花色苷組分較為低效、耗時(shí)，且選擇性較差。因此，采用高效的類分離方法從黑果枸杞中制備花色苷類組分，對(duì)于開展相關(guān)生物活性研究具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問題，本發(fā)明的技術(shù)目的是提供一種利用強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱選擇性富集黑果枸杞中花色苷類化合物的方法。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供一種黑果枸杞中花色苷類化合物的選擇性富集方法：

1)黑果枸杞樣品的制備：黑果枸杞的酸化乙醇提取物經(jīng)弱極性大孔樹脂進(jìn)行分離得到黑果枸杞樣品，其中黑果枸杞酸化乙醇提取物的pH為1-4；

2)花色苷類化合物粗組分的制備：將得到的黑果枸杞樣品過強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱，富集樣品中的花色苷類化合物粗組分；

3)花色苷類化合物精組分的制備：將得到的花色苷類化合物粗組分經(jīng)弱極性大孔樹脂脫鹽制備得到精組分。

所述的弱極性大孔樹脂為AB-8大孔樹脂、D101或HPD100。

步驟1)所述的黑果枸杞提取物的制備方法為：稱取一定量的黑果枸杞果實(shí)，用5-30倍量的50％-95％乙醇溶液浸泡提取1-5次，每次浸泡時(shí)間為1-3小時(shí)，其中，乙醇溶液中加入鹽酸、甲酸、三氟乙酸中的一種或兩種以上，調(diào)節(jié)乙醇溶液pH 值至1-3，合并提取液抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃條件下減壓回收乙醇，得到濃縮液，將濃縮液上AB-8大孔樹脂、D101或HPD100大孔吸附樹脂柱，先用3-5倍柱體積的蒸餾水或10％-30％乙醇溶液淋洗，然后用3-5倍柱體積50％-95％的乙醇洗脫花色苷，收集洗脫液，減壓濃縮，最后真空冷凍干燥，即黑果枸杞樣品，干燥過程中物料溫度不得超過70℃，真空度為20-50Pa。

固相萃取柱為強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱(XCharge SCX)，固相萃取柱參數(shù)為0.5-20g，1-60mL，dp＝10μm-100μm。

步驟2)中所述的花色苷類化合物粗組分的制備方法為：稱取一定量黑果枸杞樣品溶解于甲酸水溶液中，其中甲酸體積濃度為0.1％-0.5％，樣品濃度為10mg/mL-200mg/mL，用3-10倍柱體積量的甲醇溶液活化及平衡SCX SPE柱，抽干SPE柱，上樣，上樣量為1mg-500mg，采用線性梯度、臺(tái)階梯度或等度洗脫方式，黑果枸杞樣品經(jīng)過兩次淋洗，淋洗1：10-100mL 5％-50％(v/v)乙腈-甲酸水溶液，酸水溶液體積濃度為0.1％-0.5％，流速為1mL/min-30mL/min；淋洗2：10～100mL 10％～60％(v/v)乙腈水溶液，溶液中加入0.1M～2M磷酸二氫鈉，使淋洗2的pH值保持在1-3，流速為1mL/min-30mL/min，收集洗脫液，減壓濃縮，至有機(jī)溶劑完全除去，即得花色苷粗組分，干燥過程中物料溫度不得超過70℃，真空度為20-50Pa。

步驟3)中所述的花色苷類化合物精組分的制備過程為，花色苷粗組分上AB-8大孔樹脂、D101或HPD100大孔吸附樹脂柱，先用3-5倍柱體積的蒸餾水或10％-30％乙醇溶液淋洗，然后用3-5倍柱體積50％-95％的乙醇洗脫花色苷，收集洗脫液，減壓濃縮，最后真空冷凍干燥，即黑果枸杞精組分，干燥過程中物料溫度不得超過70℃，真空度為20-50Pa。

本發(fā)明的有益效果

該方法可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系中花色苷類化合物的選擇性富集，解決了該類化合物與雜質(zhì)在反相材料上“共流出”的問題，實(shí)現(xiàn)了該類化合物的類分離。因此，本發(fā)明建立了一種花色苷類化合物選擇性富集的新方法，為該類化合物生物活性的深入研究提供技術(shù)支撐。

附圖說明

圖1中(A)、(B)分別為黑果枸杞提取物和花色苷精組分液相分析結(jié)果。

圖2為黑果枸杞提取物和花色苷精組分的總花色苷含量測(cè)定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合實(shí)例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，實(shí)例僅限于說明本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限定。

本發(fā)明使用的強(qiáng)陽離子固相萃取柱XCharge SCX為北京華譜新創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)。

實(shí)施例1

1)黑果枸杞70％(v/v)乙醇-甲酸水(pH 2)提取物先經(jīng)弱極性大孔樹脂分離，淋洗條件：分離材料：AB-B大孔樹脂；淋洗1：分離條件：樹脂為AB-8大孔樹脂(50×520mm)；淋洗條件為：淋洗1：純水；淋洗2：50％(v/v)乙醇- 水，回收溶劑得黑果枸杞樣品，針對(duì)上述樣品，采用XCharge SCX強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱選擇性富集其中花色苷類化合物，再經(jīng)AB-8大孔樹脂脫鹽，制備花色苷精組分。

2)針對(duì)黑果枸杞樣品，采用XCharge SCX強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱選擇性富集花色苷類化合物，固相萃取條件：固相萃取柱為強(qiáng)陽離子固相萃取柱(XCharge SCX,20g/60mL)；淋洗條件為：淋洗1：5％(v/v)乙腈-甲酸水60mL(酸水體積濃度為0.1％)；淋洗2：30％(v/v)乙腈-水60mL(1.5M磷酸二氫鈉，pH 2.5)，回收溶劑，減壓濃縮，至有機(jī)溶劑完全去除，即得花色苷粗組分。

3)針對(duì)花色苷粗組分，利用弱極性大孔樹脂進(jìn)行脫鹽。分離條件：分離材料為AB-8大孔樹脂(50×520mm)；淋洗條件為：淋洗1：甲酸/水(酸水體積濃度為1％)；淋洗2：95％(v/v)乙醇-甲酸水(酸水體積濃度為1％)，回收溶劑，減壓濃縮，最后真空冷凍干燥，即得花色苷精組分，總花色苷含量見圖2。

該方法可以實(shí)現(xiàn)花色苷類化合物的選擇性富集，提供了一種高效分離花色苷類化合物的新方法，為該類化合物生物活性的深入研究提供技術(shù)支撐。