本發(fā)明涉及免疫層析技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種軍團(tuán)菌抗原檢測試劑盒及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù):
軍團(tuán)菌為需氧的多性革蘭陰性菌,廣泛存在于自然環(huán)境中,其傳染源是水源和空調(diào)系統(tǒng),通過空氣傳播。軍團(tuán)桿菌的菌體微小,懸浮在空氣中,人在正常呼吸時,會將空氣中含有軍團(tuán)桿菌的氣溶膠吸入呼吸道內(nèi),致使軍團(tuán)桿菌有機(jī)會侵染肺泡組織和巨噬細(xì)胞,引發(fā)炎癥,導(dǎo)致軍團(tuán)菌病,易爆發(fā)流行。
軍團(tuán)桿菌可以侵犯身體內(nèi)許多器官,因此其臨床表現(xiàn)常是多種多樣。軍團(tuán)菌病根據(jù)臨床特征,一般分為兩種類型,一類為非肺炎型,病情較輕,潛伏期1~2d,似普通感冒或流感樣起病,有發(fā)熱、肌痛、咽喉疼痛、咳嗽等癥狀,約1~2周可自愈。另一類是肺炎型,潛伏期2~10d,其初發(fā)癥狀為全身不適、疲乏、肌肉酸痛、頭痛、發(fā)熱、咳嗽、胸痛、咳血、呼吸困難等,還能侵犯消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng),重癥病人可出現(xiàn)肝功能變化及腎功能衰竭,并可出現(xiàn)精神紊亂等臟器損害。
乳膠層析法是以彩色乳膠為標(biāo)記物的免疫層析法,其檢測原理與膠體金免疫層析法相類似,它不需要儀器,直接用肉眼判讀結(jié)果,具有操作簡單、快速,試劑穩(wěn)定性好,易保存,單人份獨(dú)立包裝,試劑損耗少等優(yōu)點(diǎn),適合臨床患者、健康體檢者等標(biāo)本的快速篩查。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷,從提高檢測靈敏度出發(fā),提供一種檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測快速的軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒。
本發(fā)明的第一方面公開了一種軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒,包括試劑條,所述試劑條包括襯底、濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙,所述濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于所述襯底上,所述致敏乳膠聚酯膜上包被有彩色乳膠顆粒標(biāo)記的抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-1,免疫硝酸纖維素膜上設(shè)有包 被了抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-2的檢測線和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗體的質(zhì)控線。
較優(yōu)的,所述彩色乳膠顆粒為粒徑290~300nm的聚苯乙烯顆粒。
較優(yōu)的,所述彩色乳膠顆粒的顏色為紅色。
本發(fā)明的另一方面,提供了一種軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒的制備方法,包括以下步驟:
1)致敏乳膠顆粒的制備:用羧基化的聚苯乙烯標(biāo)記抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-1,獲得致敏乳膠顆粒;
2)致敏乳膠聚酯膜的制備:用步驟1)獲得的致敏乳膠顆粒包被聚酯膜,獲得致敏乳膠聚酯膜;
3)將抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-2和羊抗鼠IgG多克隆抗體分別噴在硝酸纖維素膜檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)的位置上,烘干備用,制得免疫硝酸纖維素膜;
4)將濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在PVC片上,切裁制得試劑條;
5)將試劑條裝入塑料盒,獲得軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒。
較優(yōu)的,所述步驟1)致敏乳膠顆粒的制備為:
a.取一定體積的羧基化的聚苯乙烯,用2~3倍體積20mM pH 6.0的碳酸緩沖溶液多次沖洗、離心、棄上清,獲得羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀;
b.用1~1.5倍體積20mM pH6.0的磷酸緩沖溶液懸浮上一步獲得的羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀,并加入1~1.5倍體積的水溶性炭化二亞胺,室溫下攪拌20~30分鐘,最后用2~3倍體積0.01M pH 8.0的硼酸緩沖溶液多次沖洗、離心、棄上清,獲得待標(biāo)記物;
c.向步驟b獲得的所述待標(biāo)記物中加入2~3倍體積0.2M pH 7.0的硼酸緩沖液制成乳膠懸液,并向所述乳膠懸液中加入抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-1;
d.充分反應(yīng)過夜,加入終止劑終止反應(yīng),獲得致敏乳膠顆粒。
在致敏乳膠顆粒的制備過程中,加入的水溶性炭化二亞胺、各緩沖溶液的體積均以初始所取的羧基化的聚苯乙烯的體積為基準(zhǔn),按本發(fā)明所述的體積倍數(shù)加入:如所取的羧基化的聚苯乙烯顆粒的體積為1ml,則需要加入的pH 6.0 20mM的磷酸緩沖溶液體積可以為1~1.5ml,pH 7.0 0.2M的硼酸緩沖液的體積為2~3ml。
更優(yōu)的,所述步驟a中碳酸緩沖溶液為20mM pH 6.0含0.01%SDS的碳酸緩沖溶液。添加有SDS的碳酸緩沖溶液可以更好的洗去乳膠的表面活性物,清洗效果更好。
更優(yōu)的,所述步驟a中羧基化的聚苯乙烯濃度為6~12w/v%。
更優(yōu)的,所述步驟a中的離心條件為12000~14000rpm,離心10min。
更優(yōu)的,所述步驟b中水溶性炭化二亞胺的濃度為9~10mg/ml。
更優(yōu)的,所述步驟b中的離心條件為12000~14000rpm,離心10min。
更優(yōu)的,所述步驟c乳膠懸液中羧基化的聚苯乙烯顆粒偶聯(lián)抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-1的量為:0.5mg抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-1/10mg聚苯乙烯顆粒。
更優(yōu)的,所述步驟d中終止劑為50mM pH 8.2的Tris-HCl。
本發(fā)明中,v%指體積百分比;w/v%指重量體積百分比,如1w/v%即為100ml溶液中含1g物質(zhì)。
較優(yōu)的,所述步驟2)中致敏乳膠聚酯膜的制備具體步驟為:
A.用乳膠緩沖液稀釋致敏乳膠顆粒,獲得0.3~0.5w/v%的致敏乳膠溶液;
B.用步驟A制備好的致敏乳膠溶液噴涂聚酯膜,干燥,制得致敏乳膠聚酯膜。
更優(yōu)的,所述步驟A中的乳膠緩沖液配方如下:9~11v%1.0M Tris液,0.25~0.35w/v%聚乙二醇20000,0.18~0.20w/v%牛血清白蛋白,0.15~0.25w/v%脫脂牛奶,0.28~0.30w/v%酪蛋白,和0.04~0.06w/v%疊氮化鈉,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0±0.02,余量為水。
最優(yōu)的,所述步驟A中的乳膠緩沖液配方如下:10v%1.0M Tris液、0.3w/v%聚乙二醇20000、0.2w/v%牛血清白蛋白,0.2w/v%脫脂牛奶、0.3w/v%酪蛋白,和0.05w/v%疊氮化鈉,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0±0.02,余量為水。
進(jìn)一步較優(yōu)的,為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果,本發(fā)明所述的乳膠緩沖液還包括下列組分:果糖、氯化鉀和甘氨酸,且果糖、氯化鉀和甘氨酸的總濃度為3.25~4.75g/L,緩沖液的pH值為7.3-7.5。
更優(yōu)選的,各組分在乳膠緩沖液中的濃度為:
果糖1.0-2.0g/L;氯化鉀0.25-0.5g/L;甘氨酸2.0-2.25g/L。
更優(yōu)的,步驟B中用致敏乳膠溶液噴涂聚酯膜,每261mm×220mm聚酯膜上噴涂1.28ml致敏乳膠溶液,干燥,制得致敏乳膠聚酯膜。
較優(yōu)的,所述步驟3)中,噴在硝酸纖維素膜質(zhì)控線(C線)上的羊抗鼠IgG多克隆抗體的濃度為1.0~2.0mg/ml,噴在硝酸纖維素膜檢測線(T線)上的抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-2濃度為1.0~2.0mg/ml。較優(yōu)的,每50m長硝酸纖維素膜分別包被有6ml的羊抗鼠IgG多克隆抗 體和6ml的抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-2溶液,檢測線和質(zhì)控線的間距為4.0~6.0mm。
本發(fā)明制備的軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒靈敏度高,特異性強(qiáng)此外本發(fā)明的試劑盒還具有操作簡單,價格低,儲存和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明軍團(tuán)菌抗原檢測試劑盒的使用方法:
1.樣品的檢測:用吸管吸取樣品液2-3滴加入到樣品槽中,待檢樣品在毛細(xì)作用下向吸水紙端層析,依次通過聚酯膜、硝酸纖維素膜。到達(dá)聚酯膜后,被乳膠標(biāo)記的抗體充分識別并結(jié)合,繼續(xù)層析到硝酸纖維素膜上,與硝酸纖維素膜上包被的抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-2發(fā)生免疫反應(yīng),顯現(xiàn)出相應(yīng)的紅色線條。
2.結(jié)果的判讀:在滴加樣品后8-15分鐘判讀結(jié)果。
陽性:在檢測試劑條的檢測線和質(zhì)控線位置各出現(xiàn)一條紅色線條,表示樣品中有軍團(tuán)菌抗原的存在。
陰性:只在質(zhì)控線位置出現(xiàn)一條紅色線條,表示樣品中無軍團(tuán)菌抗原的存在。
無效:質(zhì)控線位置無紅線出現(xiàn),表示結(jié)果無效,應(yīng)重試。
本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒靈敏度高,特異性強(qiáng);此外本發(fā)明的試劑盒還具有操作簡單,價格低,儲存和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)。
附圖說明
圖1:軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒試劑條示意圖(1.濾樣紙2.致敏乳膠聚酯膜3.免疫硝酸纖維素膜4.吸水紙5.檢測線6.質(zhì)控線)
具體實施方式
以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式,本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用,本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用,在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實施方式之前,應(yīng)理解,本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實施方案;還應(yīng)當(dāng)理解,本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案,而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍;在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中,除非文中另外明確指出,單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。
當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時,應(yīng)理解,除非本發(fā)明另有說明,每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義,本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外,根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載,還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。
除非另外說明,本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明,具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
實施例1軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒的制備
制備步驟:
方法1:
1.致敏乳膠顆粒的制備:
a.取0.4ml 10%羧基化的聚苯乙烯乳膠放入離心管中,加入1ml pH 6.0含0.01%SDS 20mM的碳酸緩沖液沖洗兩次,14000g/min離心10min,棄上清,獲得羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀。
b.用0.5ml pH 6.0 20mM的磷酸緩沖溶液懸浮上一步獲得的羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀,并加入0.5ml 10%水溶性炭化二亞胺,室溫下攪拌30分鐘,最后用0.8ml 0.01M pH 8.0的硼酸緩沖溶液沖洗三次、離心、棄上清,獲得待標(biāo)記物。
c.向步驟b獲得的待標(biāo)記物中加入1ml 0.2M pH 7.0的硼酸緩沖液制成乳膠懸液,并向該乳 膠懸液中加入2mg抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-1。
d.充分反應(yīng)12小時后,加入50mM pH8.2的Tris-HCl作為終止劑終止反應(yīng),獲得致敏乳膠顆粒。
2.致敏乳膠聚酯膜的制備:
(1)乳膠緩沖液的制備:取800ml純化水,往里加入100ml 1.0M Tris液,準(zhǔn)確稱取3.0g聚乙二醇20000、2.0g牛血清白蛋白,2.0g脫脂牛奶,3.0g酪蛋白溶液,0.5g疊氮化鈉,1.5g果糖,0.4g氯化鉀,2.20g甘氨酸,加入溶液中,充分溶解,混合均勻,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0,加純化水至總體積1000ml。
(2)用上一步的乳膠緩沖液稀釋致敏乳膠顆粒,獲得0.4w/v%的致敏乳膠溶液。
(3)取1.28ml致敏乳膠溶液用點(diǎn)乳膠機(jī)噴點(diǎn)在預(yù)處理后的聚酯膜上,置于37℃的溫度下烘干2小時,密封4-30℃下避光保存,制得致敏乳膠聚酯膜。
3.免疫硝酸纖維素膜的制備:
將2.0mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體和1.5mg/ml抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-2分別噴在硝酸纖維素膜質(zhì)控線和檢測線的位置上,37℃下烘干2小時,密封4-30℃下避光保存,制得免疫硝酸纖維素膜。每50m長硝酸纖維素膜分別包被有6ml的羊抗鼠IgG多克隆抗體和抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-2溶液,檢測線和質(zhì)控線的間距為5mm。
4.將濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在PVC片上,切裁制得試劑條;將試劑條裝入塑料盒制得檢測試劑盒,獲得軍團(tuán)菌乳膠法檢測試劑盒。(如圖1所示)。
方法2:
1.致敏乳膠顆粒的制備:
a.取1ml 6%羧基化的聚苯乙烯乳膠放入離心管中,加入2ml pH 6.0含0.01%SDS20mM的碳酸緩沖液沖洗三次,12000g/min離心10min,棄上清,獲得羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀。
b.用1.5ml pH 6.0 20mM的磷酸緩沖溶液懸浮上一步獲得的羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀,并加入1.5ml 9%水溶性炭化二亞胺,室溫下攪拌20分鐘,最后用3ml 0.01M pH 8.0的硼酸緩沖溶液沖洗三次、離心、棄上清,獲得待標(biāo)記物。
c.向步驟b獲得的待標(biāo)記物中加入2ml pH 7.0 0.2M的硼酸緩沖液制成乳膠懸液,并向 該乳膠懸液中加入2.5mg抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-1。
d.充分反應(yīng)過夜后,加入終止劑終止反應(yīng),獲得致敏乳膠顆粒。
2.致敏乳膠聚酯膜的制備:
(1)乳膠緩沖液的制備:取800ml純化水,往里加入90ml 1.0M Tris液,準(zhǔn)確稱取3.5g聚乙二醇20000、1.8g牛血清白蛋白,1.5g脫脂牛奶,3.0g酪蛋白溶液,0.6g疊氮化鈉1.0g果糖,0.25g氯化鉀,2.00g甘氨酸,加入溶液中,充分溶解,混合均勻,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0,加純化水至總體積1000ml。
(2)用上一步的乳膠緩沖液稀釋致敏乳膠顆粒,獲得0.2w/v%的致敏乳膠溶液。
(3)取1.28ml致敏乳膠溶液用點(diǎn)乳膠機(jī)噴點(diǎn)在預(yù)處理后的聚酯膜上,置于37℃的溫度下烘干2小時,密封4-30℃下避光保存,制得致敏乳膠聚酯膜。
3.免疫硝酸纖維素膜的制備:
將1.5mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體和2.0mg/ml抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-2分別噴在硝酸纖維素膜質(zhì)控線和檢測線的位置上,37℃下烘干2小時,密封4-30℃下避光保存,制得免疫硝酸纖維素膜。每50m長硝酸纖維素膜分別包被有6ml的羊抗鼠IgG多克隆抗體和抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-2溶液,檢測線和質(zhì)控線的間距為5mm。
4.同方法1。
方法3:
1.致敏乳膠顆粒的制備:
a.取0.5ml 12%羧基化的聚苯乙烯乳膠放入離心管中,加入1.5ml pH 6.0含0.01%SDS20mM的碳酸緩沖液沖洗兩次,13000g/min離心10min,棄上清,獲得羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀。
b.用0.5ml pH 6.0 20mM的磷酸緩沖溶液懸浮上一步獲得的羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀,并加入0.5ml 10%水溶性炭化二亞胺,室溫下攪拌25分鐘,最后用1.5ml 0.01M pH8.0的硼酸緩沖溶液沖洗兩次、離心、棄上清,獲得待標(biāo)記物。
c.向步驟b獲得的待標(biāo)記物中加入1.5ml pH 7.0 0.2M的硼酸緩沖液制成乳膠懸液,并向該乳膠懸液中加入3.75mg抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-1。
d.充分反應(yīng)過夜后,加入終止劑終止反應(yīng),獲得致敏乳膠顆粒。
2.致敏乳膠聚酯膜的制備:
(1)乳膠緩沖液的制備:取800ml純化水,往里加入110ml 1.0M Tris液,準(zhǔn)確稱取2.5g聚乙二醇20000、1.9g牛血清白蛋白,2.5g脫脂牛奶,2.8g酪蛋白溶液和0.4g疊氮化鈉2.0g果糖,0.5g氯化鉀,2.25g甘氨酸加入溶液中,充分溶解,混合均勻,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0,加純化水至總體積1000ml。
(2)用上一步的乳膠緩沖液稀釋致敏乳膠顆粒,獲得0.6w/v%的致敏乳膠溶液。
(3)取1.28ml致敏乳膠溶液用點(diǎn)乳膠機(jī)噴點(diǎn)在預(yù)處理后的聚酯膜上,置于37℃的溫度下烘干2小時,密封4-30℃下避光保存,制得致敏乳膠聚酯膜。
3.免疫硝酸纖維素膜的制備:
將1.0mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體和1.0mg/ml抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-2分別噴在硝酸纖維素膜質(zhì)控線和檢測線的位置上,37℃下烘干2小時,密封4-30℃下避光保存,制得免疫硝酸纖維素膜。每50m長硝酸纖維素膜分別包被有6ml的羊抗鼠IgG多克隆抗體和抗軍團(tuán)菌單克隆抗體-2溶液,檢測線和質(zhì)控線的間距為4mm。
4.同方法1。
實施例2對比試劑盒的制備
對比試劑盒的制備方法:乳膠緩沖液中不含果糖、氯化鉀和甘氨酸,其他試劑及實驗方法均同實施例1中方法1~3。
實施例4軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒的特異性實驗
檢測方法:
1.取實施例1制備的軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒和實施例2的對比試劑盒,將試劑盒放置在水平臺面上。
2.待測樣品的制備:按表1的四類實驗對象,準(zhǔn)備一個樣品處理管,豎直放于處理管支架上,并在樣品管里加入0.6ml蒸餾水;以人尿液作為樣品,將等體積尿液倒入樣品管中,充分?jǐn)嚢杈鶆蜃鳛榇郎y樣品。
3.每類實驗對象為100人,檢測結(jié)果如表1:
表1軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒特異性試驗結(jié)果
由上表可知,本發(fā)明的軍團(tuán)菌抗原乳膠法檢測試劑盒對大腸桿菌及痢疾桿菌均無交叉反應(yīng),特異性良好。