本發(fā)明涉及生物檢測領域，特別是涉及一種霍亂弧菌O1膠體金檢測試劑盒及其制備方法和用途。
背景技術：
霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是霍亂的病原體，根據(jù)其O抗原的不同可分為200多個血清群，其中Ol群是引起人類霍亂的主要血清群?；魜y是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。人類是霍亂弧菌的唯一易感者?；魜y弧菌進入消化道到達小腸，在腸粘膜表面吸附并迅速繁殖。產(chǎn)生的霍亂腸毒素作用于小腸粘膜，引起小腸液過度的分泌。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為上吐下瀉，導致脫水和代謝性酸中毒、循環(huán)衰竭，死亡率甚高。屬于國際檢疫傳染病。
霍亂是我國法定的甲類傳染病，國家要求在接診24h內報出檢驗結果。因此，及早鑒定出霍亂弧菌對控制該病的流行和治療有極其重要的意義。目前霍亂弧菌的快速診斷方法如快速制動試驗和免疫熒光菌球試驗等效果不理想，主要因為患者糞便中的霍亂弧菌時多時少，最少時檢查結果呈陰性。
技術實現(xiàn)要素：
鑒于以上所述現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種霍亂弧菌O1膠體金檢測試劑盒及其制備方法和用途，用于解決現(xiàn)有技術中的問題。
為實現(xiàn)上述目的及其他相關目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
本發(fā)明的第一方面，提供一種霍亂弧菌O1膠體金檢測試劑盒，包括試紙卡，所述試紙卡包括底板、及位于底板表面的從加樣端開始依次排列的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述金標墊上包含抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上包被有檢測線和質控線，所述金標墊上的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體采用膠體金標記。
優(yōu)選的，所述金標墊上的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體采用150nm膠體金標記，具有信號受背景干擾小，檢測靈敏度高，結果重復性好的優(yōu)點。
優(yōu)選的，所述底板為PVC底板。
優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜上，檢測線位于離加樣端較近一側，質控線位于離加樣端較遠一側。
優(yōu)選的，所述檢測線上包被有抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體。所述金標墊上的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體與檢測線上的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體可以是相同的抗體，也可以是不同的抗體。
優(yōu)選的，質控線上包被羊抗鼠抗體。
優(yōu)選的，所述樣品墊采用緩沖液處理，所述緩沖液選自PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液和檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為50-100mM。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的金標墊還經(jīng)過預處理，預處理時所使用的預處理緩沖液選自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為10-40mM。
優(yōu)選的，所述緩沖液還包括反應增強劑，所述反應增強劑選自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一種，所述反應增強劑的濃度為10～50g/L。
優(yōu)選的，所述緩沖溶液還包括表面活性劑，所述表面活性劑選自S-19 TWEEN 20、S-20TWEEN 80、S-13 TRITON X-45、S-14 TRITON X-100、S-15 TRITON X305中的任意一種或多種的組合，所述表面活性劑的濃度為20～40g/L。
優(yōu)選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和特異性，本發(fā)明所述的金標墊在預處理時所使用的預處理緩沖液包括下列組分：果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鈉和甘氨酸，且果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鉀和甘氨酸的總濃度為4.5－6.5g/L，緩沖液的pH值為7.3－7.5。
優(yōu)選的，各組分在緩沖液中的濃度為：
果糖1.0-2.0g/L；氫氧化鋁0.25-0.75g/L；葡萄糖1.0-1.5g/L；氯化鈉0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。
所述預處理緩沖液的溶劑為水。
所述預處理的具體步驟為：將金標墊在預處理液中浸泡1.5～2h，取出放于36～38℃烘干。
所述預處理緩沖液可使用本領域各種常用的pH調節(jié)劑進行pH值的調節(jié)。
優(yōu)選的，所述試劑盒還包括卡殼，所述卡殼包括背卡和上蓋，所述背卡設有試紙卡卡槽，所述試紙卡嵌于所述試紙卡卡槽內，所述上蓋設有測試窗和加樣孔，所述測試窗的位置與所述檢測線和質控線的位置相配合，所述加樣孔的位置與所述樣品墊的位置相配合。
更優(yōu)選的，所述卡殼為塑料卡殼。
優(yōu)選的，所述檢測試劑盒用于檢測霍亂弧菌O1。
本發(fā)明所提供的霍亂弧菌O1膠體金檢測試劑盒，可配套免疫定量分析儀器使用。免疫分析儀器通過采集檢測線(T)和質控線(C)條帶熒光信號，計算T/C信號值。使用前先將不同標準品滴加到試紙卡上，分析處理建立定標曲線(T/C信號值與標準品真實值的關系)，再將檢測樣品時獲得的T/C值與標準曲線比較，即可獲得檢測樣品中的霍亂弧菌O1抗原含量。
本發(fā)明第二方面提供所述霍亂弧菌O1膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：
1)用膠體金標記的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體溶液噴涂金標墊，制得包含抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體的金標墊；
2)在硝酸纖維素膜的檢測線和質控線上分別噴涂抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體及羊抗鼠抗體，制得包被后的硝酸纖維素膜；
3)將樣品墊、步驟1)制備金標墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼在底板上，切裁制得檢測試紙卡；最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的金標墊還經(jīng)過預處理，預處理時所使用的預處理緩沖液選自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為10-40mM。
優(yōu)選的，所述緩沖液還包括反應增強劑，所述反應增強劑選自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一種，所述反應增強劑的濃度為10～50g/L。
優(yōu)選的，所述緩沖溶液還包括表面活性劑，所述表面活性劑選自S-19 TWEEN 20、S-20TWEEN 80、S-13 TRITON X-45、S-14 TRITON X-100、S-15 TRITON X305中的任意一種或多種的組合，所述表面活性劑的濃度為20～40g/L。
優(yōu)選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和特異性，本發(fā)明所述的金標墊在預處理時所使用的預處理緩沖液包括下列組分：果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鈉和甘氨酸，且果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鉀和甘氨酸的總濃度為4.5－6.5g/L，緩沖液的pH值為7.3－7.5。
優(yōu)選的，各組分在緩沖液中的濃度為：
果糖1.0-2.0g/L；氫氧化鋁0.25-0.75g/L；葡萄糖1.0-1.5g/L；氯化鈉0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。
所述預處理緩沖液的溶劑為水。
所述預處理的具體步驟為：將金標墊在預處理液中浸泡1.5～2h，取出放于36～38℃烘干。
所述預處理緩沖液可使用本領域各種常用的pH調節(jié)劑進行pH值的調節(jié)。
本發(fā)明第三方面提供所述霍亂弧菌O1膠體金檢測試劑盒在霍亂弧菌O1檢測領域的用 途。
本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明所提供的霍亂弧菌O1膠體金檢測試劑盒首次將霍亂弧菌O1通過膠體金免疫層析技術進行檢測，兼具高靈敏性和高特異性，能夠快速檢測霍亂弧菌O1。此外，所述檢測試劑盒具有操作快速簡便、結果準確、經(jīng)濟適用等優(yōu)點。
具體實施方式
以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復數(shù)形式。
當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據(jù)本技術領域的技術人員對現(xiàn)有技術的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術的任何方法、設備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。
除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術及相關領域的常規(guī)技術。這些技術在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
實施例1本發(fā)明試紙卡的制備
1)使用預處理緩沖液對金標墊進行預處理，預處理緩沖液為：果糖1.5g/L，氫氧化鋁0.5g/L，葡萄糖1.25g/L，氯化鈉0.3g/L，甘氨酸2.0g/L的水溶液，pH＝7.4，預處理的具體步驟為：將金標墊在預處理液中浸泡2h，取出放于37℃烘干；然后用膠體金標記的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體溶液噴涂經(jīng)預處理的金標墊，制得包被抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體的金標墊，溶液中膠體金與抗體的質量比為5:1，溶液的濃度為10mg/ml，噴涂量為4ul/cm；
2)在硝酸纖維素膜的檢測線和質控線上分別噴涂1mg/ml的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體溶液和羊抗鼠抗體溶液，噴涂量為1ul/cm，制得包被后的硝酸纖維素膜；
3)將樣品墊、步驟1)制備金標墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼在PVC底板上，切裁制得寬3-5mm的檢測試紙卡；最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。
實施例2對比試劑盒的制備
對比例試紙卡的制備：采用25mM甘氨酸緩沖液預處理金標墊，其他試劑及實驗方法均同實施例1。
1)采用25mM甘氨酸緩沖液預處理金標墊，然后用膠體金標記的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體溶液噴涂經(jīng)預處理的金標墊，制得包被抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體的金標墊，溶液中膠體金與抗體的質量比為5:1，溶液的濃度為10mg/ml，噴涂量為4ul/cm；
2)在硝酸纖維素膜的檢測線和質控線上分別噴涂1mg/ml的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體溶液和羊抗鼠抗體溶液，噴涂量為1ul/cm，制得包被后的硝酸纖維素膜；
3)將樣品墊、步驟1)制備金標墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼在PVC底板上，切裁制得寬3-5mm的檢測試紙卡；最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。
實施例3檢測試劑盒的特異性實驗
檢測方法：
1.取實施例1制備的本發(fā)明試劑盒和實施例2的對比試劑盒，將試劑盒放置在水平臺面上。 2.待測樣品的制備：按表1的四類實驗對象，用專用取樣棒隨機從檢測者糞便的不同部位取樣，取樣量以沾滿專用取樣棒前端的小圓環(huán)為準；準備一個樣品處理管，豎直放于處理管支架上，并在樣品管里加入0.6ml蒸餾水；將專用取樣棒上取好的樣品插入樣品管中的蒸餾水充分攪拌均勻作為待測樣品。
3.每類實驗對象為100人，檢測結果如表1：
表1檢測試劑盒特異性試驗結果
由上表可知，本發(fā)明的檢測試劑盒對大腸桿菌及痢疾桿菌均無交叉反應，特異性良好。
綜上所述，本發(fā)明所提供的檢測試劑盒具有良好的抗干擾性和特異性，有效克服了現(xiàn)有技術中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。
上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權利要求所涵蓋。