本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及β-catenin表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系。。

背景技術(shù)：
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水通道蛋白(AQPs)屬于小分子疏水性內(nèi)在膜蛋白家族，介導(dǎo)涉及滲透壓梯度的水分子跨膜轉(zhuǎn)運(Verkman 2005)。哺乳動物機體內(nèi)存在13種水通道蛋白(AQP-AQP12)。此類AQPs可分成兩個功能組：傳統(tǒng)的水通道蛋白(AQP 1，2，4，5，8)，只便于水分子轉(zhuǎn)運；甘油水通道蛋白(AQP3，7，9，10)，也可以傳輸不帶電荷的小分子，如甘油，乳酸和尿素(verkman 2005)。

由于AQPs與腫瘤發(fā)展關(guān)系密切，故其研究備受大眾關(guān)注。在肝臟，結(jié)腸，宮頸癌，以及在食管鱗狀細(xì)胞癌中AQP3的表達(dá)量均上調(diào)(Kusayama et al.2011,Hara-Chikuma&Verkman 2008,Guo et al.2013,Shi et al.1971,Li et al.2013)。AQP3的表達(dá)量也與肝細(xì)胞癌預(yù)后不良有關(guān)(Guo et al.2013)。在卵巢癌，宮頸癌和乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的AQP5(Wang et al.2012,Yang et al.2006,Zhang et al.2012,Jung et al.2011)。此外，AQP5已被證實是宮頸癌，肝癌和乳腺癌預(yù)后較差的指標(biāo)(Guo et al.2013,Zhang et al.2012,Shi et al.2012)。相比于正常組織和良性腫瘤，AQP7和AQP9在卵巢上皮癌中的表達(dá)水平均較高(Verkman et al.2008)。

值得注意的是，AQP家族的兩個成員，AQP1和AQP4已確定存在于腦腫瘤(Benga&Huber 2012)。AQP4在乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)量較低(Shi et al.2012,Warth et al.2011)。相反，AQP4在高級別星形細(xì)胞瘤中表達(dá)量較高且呈廣泛分布，其有可能成為腫瘤相關(guān)水腫的治療靶標(biāo)(Saadoun et al.2002b,Warth et al.2007,Warth et al.2005,Warth et al.2004,Sawada et al.2007)。此外，我們以前的研究表明：AQP4與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移相關(guān)，siRNA介導(dǎo)的AQP4表達(dá)下調(diào)可誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡(Ding et al.2011,Ding et al.2013)。最新證據(jù)表明，AQP1在肺，結(jié)腸和乳腺癌中表達(dá)量增加(Hoque et al.2006,Otterbach et al.2010,Yoshida et al.2013)。另外研究顯示，AQP1的表達(dá)與結(jié)腸癌和乳腺癌患者的腫瘤 高級別及較短生存期有關(guān)(Yoshida et al.2013,Otterbach et al.2010)。然而，迄今為止，有關(guān)人腦腫瘤中AQP1表達(dá)情況的報道仍較少。先前基于相對少量患者組織樣本的免疫組化研究表明(由世界衛(wèi)生組織[WHO]定義的各病理分級約五個膠質(zhì)瘤患者病例)，在低級別到高級別的星形細(xì)胞瘤中，AQP1的表達(dá)量存在潛在上調(diào)趨勢(Saadoun et al.2002a,Oshio et al.2005,Deb et al.2012)?；谶@些研究，我們推測AQP1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤分級和膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存期相關(guān)。

最近研究顯示，AQP1在腫瘤生長和血管生成中具有一定的作用。AQP1在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈廣泛表達(dá)，而AQP1缺失可抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，從而延遲腫瘤血管生成，(Saadoun et al.2005,Nicchia et al.2013,Esteva-Font et al.2013,Verkman et al.2008)。最近，AQP1在促進腫瘤細(xì)胞遷移方面的關(guān)鍵性作用也備受關(guān)注。AQP1促進多種腫瘤細(xì)胞系(包括HT20結(jié)腸癌細(xì)胞，B16F10黑色素瘤細(xì)胞和4T1乳腺腫瘤細(xì)胞)的腫瘤細(xì)胞遷移(Jiang 2009,Hu&Verkman 2006)。但是AQP1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移的分子機制尚不清楚。在這方面，Monzani等人提出通過相關(guān)Lin-7/β-catenin的機制，AQP1可提高HMEC-1人微血管內(nèi)皮細(xì)胞及WM115人黑色素瘤細(xì)胞系的遷移能力(Monzani et al.2009)。具體而言，AQP1與Lin-7聯(lián)合免疫沉淀及AQP1的表達(dá)抑制均顯著影響F-肌動蛋白細(xì)胞骨架組織以及LIN-7/β-catenin的表達(dá)。然而目前還沒有相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)得以證實人腫瘤組織中AQP1和β-catenin之間的關(guān)系。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明第一方面提供膠質(zhì)瘤患者中β-catenin的表達(dá)

先前研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的AQP1和β-catenin關(guān)系非常密切。在此基礎(chǔ)上，我們假設(shè)此關(guān)聯(lián)也適用于體內(nèi)研究。先前研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中β-catenin呈過表達(dá)，其高表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)(Liu et al.2011,Rossi et al.2011)。在我們的研究中，β-catenin蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中呈不同強度及不同位置的表達(dá)(圖4D)。與低等級(1級與2級)膠質(zhì)瘤相比，高等級(3級與4級)膠質(zhì)瘤具有大量的胞漿內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)。然而，在標(biāo)本(包括高等級膠質(zhì)瘤)中并沒有觀察到明顯的細(xì)胞核染色，。1級膠質(zhì)瘤及39％二級膠質(zhì)瘤(n＝24)存在β-catenin蛋白高表達(dá)，但55％三級膠質(zhì)瘤(n＝30)和58％GBM(n＝38)存在β-catenin蛋白高表達(dá)。β-catenin蛋白數(shù)值的范圍及其中間值見圖4C。β-catenin蛋白的表達(dá)與組織學(xué)分級密切有關(guān)(rs＝0.188，P＝0.010)，而與其他臨床病理特 征無明顯關(guān)系。

由于提供膠質(zhì)瘤患者中β-catenin的表達(dá)根據(jù)情況不同是有相關(guān)變化的，所以研究膠質(zhì)瘤患者中β-catenin的表達(dá)是有實際應(yīng)用價值。

本發(fā)明第二方面提供神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中β-catenin蛋白表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。

Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，高表達(dá)β-catenin蛋白與OS(P＝0.034，圖5E)和PFS(P＝0.005，圖5F)顯著相關(guān)。高表達(dá)β-catenin蛋白患者總生存率的中值為31個月(95％Cl：置信區(qū)間，0.00-89.77)，而低表達(dá)β-catenin蛋白(綜合評分：0-2)患者總生存率為27個月(95％Cl：置信區(qū)間，19.33-34.67)。高表達(dá)和低表達(dá)患者PFS中值分別為18(95％Cl：置信區(qū)間，12.18-23.82)和22個月(95％Cl：置信區(qū)間，7.65-36.36)。

由于實驗證明提供神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中β-catenin蛋白表達(dá)與預(yù)后之間是有關(guān)系的，所以此發(fā)明有實際應(yīng)用價值。

本發(fā)明第三方面提供神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中AQP1與β-catenin蛋白之間的關(guān)系。

接下來，我們對神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中AQP1和β-catenin蛋白之間的關(guān)系進行研究。AQP1和β-catenin蛋白的增加量與組織學(xué)分級相對應(yīng)。此外，AQP1標(biāo)簽指數(shù)與β-catenin蛋白表達(dá)正相關(guān)(rs＝0.168，P＝0.022)。AQP1高表達(dá)與高等級膠質(zhì)瘤和β-catenin蛋白高表達(dá)顯著相關(guān)。

由于高度惡性腫瘤中AQP1表達(dá)量居高，所以膠質(zhì)瘤細(xì)胞中AQP1與β-catenin蛋白之間的關(guān)系具有實際應(yīng)用價值。

綜上所述，本發(fā)明發(fā)明人證實了β-catenin表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)AQP1與體外細(xì)胞模型及臨床樣品中β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)。通過細(xì)胞模型及臨床樣品檢測，發(fā)現(xiàn)了AQP1與β鏈蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用。具有一定的實際應(yīng)用意義。

附圖說明：

圖1：LN229細(xì)胞系中AQP1的過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖及β-catenin的上調(diào)。同源LN229細(xì)胞系未發(fā)現(xiàn)AQP1表達(dá)。腎組織作為陽性對照(A)。建立穩(wěn)定表達(dá)AQP1的AQP1/LN229細(xì)胞系。AQP1與GFP作為一個重組蛋白表達(dá)(B)。AQP1過 表達(dá)導(dǎo)致β鏈蛋白表達(dá)水平上調(diào)(C)。表達(dá)AQP1的綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒載體或空白載體轉(zhuǎn)染LN229細(xì)胞，結(jié)果顯示AQP1位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(D:×200)。轉(zhuǎn)染AQP1的LN229細(xì)胞系的代表性顯微圖(上圖)和Brdu定量檢測(下圖)(E:×200)。

圖2：AQP1過表達(dá)導(dǎo)致LN229細(xì)胞增殖及侵襲能力增強。MTT檢測結(jié)果顯示AQP1過表達(dá)導(dǎo)致LN229細(xì)胞增殖能力增強(A)。在第7天細(xì)胞增值率明顯升高。(P*<0.05)。軟瓊脂實驗表明AQP/LN229細(xì)胞集落形成能力增強。典型的細(xì)胞集落圖像(B:×200)。基底膜侵襲實驗顯示AQP1過表達(dá)可增加神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性(C:×200)。

圖3：神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中AQP1中表達(dá)。A：基于源于倫勃朗數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)分析數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)AQP1 mRNA表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)包括神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織(n＝454)和非腫瘤組織(n＝24)。B：人神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中AQP1蛋白的Western Blot檢測。神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤中AQP1蛋白條帶大小為28kd。陰性對照包括：N(正常組織)和S(神經(jīng)鞘瘤)

圖4：神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中AQP1和β-catenin的免疫組化。AQP1免疫反應(yīng)性研究(A)。正常腦組織(N)和腫瘤組織(T)中AQP1的表達(dá)情況(40×)(a)。星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤(200×)(b)和少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(200×)(c)中AQP1的表達(dá)情況。二級腫瘤的內(nèi)皮細(xì)胞免疫組化染色觀察AQP1表達(dá)情況(40×)(d)。成膠質(zhì)細(xì)胞瘤內(nèi)增殖的內(nèi)皮細(xì)胞無AQP1表達(dá)(200×)(e)。血管周圍大量AQP1表達(dá)(40×)(f)。腫瘤浸潤區(qū)AQP1表達(dá)(100×)(g)?；钚孕切渭?xì)胞中AQP1表達(dá)(100×)(h)。幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中AQP1顯著表達(dá)(200×)(i)。接近壞死區(qū)域的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)中無AQP1或微弱AQP1表達(dá)(200×)(j)。不同等級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中AQP1(B)及β-catenin(D)免疫組化(I-IV，200×)。不同等級的膠質(zhì)瘤中AQP1(C)(P＝0.017)和β-catenin(E)(P＝0.010)得分示意圖。

圖5：總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的實驗結(jié)果。所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者(AQP1均表達(dá))的總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)(A和B)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者(AQP1均表達(dá))的總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)(C和D)。所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者(β-catenin均表達(dá))的總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)(E和F)。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的免疫組織化學(xué)(IHC)分析，Western blot(免疫印跡法)，細(xì)胞培養(yǎng)，載體構(gòu)建和慢病毒轉(zhuǎn)染，MTT法，軟瓊脂分析法，侵襲檢測，BrdU標(biāo)記檢測法，統(tǒng)計分析及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

在1999至2013年期間，186個神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者被確診。所有患者均在天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤研究醫(yī)院接受手術(shù)。在放療和化療之前，將事先存儲的原發(fā)腫瘤標(biāo)本進行診斷。天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤研究醫(yī)院的倫理委員已審查并批準(zhǔn)了這項研究。在組織收集之前，我們需要得到每個病人的書面知情同意書。所有病例是由兩位經(jīng)驗豐富的病理學(xué)家根據(jù)2007年WHO腫瘤分類的定義準(zhǔn)則來進行審查。135例病患的隨訪信息均可用，隨訪時間直至2013年10月份或直到他們發(fā)展成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤或直至死亡。30-33級患者術(shù)后放療的照射劑量60Gy。術(shù)后化療采用替莫唑胺。

免疫組織化學(xué)(IHC)分析

水通道蛋白和β-catenin的免疫組織化學(xué)使用福爾馬林固定，進行石蠟包埋的組織切片(5μm)。載玻片在65℃下烘烤3h，用二甲苯脫蠟，再溶解于濃度遞減的乙醇中，并用磷酸鹽緩沖鹽水進行清洗。AQP1和β-catenin的抗原修復(fù)通過在高壓鍋中加熱，分別在檸檬鹽酸緩沖液(PH6.0)加熱2分鐘50秒，其次在乙二胺四乙酸(EDTA)中加熱2分鐘15秒。用過氧化氫和正常山羊血清封閉切片，隨后與抗AQP1多克隆抗體(1:500,SC-20810,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)或抗β-catenin的鼠抗人的多克隆抗體(1:150,SC-7963,Santa Cruz Biotechnology)溫育過夜。所有的載玻片均置于3,3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽中3-10分鐘。陰性對照包括用非免疫血清替代初級抗體。

免疫組化結(jié)果由兩位病理學(xué)家來進行評估，而他們對病人的臨床資料并不了解。免疫組化評定結(jié)果基于雙評分系統(tǒng)(染色強度乘以染色區(qū))，得出的數(shù)值總范圍為0-9。染色強度評定如下：0＝?jīng)]有著色，1＝明確，但微弱著色，2＝中度著色，3＝強度著色。染色區(qū)域評定如下：0＝0-25％區(qū)域著色，1＝26-50％區(qū)域著色，2＝51-75％區(qū)域著色，3＝腫瘤細(xì)胞的76-100％區(qū)域著色。高表達(dá)AQP1和β-catenin免疫組化的評分為5-9，蛋白質(zhì)低表達(dá)和中度表達(dá)組評分為1-4，蛋白質(zhì)無表達(dá)組評分為0分。生存分析結(jié)果顯示，患者分為以下幾組：無/低AQP1表達(dá)(綜合得分0-3)，中/高AQP1表達(dá)(綜合得分4-9)，無/低β-catenin表達(dá)(綜合得分0-4)，中/高β-catenin表達(dá)(綜合得分5-9)。

Western blot(免疫印跡法)

在2010至2013年間收集的新鮮凍存神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣品(n＝26，二級：10，Ⅲ級：7，IV級：9)應(yīng)快速冷凍，并在取用之前存儲于-80℃。用于本研究的所有腫瘤組織均是最初樣品。在切除手術(shù)之前，患者未接受放療或化療。大腦標(biāo)本必須來源于兩個腦水腫患者和一個神經(jīng)鞘瘤患者。

簡而言之，使用超聲細(xì)胞破碎機裝置將組織進行粉碎。然后組織和細(xì)胞置于1×SDS裂解緩沖液中，在冰上(62.5mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽,2％十二烷基硫酸鈉,10％甘油)裂解30分鐘。將樣品煮沸10分鐘，然后10000rpm，離心10分鐘，去除上清液。蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，并電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)印膜在一抗作用下4℃孵育過夜(AQP1抗體(1:500)，β-catenin(1:2000)，綠 色熒光蛋白(1:7000，KM8009；SanJian,China)，β-actin(1:5000,SC-47778,Santa Cruz Biotechology)。轉(zhuǎn)移膜在抗兔抗體(Odyssey LiCor,IR800，1:8000)或抗鼠抗體(Odyssey LiCor,IR700，1:8000)作用下室溫孵育50分鐘。用LiCor Odyssey成像系統(tǒng)對轉(zhuǎn)移膜進行分析，并用LiCor Odyssey軟件進行光密度分析。

細(xì)胞培養(yǎng)和試劑

LN229人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系來源美國典型菌種保藏中心(Manassas,VA,USA)，并于RPMI-1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5％CO₂，37℃；培養(yǎng)基中含有10％胎牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/mL的鏈霉素。重組人表皮生長因子(EGF)來源于R&D系統(tǒng)公司(Minneapolis,MN,USA)。細(xì)胞系由天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤研究醫(yī)院檢測。

載體構(gòu)建和慢病毒轉(zhuǎn)染

提取接受乳腺癌根治術(shù)的患者的新鮮正常乳腺體中總RNA。在距離惡性病變2厘米左右獲取鄰近的正常組織。組織用Trizol試劑(Invitrogen公司提供)處理(具體操作按照制造商的說明書)?？俁NA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用選擇性引物對人AQP1基因組進行PCR擴增(基因庫登錄號：NM_198098.2)，F(xiàn)：5′-AATTGAATTCGCCACCATGGCCAGCGAGTTCAAG-3′和R：5′-CGGGATCCCTATTTGGGCTTCATCTC-3′。序列兩側(cè)設(shè)立EcoRI和BamH1位點，用于克隆入慢病毒為基礎(chǔ)的PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體。mGFP也插入慢病毒載體，產(chǎn)生可見報告基團。通過測序分析證實重組產(chǎn)物的正確結(jié)構(gòu)。人胚胎腎293T細(xì)胞接種并在磷酸鈣轉(zhuǎn)染后24h轉(zhuǎn)染，用于生產(chǎn)相關(guān)病毒。轉(zhuǎn)染48h后，收集含有慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液。LN229細(xì)胞(1.5×10⁵/孔)接種于6孔板，并與含聚凝胺(10μg/ml)的慢病毒上清液共同孵育4-5h，孵育條件5％CO2，37℃。在兩天內(nèi)，通過嘌呤(1μg/ml)選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LN229細(xì)胞系。借助Western blot實驗檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中AQP1的表達(dá)水平。

MTT法

細(xì)胞鋪于24孔板中(5×103cell/孔)，并孵育24h。使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)對活性細(xì)胞進行定量檢測。簡而言之，將50μl的MIT存儲液(5mg/ml)加至每個孔中，37℃孵育。孵育4h后，去除 培養(yǎng)基，用二甲基亞砜溶解轉(zhuǎn)換后的染料。采用酶標(biāo)儀(BioTek Epoch)檢測570nm處的光密度值(OD)。增值率由以下公式進行計算：增值率＝每個時間點的OD/第一天的OD。MTT測定法中樣品一式三份，并重復(fù)3次。

軟瓊脂分析法

軟瓊脂測定法可測定單個細(xì)胞在非依賴性生長的體外環(huán)境下長成集落的存活能力。簡而言之，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(AQP1/LN229或載體/LN229)接種于頂層為0.35％瓊脂和底層為0.6％瓊脂的完全培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中(1×10⁴細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)板在37℃下孵育4周，其次用0.005％的結(jié)晶紫染色1h。菌落大于50μm進行評分，使用Olympus顯微鏡(Olympus，Japan)拍照。所有數(shù)據(jù)代表三個獨立的實驗。

侵襲檢測

Boyden chamber侵襲測定法來檢測體外細(xì)胞侵襲力(Corning,NY,USA)。簡而言之，將24孔插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿(8μm孔徑)覆蓋基質(zhì)膠。用胰蛋白酶對細(xì)胞進行消化，并將200μL細(xì)胞懸浮液(5×105細(xì)胞/ml)加入孔中(一式三份)。將培養(yǎng)基(350μL)(RPMI-1640，0.1％牛血清蛋白，25mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸)且含有10ng/ml的表皮細(xì)胞生長因子(EGF)加至較低的孔中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)24h。通過擦拭細(xì)胞膜的上測，去除非侵入細(xì)胞；同時固定并染色侵入細(xì)胞。在五個預(yù)先確定的領(lǐng)域，計數(shù)侵入細(xì)胞，并在顯微鏡下(放大倍數(shù)200倍)進行拍攝。所有測定數(shù)據(jù)由三個獨立的實驗中重復(fù)測定得出。

BrdU標(biāo)記檢測法

細(xì)胞接種于35mm的平底培養(yǎng)皿(1×105細(xì)胞/孔)，并培養(yǎng)72h。用溴脫氧尿苷(BrdU)標(biāo)記試劑(1mg/ml)處理48h，將細(xì)胞用4％多聚甲醛固定30分鐘。在與硼酸鈉中和之前，將細(xì)胞經(jīng)2M鹽酸在37℃條件下處理10分鐘。再與0.2％的Triton-X-100孵育10分鐘后，將細(xì)胞用3％的牛血清蛋白(BSA)在室溫下封閉1h。然后將細(xì)胞與鼠抗BrdU抗體(1:200；ZM0013；ZhongShan,China)在4℃下過夜孵育，隨后用羊抗抗體(Alexa Fluor594綴合二抗)(1:100；ZF-0513；ZhongShan)避光孵育1h。最后，細(xì)胞用49，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(1μg/ml)染色10分鐘。

BrdU-DAPI雙染色的細(xì)胞被認(rèn)為是BrdU陽性細(xì)胞。使用熒光顯微鏡 (TE2000-U,Nikon,Japan，倍率200×)拍攝圖像。所有的實驗都進行了三次。

統(tǒng)計分析

IHC統(tǒng)計分析采用SPSS17.0軟件(IBM,Armonk,New York,USA)。方差分析檢測主要進行組間比較及兩個變量關(guān)聯(lián)性分析，并由斯皮爾曼等級相關(guān)法進行評價?？偵媛?OS)和無進展生存率(PFS)分別采用Kaplan-Meier法估算，對數(shù)秩檢驗應(yīng)用于計算P值。根據(jù)已鑒定的相關(guān)預(yù)后因素來建立Cox比例風(fēng)險模型?；颊呱鏁r間從手術(shù)之日起計算，直至因神經(jīng)膠質(zhì)瘤死亡或神經(jīng)膠質(zhì)瘤全身復(fù)發(fā)為止，以最后隨訪時間或非癌癥相關(guān)死亡的時間作為審查結(jié)點。在所有分析中，P≤0.05則被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Prism3軟件(GraphPad Software)(San Diego，CA，USA)進行細(xì)胞增殖統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用雙尾t檢驗用以測定組間比較值具有重要統(tǒng)計學(xué)意義。

實施例1

膠質(zhì)瘤患者中β-catenin的表達(dá)

先前研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的AQP1和β-catenin關(guān)系非常密切。在此基礎(chǔ)上，我們假設(shè)此關(guān)聯(lián)也適用于體內(nèi)研究。先前研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中β-catenin呈過表達(dá)，其高表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)(Liu et al.2011,Rossi et al.2011)。在我們的研究中，β-catenin蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中呈不同強度及不同位置的表達(dá)(圖4D)。與低等級(1級與2級)膠質(zhì)瘤相比，高等級(3級與4級)膠質(zhì)瘤具有大量的胞漿內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)。然而，在標(biāo)本(包括高等級膠質(zhì)瘤)中并沒有觀察到明顯的細(xì)胞核染色，。1級膠質(zhì)瘤及39％二級膠質(zhì)瘤(n＝24)存在β-catenin蛋白高表達(dá)，但55％三級膠質(zhì)瘤(n＝30)和58％GBM(n＝38)存在β-catenin蛋白高表達(dá)。β-catenin蛋白數(shù)值的范圍及其中間值見圖4C。β-catenin蛋白的表達(dá)與組織學(xué)分級密切有關(guān)(rs＝0.188，P＝0.010)，而與其他臨床病理特征無明顯關(guān)系。

實施例2

神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中β-catenin蛋白表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系

Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，高表達(dá)β-catenin蛋白與OS(P＝0.034，圖5E)和PFS(P＝0.005，圖5F)顯著相關(guān)。高表達(dá)β-catenin蛋白患者總生存率的中值 為31個月(95％Cl：置信區(qū)間，0.00-89.77)，而低表達(dá)β-catenin蛋白(綜合評分：0-2)患者總生存率為27個月(95％Cl：置信區(qū)間，19.33-34.67)。高表達(dá)和低表達(dá)患者PFS中值分別為18(95％Cl：置信區(qū)間，12.18-23.82)和22個月(95％Cl：置信區(qū)間，7.65-36.36)。

實施例3

神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中AQP1與β-catenin蛋白之間的關(guān)系

接下來，我們對神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中AQP1和β-catenin蛋白之間的關(guān)系進行研究。AQP1和β-catenin蛋白的增加量與組織學(xué)分級相對應(yīng)。此外，AQP1標(biāo)簽指數(shù)與β-catenin蛋白表達(dá)正相關(guān)(rs＝0.168，P＝0.022)。AQP1高表達(dá)與高等級膠質(zhì)瘤和β-catenin蛋白高表達(dá)顯著相關(guān)。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。

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