本發(fā)明屬于生物化學(xué)品檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種測(cè)量氨基酸-N-甲酸酐含量和光學(xué)純度的方法。
背景技術(shù)：
：醋酸格拉替雷是一種用于治療多發(fā)性硬化癥的的人工合成多肽混合物(M.M.Mouradain,Pharmacology&Therapeutics,98,245-255,2003)。醋酸格拉替雷(又叫共聚物-1)是一個(gè)由丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸組成的隨機(jī)聚合物。它的氨基酸摩爾比大約是0.392～0.462:0.129～0.153:0.300～0.374:0.086～0.100，平均分子量大約5000～9000道爾頓。醋酸格拉替雷是通過(guò)L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸-γ-芐酯、L-ε-三氟乙?；?賴氨酸，這四種氨基酸的N-甲酸酐(NCA)進(jìn)行隨機(jī)聚合產(chǎn)生的。而這個(gè)聚合反應(yīng)和聚合產(chǎn)物的品質(zhì)對(duì)于加入的氨基酸NCA的品質(zhì)非常敏感。我們發(fā)現(xiàn)如果氨基酸NCA如果不能達(dá)到應(yīng)有規(guī)格，醋酸格拉替雷的平均分子量和氨基酸組成都會(huì)達(dá)不到應(yīng)有的標(biāo)準(zhǔn)。為了使醋酸格拉替雷可以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，氨基酸NCA的標(biāo)準(zhǔn)是含量≥95％，光學(xué)純度≥99.5％。所以，準(zhǔn)確測(cè)量氨基酸NCA含量和光學(xué)純度的方法就尤為重要了。氨基酸NCA是3-取代噁唑啉-2,5-二酮，其性質(zhì)類似于有機(jī)化合物中的內(nèi)酸酐，具體表現(xiàn)為：活性高，遇水不穩(wěn)定，給檢測(cè)造成了難度。而四個(gè)氨基酸NCA，即L-丙氨酸NCA、L-酪氨酸NCA、L-谷氨酸-γ-芐酯NCA、L-ε-三氟乙?；?賴氨酸NCA，又以L-丙氨酸NCA的檢測(cè)難度最大。因?yàn)長(zhǎng)-丙氨酸NCA活性最高，沒(méi)有紫外吸收，沸點(diǎn)低，但是雜質(zhì)沸點(diǎn)高。活性高，造成很難拿到標(biāo)準(zhǔn)品，所以無(wú)法外標(biāo)含量；雜質(zhì)沸點(diǎn)高，造成不能用氣相色譜法檢測(cè)純度；對(duì)水不穩(wěn)定，造成不能用反相高效液相色譜法檢測(cè)；沒(méi)有紫外吸收，造成選用檢測(cè)器方面無(wú)法用紫外檢測(cè)器；沸點(diǎn)低，造成無(wú)法用蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)。核磁的方法可以檢測(cè)氨基酸NCA的純度，但是其數(shù)據(jù)的粗糙性決定了該方法不適用于純度檢測(cè)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明首先涉及一種測(cè)量氨基酸-N-甲酸酐(氨基酸NCA)含量的方法，該方法包括如下步驟，步驟(1)用有機(jī)胺對(duì)氨基酸NCA進(jìn)行衍生，得到化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的酰胺；步驟(2)通過(guò)外標(biāo)法測(cè)定酰胺的含量，推導(dǎo)出NCA的含量。本發(fā)明還涉及一種測(cè)量氨基酸-N-甲酸酐(氨基酸NCA)光學(xué)純度的方法，該方法包括如下步驟，步驟(1)用手性有機(jī)胺對(duì)氨基酸NCA進(jìn)行衍生，得到化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的酰胺；步驟(2)通過(guò)外標(biāo)法測(cè)定酰胺的含量，推導(dǎo)出NCA的光學(xué)純度。所述的衍生用有機(jī)胺為：芐胺、R-alpha-甲基芐胺、S-alpha-甲基芐胺、R-alpha-乙基芐胺、S-alpha-乙基芐胺的一種或多種。所述的衍生實(shí)驗(yàn)參數(shù)為，溶劑選擇：四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二氧六環(huán)、乙酸乙酯、乙酸異 丙酯、二氯甲烷、氯仿；反應(yīng)溫度：室溫，15-30℃，反應(yīng)時(shí)間：0.5～2小時(shí)。附圖說(shuō)明圖1，實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)品2S-2-氨基-N-芐基丙酰胺外標(biāo)曲線圖2，實(shí)施例2標(biāo)準(zhǔn)品(2S-2-氨基-N-(R-1-苯基乙基)丙酰胺三氟乙酸鹽)質(zhì)譜圖與核磁譜圖圖3，實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)品(2S-2-氨基-N-(S-1-苯基乙基)丙酰胺三氟乙酸鹽)質(zhì)譜圖與核磁譜圖圖4，實(shí)施例4標(biāo)準(zhǔn)品(2S-2-氨基-3-(4-羥基苯基)-N-(S-1-苯基乙基)丙酰胺三氟乙酸鹽)質(zhì)譜圖與核磁譜圖圖5，實(shí)施例5標(biāo)準(zhǔn)品(4S-4-氨基-4-(1-S-1-苯基-乙基氨基羰基)-丁酸芐酯三氟乙酸鹽)質(zhì)譜圖與核磁譜圖圖6，實(shí)施例6標(biāo)準(zhǔn)品(2S-2-氨基-6-(2,2,2-三氟乙?；被?-N-(S-苯乙基)己酰胺三氟乙酸鹽)質(zhì)譜圖與核磁譜圖圖7，實(shí)施例7標(biāo)準(zhǔn)品(2S-2-氨基-N-(R-1-苯基丙基)丙酰胺三氟乙酸鹽)質(zhì)譜圖與核磁譜圖圖8，實(shí)施例8標(biāo)準(zhǔn)品(2S-2-氨基-N-(S-1-苯基丙基)丙酰胺三氟乙酸鹽)質(zhì)譜圖與核磁譜圖具體實(shí)施方式實(shí)施例1.L-丙氨酸NCA的芐胺衍生實(shí)驗(yàn)精確稱量大約20mgL-丙氨酸NCA待檢樣品，加入到1mL四氫呋喃中，將所得溶液滴加到裝有2g芐胺和20毫升四氫呋喃的三口瓶中，室溫?cái)嚢?小時(shí)。產(chǎn)物為：2S-2-氨基-N’-芐基丙酰胺。實(shí)施例2.L-丙氨酸NCA的R-alpha-甲基芐胺衍生實(shí)驗(yàn)精確稱量大約20mgL-丙氨酸NCA待檢樣品，加入到1mL乙酸異丙酯中，將所得溶液滴加到裝有2gR-alpha-甲基芐胺和20毫升乙酸異丙酯的三口瓶中，室溫?cái)嚢?小時(shí)。產(chǎn)物為：2S-2-氨基-N’-(R-1-苯基乙基)丙酰胺，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。實(shí)施例3.L-丙氨酸NCA的S-alpha-甲基芐胺衍生實(shí)驗(yàn)精確稱量大約20mgL-丙氨酸NCA待檢樣品，加入到1mL二氯甲烷中，將所得溶液滴加到裝有2gS-alpha-甲基芐胺和20毫升二氯甲烷的三口瓶中，室溫?cái)嚢?小時(shí)。產(chǎn)物為：2S-2-氨基-N’-(S-1-苯基乙基)丙酰胺，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。實(shí)施例4.L-酪氨酸NCA的S-alpha-甲基芐胺衍生實(shí)驗(yàn)精確稱量大約20mgL-酪氨酸NCA待檢樣品，加入到1mL2-甲基四氫呋喃中，將所得溶液滴加到裝有2gS-alpha-甲基芐胺和20毫升2-甲基四氫呋喃的三口瓶中，室溫?cái)嚢?小時(shí)。產(chǎn)物為：2S-2-氨基-3-(4-羥基苯基)-N’-(S-1-苯基乙基)丙酰胺，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4。實(shí)施例5.L-谷氨酸-γ-芐酯NCA的S-alpha-甲基芐胺衍生實(shí)驗(yàn)精確稱量大約20mgL-谷氨酸-γ-芐酯NCA待檢樣品，加入到1mL1,4-二氧六環(huán)中，將所得溶液滴加到裝有2gS-alpha-甲基芐胺和20毫升1,4-二氧六環(huán)的三口瓶中，室溫?cái)嚢?小時(shí)。產(chǎn)物為：4S-4-氨基-4-(1-S-1-苯基-乙基氨基羰基)-丁酸芐酯，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5。實(shí)施例6.L-ε-三氟乙?；?賴氨酸NCA的S-alpha-甲基芐胺衍生實(shí)驗(yàn)精確稱量大約20mgL-ε-三氟乙酰基-賴氨酸NCA待檢樣品，加入到1mL乙酸乙酯中，將所得溶液滴加到裝有2gS-alpha-甲基芐胺和20毫升乙酸乙酯的三口瓶中，室溫?cái)嚢?小時(shí)。產(chǎn)物為：2S-2-氨基-6-(2,2,2-三氟乙?；被?-N’-(S-1-苯乙基)己酰胺，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6。實(shí)施例7.L-丙氨酸NCA的R-alpha-乙基芐胺衍生實(shí)驗(yàn)精確稱量大約20mgL-丙氨酸NCA待檢樣品，加入到1mL二氯甲烷中，將所得溶液滴加到裝有2gR-alpha-乙基芐胺和20毫升二氯甲烷的三口瓶中，室溫?cái)嚢?小時(shí)。產(chǎn)物為：2S-2-氨基-N’-(R-1-苯基丙基)丙酰胺，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7。實(shí)施例8.L-丙氨酸NCA的S-alpha-乙基芐胺衍生實(shí)驗(yàn)精確稱量大約20mgL-丙氨酸NCA待檢樣品，加入到1mL氯仿中，將所得溶液滴加到裝有2gS-alpha-乙基芐胺和20毫升氯仿的三口瓶中，室溫?cái)嚢?小時(shí)。產(chǎn)物為：2S-2-氨基-N’-(S-1-苯基丙基)丙酰胺，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖8。實(shí)施例9.標(biāo)準(zhǔn)品的制備實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)品：2S-2-氨基-N-芐基丙酰胺，CAS號(hào)：1214706-98-5，采購(gòu)自MatrixScientific。標(biāo)準(zhǔn)品一般制備方法三口瓶中加入30克Fmoc-L-Ala-OH、二氯甲烷500毫升、芐胺或取代芐胺15克、HATU30克，二異丙基乙基胺20毫升，室溫下攪拌2小時(shí)。點(diǎn)板確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，加入純化水200毫升。分離有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥后旋干。過(guò)色譜柱提純。將得到的酰胺加入四氫呋喃中溶解，加入5當(dāng)量六氫吡啶，室溫下攪拌24小時(shí)。反應(yīng)完畢后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用液相色譜制備得到標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)施例2標(biāo)準(zhǔn)品：2S-2-氨基-N-(R-1-苯基乙基)丙酰胺三氟乙酸鹽，ESI-MSm/z(M+1)＝193.1；1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.83(d,J＝7.9Hz,1H),8.11(s,3H),7.36–7.30(m,4H),7.27-7.12(m,1H),4.92(p,J＝7.0Hz,1H),3.82(s,3H),1.38(t,J＝6.5Hz,6H).實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)品：2S-2-氨基-N-(S-1-苯基乙基)丙酰胺三氟乙酸鹽，ESI-MSm/z(M+1)＝193.0；1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.84(d,J＝7.8Hz,1H),8.12(s,3H),7.41–7.27(m,4H),7.27–7.19(m,1H),4.94(p,J＝7.1Hz,1H),3.87(s,1H),1.39(d,J＝7.0Hz,3H),1.33(d,J＝7.0Hz,3H).實(shí)施例4標(biāo)準(zhǔn)品：2S-2-氨基-3-(4-羥基苯基)-N-(S-1-苯基乙基)丙酰胺三氟乙酸鹽，ESI-MSm/z(M+1)＝285.2；1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.37(s,1H),8.75(d,J＝7.8Hz,1H),8.15(s,3H),7.35–7.17(m,3H),7.04(d,J＝7.1Hz,2H),6.92(d,J＝8.3Hz,2H),6.64(d,J＝8.3Hz,2H),4.91(p,J＝6.9Hz,1H),3.92(t,J＝6.9Hz,1H),2.86(ddd,J＝29.5,14.0,7.4Hz,2H),1.37(d,J＝7.0Hz,3H).實(shí)施例5標(biāo)準(zhǔn)品：4S-4-氨基-4-(1-S-1-苯基-乙基氨基羰基)-丁酸芐酯三氟乙酸鹽，ESI-MSm/z(M+1)＝341.2；1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.93(d,J＝7.7Hz,1H),8.16(s,3H),7.45–7.16(m,10H),5.08(s,2H),4.94(p,J＝6.9Hz,1H),3.83(s,1H),2.41–2.16(m,2H),2.08–1.88(m,2H),1.39(d,J＝7.0Hz,3H).實(shí)施例6標(biāo)準(zhǔn)品：2S-2-氨基-6-(2,2,2-三氟乙?；被?-N-(S-苯乙基)己酰胺三氟乙酸鹽，ESI-MSm/z(M+1)＝346.3；1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.39(s,1H),8.87(d,J＝7.7Hz,1H),8.09(s,3H),7.50–7.03(m,5H),4.95(p,J＝6.9Hz,1H),3.75(dd,J＝13.0,8.3Hz,1H),3.09(dd,J＝13.3,6.6Hz,2H),1.68(dd,J＝14.6,7.4Hz,2H),1.54–1.34(m,4H),1.32–1.05(m,3H).實(shí)施例7標(biāo)準(zhǔn)品：2S-2-氨基-N-(R-1-苯基丙基)丙酰胺三氟乙酸鹽，ESI-MSm/z(M+1)＝207.2；1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.76(d,J＝8.5Hz,1H),8.08(s,3H),7.38–7.16(m,5H),4.72(dd,J＝15.0,8.3Hz,1H),3.85(s,1H),1.80–1.61(m,2H),1.41(d,J＝7.0Hz,3H),0.85(t,J＝7.3Hz,3H).實(shí)施例8標(biāo)準(zhǔn)品：2S-2-氨基-N-(S-1-苯基丙基)丙酰胺三氟乙酸鹽，ESI-MSm/z(M+1)＝207.0；1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.74(d,J＝8.0Hz,1H),8.07(s,3H),7.38–7.18(m,5H),4.70(q,J＝7.5Hz,1H),3.90(s,1H),1.71(p,J＝7.3Hz,2H),1.31(d,J＝7.0Hz,3H),0.86(t,J＝7.3Hz,3H)。實(shí)施例10.樣品檢測(cè)外標(biāo)定量溶液配制：取對(duì)照品2S-2-氨基-N-(R-1-苯基乙基)丙酰胺58.96mg，加入乙酸異丙酯溶解，并定容至20ml，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液A。50％對(duì)照溶液：精密移取對(duì)照儲(chǔ)備液1.25ml，置5ml量瓶中，加乙酸異丙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。80％對(duì)照溶液：精密移取對(duì)照儲(chǔ)備液2.0ml，置5ml量瓶中，加乙酸異丙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。100％對(duì)照溶液：精密移取對(duì)照儲(chǔ)備液2.5ml，置5ml量瓶中，加乙酸異丙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。120％對(duì)照溶液：精密移取對(duì)照儲(chǔ)備液3.0ml，置5ml量瓶中，加乙酸異丙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。150％對(duì)照溶液：精密移取對(duì)照儲(chǔ)備液3.75ml，置5ml量瓶中，加乙酸異丙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。樣品溶液配制：按實(shí)施例2方法，取L-丙氨酸NCA20mg，精密稱定，加入到1mL乙酸異丙酯中，將所得溶液滴加到裝有2gR-alpha-甲基芐胺和20毫升乙酸異丙酯的三口瓶中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，即得。取上述對(duì)照溶液和實(shí)施例2樣品溶液按以下色譜條件進(jìn)樣分析色譜柱Kromasil100-5C18250×4.6mm檢測(cè)器：UV,280nm流動(dòng)相：乙腈：水＝30:70流速：1.0ml/min柱溫：30℃進(jìn)樣量：10ul對(duì)照檢測(cè)結(jié)果及外標(biāo)校正曲線制備如下表，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1樣品溶液檢測(cè)結(jié)果L-丙氨酸NCAmg樣品溶液峰面積濃度mg/ml含量20.1210485851.591699.5％外標(biāo)定位溶液配制取對(duì)照品2R-2-氨基-N-(R-1-苯基乙基)丙酰胺58.88mg，加入乙酸異丙酯溶解，并定容至20ml，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液B。對(duì)照溶液：取對(duì)照儲(chǔ)備液A2.5ml，對(duì)照儲(chǔ)備液B0.25ml，置于5ml容量瓶中，加乙酸異丙酯稀釋至刻度，混合均勻，即得。取上述對(duì)照溶液和實(shí)施例2樣品溶液按以下色譜條件進(jìn)樣分析色譜柱Kromasil100-5C18250×4.6mm檢測(cè)器：UV,280nm流動(dòng)相：乙腈：水＝30:70流速：1.0ml/min柱溫：30℃進(jìn)樣量：10ul利用對(duì)照溶液中不同光學(xué)手性對(duì)照品的不同出峰位置，對(duì)樣品溶液中L型及D型產(chǎn)物進(jìn)行色譜定位。從而推算出實(shí)施例2中L-丙氨酸NCA的光學(xué)純度為99.8％。將實(shí)施例1-8中得到的反應(yīng)液，通過(guò)上述外標(biāo)定量及外標(biāo)定位方法，直接進(jìn)行樣品檢測(cè)。實(shí)施例1-8中氨基酸NCA含量及光學(xué)純度檢測(cè)結(jié)果：氨基酸NCA批號(hào)含量檢測(cè)結(jié)果光學(xué)純度結(jié)果L-丙氨酸NCA實(shí)施例196.1％無(wú)法檢測(cè)L-丙氨酸NCA實(shí)施例299.5％99.8％L-丙氨酸NCA實(shí)施例3101.2％100.0％L-酪氨酸NCA實(shí)施例4100.3％99.8％L-谷氨酸-γ-芐酯NCA實(shí)施例595.8％100.0％L-ε-三氟乙?；?賴氨酸NCA實(shí)施例695.4％100.0％L-丙氨酸NCA實(shí)施例795.9％100.0％L-丙氨酸NCA實(shí)施例895.4％99.8％最后需要說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，并不用作的本發(fā)明保護(hù)范圍的具體限定。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3