本發(fā)明涉及獸藥殘留的免疫化學(xué)速測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種檢測甲基睪酮?dú)埩舻哪z體金試紙條，借助膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析反應(yīng)，快速檢測甲基睪酮?dú)埩簟?/p>

技術(shù)背景

甲基睪酮(17α-Mehthyltestosterone，MT)是一種人工合成的固醇類藥物，又叫做甲基睪丸酮、甲基睪丸素和甲睪酮，屬于蛋白同化激素。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，它作為一種性激素既能促進(jìn)器官成熟與第二特征的發(fā)育，又有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的同化作用，使肌肉增長、體重增加，被作為水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中的一種性激素和強(qiáng)壯劑添加到飼料中。由于甲基睪酮代謝時(shí)間長，通過食物鏈被人體攝入，擾亂人體激素平衡，導(dǎo)致孕婦有女胎男性化和新生兒畸形，影響兒童的正常生長發(fā)育，且具有致癌、致畸、致突變的作用。歐盟95/22/EC中規(guī)定在養(yǎng)殖中禁止使用甲基睪酮等性激素類獸藥，我國也在2003年發(fā)布的公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定甲基睪酮為禁止使用獸藥，在動物源性組織中不得檢出。

目前檢測食品中甲基睪酮的殘留量主要采用氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等。儀器分析方法雖然靈敏、準(zhǔn)確、分離度高，并且可進(jìn)行多殘留檢測的定性、定量研究，但是需要昂貴的儀器、繁瑣的前處理、熟練的專業(yè)操作員，難以滿足現(xiàn)代檢測快速、簡捷、現(xiàn)場化的要求，不適于大規(guī)模樣本篩查。

膠體金免疫層析法是在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)，該方法將反應(yīng)所需要的原料全部或大部分均已整合到試劑中，反應(yīng)通常只需數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘，檢測結(jié)果以肉眼可見的顯色條帶來判讀。此法具有簡便快速、操作簡單、特異性強(qiáng)、不需要額外設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的檢測甲基睪酮的方法存在的對設(shè)備依賴性高、不能夠?qū)崿F(xiàn)對大批量樣品的快速檢測的缺點(diǎn)，提供一種操作簡單、靈敏度高、檢測速度快、成本低、不受檢測設(shè)備限制的試紙條，以實(shí)現(xiàn)對大批量的甲基睪酮樣品進(jìn)行快速檢測和現(xiàn)場監(jiān)控。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種檢測甲基睪酮?dú)埩舻哪z體金試紙條，包括樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊和背襯，所述反應(yīng)膜上具有包被甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線，所述結(jié)合物釋放墊包被甲基睪酮單 克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。

本發(fā)明將甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物固化于反應(yīng)膜檢測線內(nèi)，并用膠體金標(biāo)記甲基睪酮單克隆抗體，通過待測樣品中的甲基睪酮和包被在反應(yīng)膜上的甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物共同競爭甲基睪酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，根據(jù)檢測線顏色深淺或有無紅色條帶來判斷樣品液中是否含有甲基睪酮?dú)埩?。檢測時(shí)，樣品滴入試紙卡孔內(nèi)，當(dāng)甲基睪酮在樣品中濃度低于1.0mg/kg時(shí)，膠體金抗體在層析過程中會被固定在反應(yīng)膜上的甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，在檢測線(T)和質(zhì)控線(C)處各出現(xiàn)一條紅色條帶，且T線顯色比C線顯色深或與C線顯色一致。如果甲基睪酮在樣品中濃度高于1.0mg/kg時(shí)，膠體金抗體與樣品中的甲基睪酮全部結(jié)合，從而在T線內(nèi)因?yàn)楦偁幏磻?yīng)不與甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶或比C線顯色淺。如圖2所示。

陰性：當(dāng)(C)線顯示出紅色條帶，(T)線同時(shí)顯示出紅色條帶，且(T)線顏色接近或深于(C)線時(shí)，判為陰性，表示甲基睪酮含量小于1.0mg/kg，用“-”表示。

陽性：當(dāng)(C)線顯示出紅色條帶，而(T)線不顯色或(T)線顏色淺于(C)線時(shí)，判為陽性，表示甲基睪酮含量超過1.0mg/kg，用“+”表示。

無效：當(dāng)(C)線不顯示出紅色條帶，則無論(T)線顯示出紅色條帶與否，該試紙條均判為無效。

本發(fā)明還提供了制備上述試紙條的方法，其包括步驟：

1)制備包被甲基睪酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊；

2)制備具有包被甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線的反應(yīng)膜；

3)將1)和2)制備好的結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊和背襯組裝成試紙條。

具體地說，其步驟包括：

1)將甲基睪酮與氨基丙酸反應(yīng)，制備甲基睪酮半抗原；

2)將甲基睪酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；

3)用甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞通過融合、篩選，得到分泌甲基睪酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；

4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；

5)將甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成檢測線，并將羊抗鼠抗抗體包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控線，用含0.5％脫脂奶粉的封閉液進(jìn)行封閉；

6)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；

7)將制備的甲基睪酮單克隆抗體加入到制備的膠體金中，得到甲基睪酮單克隆抗體-膠 體金標(biāo)記物；

8)將結(jié)合物釋放墊用含0.1％～0.5％酪蛋白的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀混合緩沖液浸泡30s，37℃烘2h，然后將甲基睪酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物包被在結(jié)合物釋放墊上；

9)將樣品吸收墊用含0.1％～0.5％牛血清白蛋白、0.5％～1％吐溫-80的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀混合緩沖液浸泡2h，37℃烘2h；

10)在背襯上按順序粘貼上樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊，結(jié)合物釋放墊從起始端有1/3區(qū)域被樣品吸收墊覆蓋。最后切成3mm寬的小條，加塑料盒，真空包裝。結(jié)合物釋放墊的1/3被樣品吸收墊覆蓋可以延長檢測結(jié)果觀察時(shí)間，可使樣品吸收墊將檢測液體充分吸收并與金標(biāo)抗體充分反應(yīng)，從而減少誤差。

本發(fā)明的試紙條具有靈敏度高、操作簡單、檢測時(shí)間短、儲存簡單、保質(zhì)期長成本低等優(yōu)點(diǎn)，能夠現(xiàn)場監(jiān)控，適合大量樣本篩查。

附圖說明

圖1為試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖，圖中：1、樣品吸收墊；2、結(jié)合物釋放墊；3、反應(yīng)膜；4、吸水墊；5、檢測線；6、質(zhì)控線；7、背襯；

圖2為試紙條檢測結(jié)果判定圖；

圖3為甲基睪酮半抗原合成圖；

圖4為甲基睪酮半抗原核磁共振氫譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)可能會對本發(fā)明進(jìn)行各種改動或修飾，這些改動或修飾同樣應(yīng)落入發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1檢測甲基睪酮?dú)埩舻哪z體金試紙條的制備

該試紙條的制備方法主要包括以下步驟：

1)制備包被甲基睪酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊；

2)制備具有包被甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線的反應(yīng)膜；

3)將1)和2)制備好的結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊和背襯組裝成試紙條。

下面分步詳細(xì)敘述：

1、甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定

(1)甲基睪酮半抗原的制備

取0.5g甲基睪酮加20mL乙醇溶解，加0.27g碳酸鉀，攪拌；取0.33g氨基丙酸加3mL蒸餾水溶解，加入到甲基睪酮的乙醇溶液中，60℃反應(yīng)4h。停止反應(yīng)，檢測，原料基本無剩余。旋蒸蒸干，加水，調(diào)節(jié)pH值到6，加乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥蒸干，得到淺黃色油狀物，加二氯甲烷/石油醚(1∶3)重結(jié)晶，即得到半抗原產(chǎn)物，合成路線見圖3。

取上述半抗原經(jīng)核磁共振氫譜鑒定，結(jié)果見圖4。¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ：11.0(s，1H，COOH)，5.62(s，1H，-CH＝)，3.65(s，1H，-OH)，2.33(t，2H，-CH₂-)，1.9-2.01(m，2H，-CH₂-)，1.28-1.75(m，12H，-CH₂-)，1.76(t，2H，-CH₂-)，1.30(s，3H，-CH₃)，1.04(s，3H，-CH₃)。圖譜中化學(xué)位移δ＝11的為羧基氫的共振吸收峰，δ＝2.33、1.76的為間隔臂上亞甲基的氫的共振吸收峰，除原料特有的吸收峰外，這些特征氫的吸收峰的存在證明間隔臂偶聯(lián)成功，甲基睪酮半抗原產(chǎn)物正確。

(2)甲基睪酮半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的合成

取20mg半抗原，溶解于1mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中；取30mg碳化二亞胺(EDC)和30mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)用0.2mL蒸餾水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；稱取牛血清白蛋白(BSA)50mg，使之充分溶解在3.8mL PB緩沖液中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)甲基睪酮半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物的合成

制備方法同(2)，將BSA換為卵清蛋白(OVA)。

(4)甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定

將載體蛋白、甲基睪酮半抗原、甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物分別用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，用0.01mol/L pH9的PBS調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在波長200-800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、甲基睪酮半抗原、甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明甲基睪酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。

2、甲基睪酮單克隆抗體的制備

(1)動物免疫

將甲基睪酮半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物(免疫原)注入Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150μg/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體。

(2)細(xì)胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，得到并建立穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

(3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇

取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1×10⁶個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。

(4)單克隆抗體的制備與純化

采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油，劑量為0.4mL/只，7～14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7～10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，純度經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，小瓶分裝，-20℃保存。

3、羊抗鼠抗抗體的制備

以山羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。

4、甲基睪酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備

(1)膠體金的制備

用雙蒸去離子水將1％的氯金酸溶液稀釋成0.01％，取100mL置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入1.5mL 1％的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的酒紅色時(shí)停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4℃保存。制備良好的膠體金用肉眼觀察是清亮透明的，沒有混濁，液體表面無漂浮物，在日光下觀察膠體金的顏色為酒紅色。

(2)甲基睪酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備

在磁力攪拌下，用0.2mol/L碳酸鉀溶液調(diào)膠體金的pH至7.2(不同抗體的pH標(biāo)記范圍在7～8之間，可以變化)，按每毫升膠體金溶液中加入20～50μg抗體的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述甲基睪酮單克隆抗體，攪拌混勻，室溫靜置10min，加入10％BSA使其在膠體金溶液中的終濃度為1％，靜置10min。12000r/min，4℃離心40min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

復(fù)溶緩沖液：含BSA 0.1％～0.3％、吐溫-80 0.05％～0.2％、pH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。

5、結(jié)合物釋放墊的制備

將結(jié)合物釋放墊用含0.1％～0.5％酪蛋白的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀混合緩沖液浸泡30s，37℃烘2h備用。用Isoflow噴膜儀將制備好的甲基睪酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物均勻包被在結(jié)合物釋放墊上，每1cm結(jié)合物釋放墊包被0.01mL甲基睪酮單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，置于37℃環(huán)境中(濕度＜20％)60min后取出，置于干燥環(huán)境(濕度＜20％)中保存?zhèn)溆谩?/p>

6、反應(yīng)膜的制備

將甲基睪酮半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成檢測線，并將羊抗鼠抗抗體包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控線，再用含0.5％脫脂奶粉的封閉液進(jìn)行封閉。

包被過程：用磷酸緩沖液將甲基睪酮半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到1mg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線(T)，包被量為1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠抗抗體稀釋到200μg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線(C)，包被量為1.0μL/cm。將包被好的反應(yīng)膜置于37℃條件下干燥2h，備用。

7、樣品吸收墊的制備

將樣品吸收墊用含0.1％～0.5％牛血清白蛋白、0.5％～1％吐溫-80的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀混合緩沖液浸泡2h，37℃烘2h備用。

8、試紙條的組裝

將樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊依次按順序粘貼在PVC背襯上；結(jié)合物釋放墊從起始端有1/3區(qū)域被樣品吸收墊覆蓋，結(jié)合物釋放墊的末端與反應(yīng)膜的始端連接，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與PVC背襯的始端對齊，吸水墊的末端與PVC背襯的末端對齊；所述反應(yīng)膜上有檢測線和質(zhì)控線，檢測線(T)和質(zhì)控線(C)均呈與所述試紙條的長相垂直的條狀帶；檢測線位于靠近結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)；質(zhì)控線位于遠(yuǎn)離結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)；將試紙條用機(jī)器切成3mm寬的小條，裝在特制的塑料制卡中，真空包裝，4～30℃條件下可保存12個(gè)月。

實(shí)施例2樣品中甲基睪酮?dú)埩舻臋z測

1、樣品前處理

取已去脂肪的動物組織樣本于均質(zhì)器中均質(zhì)1min(10000r/min)，或用剪刀剪碎；稱取2.0±0.05g均質(zhì)好的組織樣本至10mL聚苯乙烯離心管中，加入1mL樣本提取液，震蕩搖勻；再加入1mL樣本稀釋液，震蕩搖勻，吸取上清液進(jìn)行檢測。

2、用試紙條進(jìn)行檢測

用滴管向試紙卡孔內(nèi)滴加2～3滴樣本，5～10min后觀察結(jié)果。超過10min，則樣本檢測判讀結(jié)果無效。

3、分析檢測結(jié)果

陰性：當(dāng)(C)線顯示出紅色條帶，(T)線同時(shí)顯示出紅色條帶，且(T)線顏色接近或深于(C)線時(shí)，判為陰性，用“-”表示，如圖2a、2b所示。

陽性：當(dāng)(C)線顯示出紅色條帶，而(T)線不顯色或(T)線顏色淺于(C)線時(shí)，判為陽性，用“+”表示，如圖2c、2d所示。

無效：當(dāng)(C)線不顯示出紅色條帶，則無論(T)線顯示出紅色條帶與否，該試紙條均判為無效，如圖2e、2f所示。

實(shí)施例3樣品檢測實(shí)例

1、檢測限試驗(yàn)

取空白豬肉、雞肉、魚肉、蝦肉樣品，在其中分別添加甲基睪酮至終濃度為0.5、1.0、2.0mg/kg，取試紙條進(jìn)行檢測，每個(gè)樣本重復(fù)測定三次。

用試紙條檢測豬肉、雞肉、魚肉、蝦肉樣品時(shí)，當(dāng)其中甲基睪酮添加濃度為0.5mg/kg時(shí)，試紙條上顯示出T線顯色比C線顯色深或與C線顯色一致，呈陰性；當(dāng)其中甲基睪酮添加濃度為1.0、2.0mg/kg時(shí)，試紙條上顯示出T線顯色比C線顯色淺或T線不顯色，呈陽性，表明本試紙條對豬肉、雞肉、魚肉、蝦肉等組織樣品中甲基睪酮的檢測限為1.0mg/kg。

2、假陽性率、假陰性率試驗(yàn)

取已知甲基睪酮含量大于1.0mg/kg的陽性豬肉、雞肉、魚肉、蝦肉樣品各20份和含量小于1.0mg/kg的陰性豬肉、雞肉、魚肉、蝦肉樣品各20份，用三批試紙條進(jìn)行檢測，計(jì)算其陰陽性率。

結(jié)果表明：用3個(gè)批次生產(chǎn)的試紙條檢測陽性樣品時(shí)，結(jié)果全為陽性，可知陽性樣品符合率為100％，假陰性率為0；檢測陰性樣品時(shí)，結(jié)果全為陰性，可知陰性樣品符合率為100％，假陽性率為0。說明本發(fā)明的試紙條完全可以作為常規(guī)方法用于市場上對豬肉、雞肉、魚肉、蝦肉等組織樣品中甲基睪酮?dú)埩舻目焖贆z測。

3、特異性試驗(yàn)

將甲地孕酮、酯酸甲羥孕酮、甲羥孕酮、替米考星、磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、泰樂菌素等藥物用pH7.2、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至1000μg/L，用甲基睪酮試紙條進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，用該試紙條檢測1000μg/L甲地孕酮、酯酸甲羥孕酮、甲羥孕酮、替米考星、磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、泰樂菌素時(shí)，試紙條T線顯色比C線顯色深或與C線顯色一致，呈陰性。說明本試紙條對甲地孕酮、酯酸甲羥孕酮、甲羥孕酮、替米考星、磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、泰樂菌素?zé)o交叉反應(yīng)。